羰基还原酶

摘要： 通过蛋白质理性设计和定点突变技术,在近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶wtCpCR的基础上,构建5个突变体酶A98N、S307N、G262N、S216N和S258N,考察了有机溶剂、温度、剪切力、氧气、辅酶NADPH浓度对突变体酶的稳定性影响。研究表明,A98 N在磷酸盐(potassium phosphate,PB)缓冲溶液中比酶活力提高10%,而S307 N没有酶活力,其他3个突变体比酶活力均有降低;A98 N和G262 N在PB/甲基叔丁基醚的双相体系中界面稳定性比原始酶wtCpCR分别提高1.7和1.4倍;4个突变体酶的耐热特性略有下降,T_(50)值介于31~36°C;在100、200 r/min条件下,4个突变体耐剪切力均增强,在300 r/min条件下G262 N突变酶的耐剪切稳定性比wtCpCR增强1.3倍;G262 N突变酶在有氧条件下的稳定性更好,比野生酶提高1.4倍,半衰期(t_(1/2))达到11.87 h;辅酶浓度为0~0.4 mmol/L时,G262 N突变酶更加稳定。该研究为该羰基还原酶wtCpCR的多点突变进一步改善酶稳定性提供重要的科学依据,同时可提高该酶在双相体系生物催化工艺的经济性。

摘要： (13R,17S)乙基仲醇是合成甾体类避孕药物左炔诺孕酮的手性中间体,可利用Cyberlindnera saturnus ZJPH1807菌株催化乙基二酮不对称还原制备(13R,17S)乙基仲醇。为进一步提高该菌株的羰基还原酶活力,采用单因素实验和响应面优化法对其发酵培养基中碳源、氮源及无机盐等主要成分和添加量进行优化,得到最优培养基组成(g/L):葡萄糖34.36、酵母膏14.89、NH4Cl30.34、KH2PO41.01。采用优化后的发酵培养基,菌体比酶活达0.27 U/g(以1 g细胞计),生物量为6.13 g/L,分别比优化前提高了233.33%和20.39%,为高效合成左炔诺孕酮提供了基础。

摘要： 手性醇是重要的医药中间体与精细化工品,立体选择性羰基还原酶催化制备手性醇具有重要的研究与应用价值,受到国内外科学家和工程师的高度关注.本文主要围绕羰基还原酶的发现与分类、催化羰基还原反应的活性与立体选择性机制、酶的筛选挖掘与分子改造技术、辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)的再生方法、羰基还原酶催化合成手性醇医药中间体与精细化学品技术开发与应用等方面展开综述.重点阐述了羰基还原酶催化制备降血脂、抗细菌或病毒感染、抗肿瘤、抗抑郁症、抗癫痫等重要疾病治疗药物中间体及脂肪族、芳香族手性醇精细化工品的国内外技术进展与应用,为高效能立体选择性生物催化剂的创制和手性化合物的生物合成提供理论借鉴和成功范例.

摘要： (13R,17S)-乙基仲醇是合成甾体类避孕药物左炔诺孕酮的手性中间体,可利用Cyberlindnera saturnus ZJPH1807菌株催化乙基二酮不对称还原制备(13R,17S)-乙基仲醇.为进一步提高该菌株的羰基还原酶活力,采用单因素实验和响应面优化法对其发酵培养基中碳源、氮源及无机盐等主要成分和添加量进行优化,得到最优培养基组成(g/L):葡萄糖34.36、酵母膏14.89、NH4Cl 30.34、KH2PO4 1.01.采用优化后的发酵培养基,菌体比酶活达0.27 U/g(以1 g细胞计),生物量为6.13 g/L,分别比优化前提高了 233.33％和20.39％,为高效合成左炔诺孕酮提供了基础.

摘要： 以具有高选择性的羰基还原酶(CR2)与可实现辅酶原位循环的葡萄糖脱氢酶(GDH)通过柔性连接肽得到的融合酶CR2-GDH为生物催化剂,催化N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)不对称还原合成手性药物度洛西汀重要中间体(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺((S)-DHTP)。通过过程调控反应体系的pH,并进一步优化反应转速、底物同辅底物比例、温度及底物浓度,确定单批次反应条件:底物20 g/L、葡萄糖40 g/L、NADP^(+)0.1 mmol/L及酶活7 U,恒定pH 8.4、45°C、150 r/min反应12 h,产物产率达到97.70%,对映体过量值(e.e.)≥99.9%。通过分批补料催化30 g/L底物的反应,产率达92.96%,进一步利用反应器放大体系至100 mL,实现40 g/L底物的转化反应,产率达到85.05%。

摘要： 以具有高选择性的羰基还原酶(CR2)与可实现辅酶原位循环的葡萄糖脱氢酶(GDH)通过柔性连接肽得到的融合酶CR2-GDH为生物催化剂,催化N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)不对称还原合成手性药物度洛西汀重要中间体(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺((S)-DHTP).通过过程调控反应体系的pH,并进一步优化反应转速、底物同辅底物比例、温度及底物浓度,确定单批次反应条件:底物20g/L、葡萄糖40 g/L、NADP+0.1 mmol/L及酶活7 U,恒定 pH 8.4、45°C、150 r/min 反应 12 h,产物产率达到97.70％,对映体过量值(e.e.)≥99.9％.通过分批补料催化30 g/L底物的反应,产率达92.96％,进一步利用反应器放大体系至100 mL,实现40 g/L底物的转化反应,产率达到85.05％.

摘要： 目的 优化cenobamate的合成工艺.方法 以邻氯苯乙酮为起始原料,经α-溴代、缩合、羰基还原酶还原得到手性醇中间体,再与氯磺酰异氰酸酯加成、水解得到cenobamate.结果 与结论 目标产物的结构经1H-NMR、13C-NMR和ESI-MS谱确证,总收率为38％(以邻氯苯乙酮计),纯度大于99.9％(HPLC法),ee值达99.54％.该方法具有高立体选择性、绿色环保等优点,为工业化生产cenobamate提供了一条化学-酶法工艺路线.

摘要： (R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是合成血管紧张素转换酶抑制剂类降压药的关键手性中间体.筛选了 1株具有不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯活性的野生菌DY99,经鉴定此菌为Kazachstania naganishii.从该菌基因组序列中挖掘并克隆了发挥催化活性的羰基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coli-pET28-kncr,对其诱导表达条件和催化反应条件进行了优化,并在最适条件下进行了催化反应.结果发现:在最优条件(当OD600达到0.8时,添加乳糖6 g/L,在28°C、150 r/min诱导12 h)下,重组菌酶活达到330.61 U/L发酵液.确定了全细胞催化不对称还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的最适反应条件为30°C,pH7.5,底物、葡萄糖、细胞生物量分别为15、15和20 g/L(以干质量计),在最适反应条件下,产物累积量、时空产率分别为11.2 g/L和26.88 g/(L-h),产物的对映体过量值(e.e.)＞99％,显示了良好的应用前景.

摘要： 近日,江苏省政府发布《关于2019年度江苏省科学技术奖励的决定》(苏政发〔2020〕22号),中国药科大学孔令义教授团队的成果“中药和天然药物活性物质的发现与研究”喜获江苏省科学技术一等奖;陈依军教授团队的成果“双羰基还原酶的发现、催化机制及药物生物合成应用”喜获江苏省科学技术二等奖;郝海平教授喜获江苏省青年科技杰出贡献奖。以上3位获奖者均为我刊编委。

摘要： 羰基还原酶(Carbonyl reductase,EC1.1.1.x)能够催化羰基的不对称还原生成相应的手性醇.基于辅酶循环能力的不同,主要分为NADH-依赖型和NADPH-依赖型两类.由于羰基还原酶往往具有广泛的底物谱,高活性,高度的立体选择性,良好的稳定性等优点,己被广泛应用于手性醇的工业生产.很多手性醇都可以作为医药或农药等高值化学品的中间体.

摘要： 通过对近平滑假丝酵母(R)-专一性羰基还原酶(rCR)进行氨基酸序列分析,根据其保守性利用PCR技术得到目的基因rcr.该基因全长1011bp,共编码336个氨基酸.通过构建重组质粒pETRCR,使目的基因在Escherichia coli BL21(DE3)中表达.研究发现,在重组菌培养过程中不添加IPTG诱导培养更有利于该基因的表达.利用HisTrap亲和层析纯化得到了目的重组酶,该酶在pH 6.0以及45°C的条件下分别表现出较高的酶活.在底物选择性方面,该重组酶催化还原乙醛的活性很高,而对于酮类化合物,其对中链长度的底物专一性较强.通过考察金属离子对酶活的影响,发现该重组酶是一种含锌的金属酶,锌离子对该酶的活性有激活作用。

摘要： 立体选择性羰基还原酶能够高效、高选择性不对称还原潜手性酮,已成为制备手性醇的最为重要的生物催化剂,受到人们的高度重视.本文阐述了立体选择性羰基还原酶的结构、催化机理、高效筛选、酶分子改造和在手性生物合成中的应用.通过产酶工艺优化与控制,实现了高活力和高立体选择性羰基还原酶的规模化制备.经过羰基还原反应工艺优化及工程放大,开发了高效的羰基还原酶催化技术,成功应用于心脑血管疾病、重症感染、抑郁症等疾病的治疗药物及其中间体的工业化生产,并取得了突破性进展,为手性化合物的生物催化合成提供了理论基础和成功范例.

摘要： 精细化工产业的高度发展要求有机合成技术的相应发展。也就是新型的有机合成技术必须具备以下的一些特点:高化学选择性，区域选择性和立体选择性;反应条件温和;反应界质及后处理对环境产生的污染少等.生物催化技术正好具有这些特点。生物催化反应条件温和，通常在中性和室温，或接近这样的条件下进行;多数情况下生物催化反应在水相中进行，因而环境污染少;生物催化反应通常具有高化学选择性，区域选择性和立体选择性等特点.因此，生物催化技术的研究和开发并应用于有机合成具有非常重大的科学意义和实际应用价值。然而，对于非天然的底物来说，天然的生物催化剂在稳定性，催化活性及选择性方面常常不能得到产业化应用的要求。这就要求对天然生物催化剂进行改造和修饰，以开发高效的生物催化剂。

摘要： 生物催化不对称还原拨基化合物现己广泛用于制备手性醇。在众多的生物催化剂中，面包酵母是迄今为止在前手性酮醋不对称还原中使用最广泛的微生物之一。基于序列相似性的研究表明，S. cerevisiae中至少存在49种潜在的NAD(P)H依赖的酮还原酶，这些还原酶可还原一系列的酮或酮酯，并且在活性上相互重叠，其中一些对同一底物具备活性的酶却具有不同的立体选择性，因此经常会得到不同立体构型醇的混合物。为了有针对性地调控酿酒酵母中催化相关底物的酮酷还原酶的表达，以提高全细胞催化的还原反应的产率和立体选择性，对酵母中存在的还原酶进行催化功能的鉴定是必要的。

摘要： 本发明公开了一种改造羰基还原酶立体选择性的方法、羰基还原酶突变体及应用，通过酶结合口袋的大小和形状鉴定羰基还原酶立体选择性，反Prelog酶的口袋外部形状接近于立方体，Prelog酶的口袋外部形状更类似于长方体，通过调控关键位点氨基酸可实现酶立体选择性的反转或提升。本发明制备的羰基还原酶突变体KmCR‑E87D/A129C/V239N的立体选择性(99.5％deP,R)较野生型KmCR(99.5％deP,S)得到反转，在10h能不对称合成35.4mM的6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯。

摘要： 本发明公开了一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB‑12126的重组羰基还原酶及其编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在不对称还原前手性羰基化合物中的应用；分别以2‑苯甲酰氨甲基‑3‑酮丁酸酯、4‑氯乙酰乙酸乙酯(COBE)、(R)‑6‑氰基‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯和(4S)‑3‑[5‑(4‑氟苯基)‑1,5‑二氧代戊基]‑4‑苯基‑2‑恶唑烷酮为底物，进行生物催化反应制备高光学纯度的(2S,3R)‑2‑苯甲酰氨甲基‑3‑羟基丁酸酯、(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯、6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯以及(4S)‑3‑[(5S)‑5‑(4‑氟苯基)‑5‑羟基戊酰基]‑4‑苯基‑1,3‑氧氮杂环戊烷‑2‑酮，可以利用重组大肠杆菌作为生物催化剂进行生物催化反应，为药物手性中间体的生物催化合成提供了可供选择的新酶源。

摘要： 本发明公开了一种新的羰基还原酶、基因及其突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶制备方法，以及该羰基还原酶和重组酶在不对称还原前手性羰基化合物制备活性手性醇中的应用。本发明的羰基还原酶来源于光滑假丝酵母，应用于(R)-邻氯扁桃酸甲酯、(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯、(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯等多种光学活性手性醇的制备。与其他制备方法相比，本方法催化制备的产物浓度高，不需要额外添加或少量添加昂贵的辅酶，产物光学纯度高，具有反应条件温和，操作简便，易于放大等优势，因此在氯吡格雷、L-肉碱以及普利类降压药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。

摘要： 本发明公开了一种羰基还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用，以及所述羰基还原酶的基因、蛋白及其突变体。本发明还提供了包含所述羰基还原酶基因的重组表达载体和重组表达转化体。利用本发明所述的羰基还原酶催化不对称还原前手性羰基化合物反应时，所述不对称还原反应的反应条件温和，操作过程简便，易于放大；通过该不对称还原反应制备所得的手性醇产物浓度高，光学纯度高。因此，所述羰基还原酶在光学纯手性醇的制备中具有很好的工业应用开发前景。

摘要： 本发明公开了一种新的羰基还原酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及该重组酶作为催化剂在不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯等前手性羰基化合物制备手性醇中的应用。本发明的羰基还原酶基因来源于光滑假丝酵母，可作为催化剂应用于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯等多种光学活性手性醇的制备。与其他制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法相比，本方法催化制备的产物浓度高，不需要额外添加昂贵的辅酶，且产物光学纯度高，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在普利类降压药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。

摘要： 本发明公开了一种羰基还原酶基因、固定化羰基还原酶的制备方法和应用。羰基还原酶基因序列如SEQ：ID：NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ：ID：NO:2所示。本发明应用聚羟基脂肪酸酯（PHA）磁性纳米微球合成了固定化羰基还原酶，本发明公开了羰基还原酶在生物合成R型托伐普坦中的应用。和游离酶相比，固定化酶在pH为8.0缓冲体系中稳定性最好，提高了耐碱性。本发明制备的固定化羰基还原酶有效改善了游离酶稳定性差，耐受性差，不可重复使用等缺点。

摘要： 本发明公开了一种改造羰基还原酶立体选择性的方法、羰基还原酶突变体及应用，通过酶结合口袋的大小和形状鉴定羰基还原酶立体选择性，反Prelog酶的口袋外部形状接近于立方体，Prelog酶的口袋外部形状更类似于长方体，通过调控关键位点氨基酸可实现酶立体选择性的反转或提升。本发明制备的羰基还原酶突变体KmCR‑E87D/A129C/V239N的立体选择性(99.5％deP,R)较野生型KmCR(99.5％deP,S)得到反转，在10h能不对称合成35.4mM的6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯。

摘要： 本发明公开了一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的重组羰基还原酶及其编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在不对称还原前手性羰基化合物中的应用；分别以2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)、(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮为底物，进行生物催化反应制备高光学纯度的(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯、(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯以及(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，可以利用重组大肠杆菌作为生物催化剂进行生物催化反应，为药物手性中间体的生物催化合成提供了可供选择的新酶源。

摘要： 本发明公开了一种羰基还原酶LsCR突变体、工程菌及在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用，所述羰基还原酶LsCR突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第101、117、147、145位进行单突变或多突变获得的。本发明LsCR

摘要： 本发明公开了一种羰基还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用，以及所述羰基还原酶的基因、蛋白及其突变体。本发明还提供了包含所述羰基还原酶基因的重组表达载体和重组表达转化体。利用本发明所述的羰基还原酶催化不对称还原前手性羰基化合物反应时，所述不对称还原反应的反应条件温和，操作过程简便，易于放大；通过该不对称还原反应制备所得的手性醇产物浓度高，光学纯度高。因此，所述羰基还原酶在光学纯手性醇的制备中具有很好的工业应用开发前景。