熔解曲线

摘要： 目的 针对南、北板蓝根在市场流通和中医临床用药中混用现象,建立多重连接探针扩增结合熔解曲线法来快速准确地鉴别两者。方法 针对南、北板蓝根ITS2序列设计两对特异性探针,通过DNA变性、杂交、连接、扩增和进行熔解程序建立MLPA-熔解曲线,根据T_(m)值的差异进行鉴别,并对其探针特异性和检测灵敏度进行考察。结果 在特异性试验中,南板蓝根产生84.98°C的熔解曲线峰,北板蓝根产生83.35°C的熔解曲线峰;在灵敏度试验中,南板蓝根中掺杂10%的北板蓝根或北板蓝根中掺杂5%的南板蓝根均可被检出。26批商品药材中,有12批熔解曲线峰与北板蓝根相符,14批熔解曲线峰与南板蓝根吻合,与测序结果一致。结论 该方法灵敏准确,特异性强,可为南、北板蓝根的鉴别提供支持。

摘要： 实时荧光定量PCR技术已广泛应用于医疗、制药、农业、食品安全等多个领域,各科技期刊涌现相关研究报道,但对该技术生成的特异性监测曲线表述方式存在分歧。文章对该曲线的表述方式进行统计分析,并结合英文翻译,借助各类词典、高等教育教科书及全国科学技术名词审定委员会的术语在线进行探析,结果发现,该曲线在中文科技期刊中主要有两种表述方式,分别为“熔解曲线”“溶解曲线”,且大多数期刊均使用过这两种表述方式,经分析推测“熔解曲线”为规范表述,由于“熔”和“溶”的拼音均为róng,字形相似,词意相近,且作者和编辑对专业术语缺乏关注等,很多期刊将其误写成“溶解曲线”,对此提出相应建议,为规范专业术语表达提供参考。

摘要： 目的探究多重连接探针扩增技术(MLPA)结合熔解曲线在五味子和南五味子鉴别中的应用。方法以五味子和南五味子为研究对象,基于其ITS2序列设计探针进行MLPA反应,通过分析荧光熔解曲线的Tm值对二者进行鉴别,并将此方法应用到市场随机收集的31份五味子和南五味子商品中,通过对聚合酶链反应(PCR)产物测序验证此方法的准确性。结果两对探针都表现出很好的特异性和灵敏度,均只出现对应的单一熔解曲线峰,五味子产生82.3°C的熔解曲线峰,南五味子产生80.7°C的熔解曲线峰。31份五味子商品中,16份商品的熔解曲线Tm值与五味子吻合,15份商品的熔解曲线Tm值与南五味子吻合,实验结果与测序结果一致。结论该研究建立的方法特异性强,灵敏度高,且操作简单方便,可以快速鉴别五味子及其掺混品。

摘要： 为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isother-mal amplification,LAMP)方法.针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测方法.结果表明,当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌引物浓度比为3:1时,建立的二重检测体系扩增效率最佳;该方法特异性强、灵敏度高,对6株目标菌株和9株非目标菌株进行检测,未产生任何假阳性和假阴性结果,对2种食源性致病菌的检测灵敏度均达到102 fg/μL;根据熔解曲线中的退火温度可准确判断目标菌株,实现不同菌株的有效区分.建立的二重LAMP方法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查.

摘要： 复合调味料食用方便、口味多样,具有巨大的市场发展潜力,但相关食品安全问题也时有发生.该研究建立了实时荧光跨越式滚环等温扩增(real-time fluorescence-saltatory rolling circle amplification,RF-SRCA)熔解曲线法检测复合调味料中沙门氏菌的方法.RF-SRCA反应完成后,通过熔解曲线法检测沙门氏菌,可排除引物二聚体或非特异产物对检测结果的影响,准确直观地判定检测结果.进行引物特异性验证,并对灵敏度和人工污染样品的检出限进行分析.结果表明,该方法能有效检测沙门氏菌,14株沙门氏菌均为阳性结果,熔解峰形一致,且Tm值范围稳定,25株非沙门氏菌均为阴性结果.RF-SRCA熔解曲线方法的灵敏度为6 fg/μL,较实时荧光PCR(real-time fluorescence-PCR,RF-PCR)灵敏度高出100倍.检出限为4.6×100 CFU/g,比RF-PCR低100倍.与RF-PCR方法相比,RF-SRCA检测方法灵敏度更高,检出限更低.因此,该研究建立的RF-SRCA熔解曲线方法可对复合调味料中沙门氏菌实现快速、准确、特异、灵敏的检测.

摘要： 目的:建立用于RHD c.1227G＞A基因检测的熔解曲线分析方法.方法:根据RHD c.1227G＞A基因位点设计并合成序列特异性引物,在荧光定量PCR反应后对产物进行熔解曲线分析,根据熔解曲线峰值的差异进行基因检测结果判断,并与常规序列特异性引物PCR(PCR-sequence specific primer,PCR-SSP) RHD c.1227G＞A基因分型方法进行比较;对与血清学结果不一致的标本进行测序分析.结果:在87例血清学初筛为RhD阴性表型的标本中,采用熔解曲线分析法,检测出16例含有RHD c.1227G＞A,占比18.4％;与常规PCR-SSP分型结果一致.对1例与血清学吸收放散结果不一致的标本进行RHD exon 9测序分析,证实均为1227A纯合子.熔解曲线分析法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和总符合率均为100％,约登指数为1.0.结论:成功建立用于红细胞RHD c.1227G＞A基因分型的熔解曲线分析方法,可以高效、快速地进行RHD c.1227G＞A基因检测研究.

摘要： 目的 建立多重荧光PCR-熔解曲线法,并评价其同时检测假丝酵母菌、曲霉菌及新型隐球菌的诊断价值.方法 建立多重荧光PCR-熔解曲线法并对其检测体系进行优化.收集临床高度怀疑为侵袭性真菌感染(IFI)的各类临床样本179例,其中血液65例、深部痰液35例、尿液30例、脑脊液18例、胸腹水12例、肺泡灌洗液10例、新鲜肺组织9例.通过敏感性、特异性、重复性实验验证多重荧光PCR-熔解曲线法的检测性能,并应用受试者工作特征(ROC)曲线评价该方法的诊断效能.结果 建立的多重荧光PCR-熔解曲线法可同时检测8种常见病原真菌,包括4种假丝酵母菌(白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌)、3种曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)和新型隐球菌.其最低检测限为1×104 cfu/mL,且常见细菌无扩增反应,重复性实验解链温度波动小于0.5°C.179例临床样本中,以培养法、镜检法、病理诊断等"金标准"方法诊断IFI阳性为112例,多重荧光PCR-熔解曲线法检测阳性为96例.多重荧光PCR-熔解曲线法同时检测假丝酵母菌、曲霉菌及新型隐球菌的敏感度为0.857,特异度为0.970,阳性预测值为0.980,阴性预测值为0.802,ROC曲线下面积为0.914,95％置信区间为0.868～0.959,P<0.001.结论 本研究建立的多重荧光PCR-熔解曲线法可快速、准确、高通量同时检测假丝酵母菌、曲霉菌及新型隐球菌,对于IFI的早期诊断具有重要意义.

摘要： PCR-高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting Curve Analysis,PCR-HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术,具有极高的敏感性,可以检测出单个碱基的差异,并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限,实现了真正的闭管操作.在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用.在前期的研究中已经完成了禽白血病病毒A、B、J亚型以及内源性E型的分型诊断(专利号ZL201310012045.6);,猪瘟疫苗株与野毒株的分型诊断(ZL201310265390.0);鹅细小病毒与番鸭细小病毒的分型诊断(申请号201410069519.5)、犬细小病毒的SNP分型(申请号201410229142.5),论文发表在Molecular and Cellular Probe杂志.目前正在利用HRM技术建立实验动物病原分型诊断技术方法,如小鼠多种螺杆菌,包括肝螺杆菌(H.hepaticus)、胆汁螺杆菌(H.billis)、小家鼠螺杆菌(H.muridarum)、啮齿类螺杆菌(H.rodentium)、盲肠螺杆菌(H.typhnulius)区分;小鼠细小病毒MVM株和MPV株区分;小鼠细小病毒MPV株分型;大鼠细小病毒KRV株、H-1株、RPV株、RMV株区分以及小鼠肝炎病毒不同亚型的区分.

摘要： 为建立一种能够区分猪瘟病毒(cSFv)强毒与弱毒疫苗c株的sYBR Green I荧光定量RT—PcR结合熔解曲线分析方法，本研究对GenBank中登录的25株csFv强毒株和兔化弱毒疫苗c株全基因组序列进行比较分析。设计一对共用下游引物以及分别针对csFv强毒株与弱毒疫苗的特异性上游引物，其Tm值分别为84．5±O．5°C和88．5±0．5°C，熔解曲线分析显示为单特异峰。检测结果显示本实验建立的鉴别csFV强毒感染与弱毒疫苗的荧光定量RT．PcR结合熔解曲线分析方法特异性强，对其他相关病毒无特异性扩增;敏感性高，最低检出量为5×RID50的细胞疫苗基因组拷贝;重复性好;并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短，可对免疫猪群中csFv强毒感染做出快速准确的鉴别检测，为有效防治猪瘟提供依据。

摘要： 目的：评价BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌培养及药物敏感试验、结核分枝杆菌耐药基因芯片法、实时荧光PCR熔解曲线法三种方法检测结核分枝杆菌耐药的临床效能. 方法：搜集2015年4月至2016年8月在黑龙江省传染病防治院就诊,同时应用BACTEC MGIT960全自动分枝杆菌培养及药物敏感试验、结核分枝杆菌耐药基因芯片法、实时荧光PCR熔解曲线法三种检测方法临床确诊的耐多药肺结核病例,分析检测结果. 结果：总计25例,初治5例中有1例在早期经基因芯片检测提示异烟肼、利福平均发生突变,抗结核治疗一周后才留痰做溶解曲线检测,结果均未检出,而药物敏感试验结果显示异烟肼、利福平、左氧氟沙星耐药;在初治和复治病例中各有1例基因芯片和溶解曲线检测异烟肼均发生突变,而药物敏感试验结果显示敏感;在初治病例中除1例溶解曲线检测氟喹诺酮类药物未检出外,其余4例均未发生突变,且药物敏感试验结果显示左氧氟沙星、莫西沙星均敏感;在复治病例中有11例溶解曲线检测氟喹诺酮类药物发生突变,药物敏感试验结果显示左氧氟沙星有9例耐药、2例敏感,莫西沙星有2例耐药、9例敏感;在复治病例中溶解曲线检测氟喹诺酮类药物未发生突变的7例病例,药物敏感试验结果显示左氧氟沙星、莫西沙星均敏感. 结论：在耐药结核病防治中应该根据不同的检测目的选用适宜的检测方法,建议在有条件地区或者耐药结核病发生率较高地区,应该开展基因芯片或溶解曲线的早期筛查,尤其是复治病例更应该把溶解曲线检测做为常规,同时结合药物敏感试验以确保耐药结核的早期发现、精准治疗.

摘要： 为建立一种能够区分猪瘟病毒(CSFV)强毒与弱毒疫苗C株的SYBRGreen I荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法，本研究对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗C株全基因组序列进行比较分析，设计一对共用下游引物以及分别针对CSFV强毒株与弱毒疫苗的特异性上游引物，其Tm值分别为84.5±0.5°C和88.5±0.5°C，熔解曲线分析显示为单特异峰。检测结果显示本实验建立的鉴剐CSFV强毒感染与弱毒疫苗的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法特异性强，对其他相关病毒无特异性扩增；敏感性高，最低检出量为5×RID50的细胞疫苗基因组拷贝；重复性好；并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短，可对免疫猪群中CSFV强毒感染做出快速准确的鉴别检测，为有效防治猪瘟提供依据。

摘要： 根据NCBI上已公布的中华鲟D-loop基因、细胞色素b基因、12S rRNA基因的核酸序列设计出四对引物对，经SYBR Green实时荧光PCR反应、熔解曲线分析和扩增片段克隆测序后，发现针对D-loop基因的F2-R1引物能够高效、特异地实现对靶序列扩增，选择其作为中华鲟基因特异性扩增引物，建立中华鲟基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法。所建立的中华鲟D-loop基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法特异性好、可操作性强，具有较好的应用价值，能够为我国中华鲟研究与保护提供较好的技术手段。

摘要： 目前结核病诊断中临床经验性判断，缺乏精准快速诊断，存在耐药结核病漏诊及诊断延误和非结核分枝杆菌病漏诊及诊断延误。

摘要： 目前结核病诊断中临床经验性判断，缺乏精准快速诊断，存在耐药结核病漏诊及诊断延误和非结核分枝杆菌病漏诊及诊断延误。

摘要： 目前结核病诊断中临床经验性判断，缺乏精准快速诊断，存在耐药结核病漏诊及诊断延误和非结核分枝杆菌病漏诊及诊断延误。

摘要： 目前结核病诊断中临床经验性判断，缺乏精准快速诊断，存在耐药结核病漏诊及诊断延误和非结核分枝杆菌病漏诊及诊断延误。

摘要： 本发明提供一种能够自动分析两个温度范围的至少一个中是否存在峰值的熔解曲线分析方法。从各温度下的信号微分值中搜索绝对值最大的信号微分值(A)，在表示上述(A)的温度(t

摘要： 本发明涉及一种物种鉴定领域，是一种以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法，其特点是根据三带喙库蚊COIII基因序列设计特异性引物，利用优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴定三带喙库蚊各种形态如成虫、卵、幼虫和蛹等。能对三带喙库蚊进行鉴定，操作简单、速度快、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作。

摘要： 提供了用于检测靶基因核苷酸多态性的PNA探针，使用其检测靶基因的核苷酸多态性的熔解曲线分析方法，靶基因的核苷酸多态性分析方法包括熔解曲线分析方法，和包含PNA探针的用于检测靶基因的核苷酸多态性的试剂盒。其特征在于根据本发明的PNA探针包含负电荷分子。根据本发明的修饰的PNA包含负电荷分子以具有对靶DNA的高识别能力和与靶DNA的高偶联并通过热迅速解离的能力，由此即使在显示两种熔解曲线图的杂合样品中也可相对容易地实施核苷酸多态性分析，且可同时分析两个或更多个相邻的单核苷酸多态性。

摘要： 提供一种能够自动分析两个温度范围的至少一个中是否存在峰值的熔解曲线分析方法。从各温度下的信号微分值中搜索绝对值最大的信号微分值(A)，在表示上述(A)的温度(t

摘要： 本发明提供了一种荧光定量熔解实验中熔解曲线测量方法，涉及荧光定量检测技术领域，包括采集荧光定量熔解实验中非等间隔荧光强度数据；确定滑动窗口大小以及多项式次数；对各滑动窗口内荧光强度数据按照多项式次数对应的多项式进行拟合，确定导数矩阵；基于导数矩阵，计算滑动窗口内各采样点对应的负导数数据，获得平滑后的熔解曲线。以此可以降低拟合、平滑、插值的过多引入，减小误差，并且计算复杂度低。

摘要： 本发明公开了一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒4种点突变S基因鉴别试剂盒及其鉴别方法，涉及生物医药领域，其特点是根据新型冠状病毒S基因的4个不同突变位点设计扩增引物，通过优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴别不同位点突变的S基因。本试剂盒操作简单、反应速度快、PCR产物无需后处理、具备可操作性与重现性，可用于不同位点突变的新型冠状病毒S基因的鉴别。

摘要： 本发明公开了一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用，属于基因检测技术领域，本发明将双标记自淬灭的TaqMan探针熔解曲线技术与两条邻近单标记探针联合淬灭的熔解曲线技术相结合，提出一种基于熔解曲线正负峰形分析的多重PCR检测方法及应用。本方法利用双标记自淬灭的TaqMan探针熔解曲线技术，获得正常的熔解峰，利用两条邻近单标记探针联合淬灭的熔解曲线技术获得倒置的熔解峰，实现单色荧光通道中，一个靶标的检测结果呈现正的熔解峰，另一个靶标的检测结果呈现负的熔解峰，使得单色荧光通道可同时检测至少两种靶标，本发明利用现有荧光PCR平台有限的荧光检测通道和在较窄的温度范围内单管实现多重靶标的检测，具有较大的市场和应用前景。

摘要： 本发明提供了一种熔解曲线重叠峰的分离方法、装置和电子设备，涉及PCR检测的技术领域，包括：首先基于常规方法获取PCR反应板各孔熔解曲线的熔点峰位置，利用Savitzky‑Golay求导方法确定各孔熔解曲线的二阶导数曲线；然后根据二阶导数曲线和熔点峰位置，确定原始熔解曲线的初始重叠峰位置；再对初始重叠峰位置进行叠加拟合，生成两个熔点峰曲线；最后根据两个熔点峰曲线确定满足误差范围的目标熔点峰，并对目标熔点峰进行分离。该方法通过计算熔解曲线二阶导数曲线，降低了背景干扰、提高了熔点峰的分辨率，较好的解决了背景干扰较大情况下、具有重叠峰的疑难熔解曲线熔点峰只存在一个Tm值的问题。

摘要： 本发明提供一种基于熔解曲线分析的前胡及其混伪品的检测鉴定方法，包括以下步骤：提取前胡及其混伪品的总基因组DNA；对样本中的总基因组DNA进行PCR扩增；建立前胡正品、不同种类的前胡伪品样本及二者不同比例掺杂的熔解曲线模型；待测样本的快速检测，判断待测样品的真伪。本发明准确性高、特异性好、检测速度快，直观性强，通过进行熔解曲线Tm值大小的比对即可区分不同前胡样品的DNA，在该药材的正品、伪品及二者掺杂的掺伪品的快速检测方面具有独特的优势。

摘要： 本发明一种铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物、应用及鉴别方法，上游引物TPHML‑F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物TPHML‑R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本鉴别引物可用于鉴别铁皮石斛药材及其加工制品铁皮枫斗与其近缘物种。本发明方法操作简便、耗时短、检出限低、准确度高，具有良好的应用前景。