心肌微血管内皮细胞

摘要： 目的观察搜风祛痰中药含药血清对同型半胱氨酸损伤的心肌微血管内皮细胞线粒体凋亡的影响。方法将心肌微血管内皮细胞分为空白对照组、模型对照组及搜风祛痰中药低、中、高剂量组,除空白对照组外其余各组均以同型半胱氨酸诱导心肌微血管内皮细胞损伤,各组含药血清分别与细胞共同培养24 h。收集细胞后进行相关指标的检测,采用四唑盐(MTT)法检测细胞生存活性;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型对照组细胞生存活性降低,Bax、Bcl-2、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达均升高(P<0.01);与模型对照组比较,搜风祛痰中药各剂量组细胞生存活性升高,Caspase-9、Caspase-3蛋白表达均降低,Bcl-2蛋白表达均升高,搜风祛痰中药中、高剂量组Bax、Cyto-C蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论搜风祛痰中药含药血清能够上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax、Cyto-C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达,抑制细胞线粒体凋亡,从而减轻同型半胱氨酸损伤的心肌微血管内皮细胞。

摘要： 目的研究冰片对心肌微血管内皮细胞的保护作用。方法体外培养的大鼠心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs),采用CCK-8(cell counting kit-8)检测细胞活力,建立过氧化氢H_(2)O_(2)损伤CMECs模型,确定实验适宜的H_(2)O_(2)浓度及冰片治疗浓度。将CMECs分为对照组、H_(2)O_(2)损伤组及冰片治疗组。通过检测氧化应激反应多种中间产物含量及线粒体功能等,观察比较冰片对H_(2)O_(2)诱导的CMECs损伤的保护作用。结果H_(2)O_(2)损伤组与对照组比较,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、NADPH氧化酶、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量明显增加,还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量明显减少;经冰片治疗后,CMECs内LDH、MDA、NADPH氧化酶、GSSG含量明显减少,GSH含量明显增加。与对照组比较,H_(2)O_(2)损伤组FACL4基因mRNA及蛋白的表达显著升高,GPX4基因mRNA及蛋白的表达显著降低;冰片治疗组与H_(2)O_(2)损伤组比较,FACL4基因mRNA及蛋白的表达降低,GPX4基因mRNA及蛋白的表达增加。结论冰片对H_(2)O_(2)诱导的CMECs氧化应激损伤及线粒体生物合成功能的损伤具有保护作用。

摘要： 目的:探讨罗格列酮对高糖处理的心肌微血管内皮细胞(CMEC)增殖、迁移的影响和分子机制.方法:将大鼠CMEC分为对照组(葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖对照组(葡萄糖33 mmol/L)、实验1组(高糖+罗格列酮5 μmol/L)、实验2组(高糖+罗格列酮10 μmol/L)、实验3组(高糖+罗格列酮20μmol/L).细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖活力;Transwell实验检测细胞迁移能力;Western blot检测P21、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、沉默信息调节因子1(Sirt1)的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测Sirt1的mRNA表达水平.将Sirt1小干扰RNA(si-Sirt1)转染CMEC,经高糖和罗格列酮20 μmol/L处理后,采用上述方法检测细胞增殖和迁移能力.结果:与对照组比较,高糖对照组CMEC增殖和迁移能力降低,P21和E-cadherin表达增加,Sirt1表达降低(P均＜0.05).与高糖对照组比较,高糖联合罗格列酮处理后CMEC增殖和迁移能力增加,P21和E-cadherin表达降低,Sirt1表达增加(P均＜0.05).与高糖联合罗格列酮处理比较,转染si-Sirt1并经高糖联合罗格列酮处理后CMEC增殖和迁移能力降低,P21和E-cadherin表达增加(P均＜0.05).结论:罗格列酮通过上调Sirt1表达促进高糖处理的CMEC增殖和迁移.

摘要： 目的 观察丹参通络解毒汤药物血清对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)自噬及血管生成的影响,探讨其作用机制.方法 建立CMECs缺氧/复氧损伤模型,将CMECs随机分为空白组、模型组、丹参通络解毒汤药物血清组、3-MA自噬抑制剂组,除空白组外其余各组均置于低糖无血清DMEM培养基中培养,同时置于37°C、94％N2、1％O2、5％CO2培养箱中缺氧2h,换正常DMEM培养基,给氧3 h,再给予相应药物干预.倒置显微镜观察CMECs细胞生长及形态,检测试剂盒测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1、p62及血管内皮生长因子(VEGF)表达,免疫荧光检测CMECs细胞特征性表面标志物蛋白CD34表达.结果 与空白组比较,模型组CMECs细胞坏死程度增加,培养液中LDH含量明显增加(P＜0.01),Beclin 1、VEGF蛋白表达明显升高(P＜0.01,P＜0.05),p62蛋白表达明显降低(P＜0.01),CD34蛋白红色荧光明显减弱;与模型组比较,丹参通络解毒汤药物血清组和3-MA自噬抑制剂组CMECs细胞坏死程度减轻,培养液中LDH含量明显减少(P＜0.01),Beclin 1蛋白表达明显降低(P＜0.01),p62、VEGF蛋白表达明显升高(P＜0.01,P＜0.05),CD34蛋白红色荧光明显增强.结论 丹参通络解毒汤能适度抑制缺氧/复氧CMECs细胞自噬,从而促进血管生成,达到保护CMECs细胞的目的.

摘要： 目的 探讨小鼠心肌微血管内皮细胞的体外小管生成实验的最佳细胞浓度,从而为心脏微血管的研究提供体外实验模型.方法 组织块贴壁法培养小鼠心肌微血管内皮细胞,将小鼠心肌微血管内皮细胞分成5×103个/孔、1×104个/孔、2×104个/孔、3×10 4个/孔4组,并接种至Matrigel胶包被的48孔板中,细胞接种后24 h在倒置显微镜下观察拍照,并用Image J软件对形成的管腔数量、分支数量进行统计,统计结果用(x±s)表示,数据采用SPSS 17.0软件分析.结果 组织块贴壁法可成功培养小鼠心肌微血管内皮细胞,分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞vWF相关抗原阳性表达.细胞密度为5×103个/孔时无管腔样结构生成,当细胞浓度为1×104个/孔、2×10 4个/孔、3×104个/孔时可有管腔样结构生成.细胞浓度为2×104个/孔时形成的管腔数量及分支数量高于1×104个/孔、3×10 4个/孔(P＜0.05).结论 分离培养的小鼠心肌微血管内皮细胞具有血管形成能力.在一定的细胞接种浓度范围内,接种的细胞密度越大,体外血管形成能力增强,但细胞浓度超过血管形成的最佳浓度后,随着接种细胞浓度的增大,小鼠心肌微血管内皮细胞的体外血管形成能力减弱.

摘要： 目的就柯萨奇病毒B3(CVB3)对心肌微血管内皮细胞的感染情况及其半数感染量(TCID50)进行测定,并检测感染过程中微小RNA-1(miR-1)表达及心肌细胞凋亡的作用。方法采用Reed-Muench法计算TCID50,TUNEL法检测细胞的凋亡,Western Blot检测CVB3对心肌微血管内皮细胞的感染过程中Bcl-2和Bax的表达情况。用定量PCR检测miR-1的表达。结果CVB3对心肌微血管内皮细胞的半数感染量TCID50为6.825。随着CVB3作用时间的增加,心肌细胞的凋亡情况逐渐加深。Bax随着作用时间的增加表达量逐渐增加,而Bcl-2和miR-1则逐渐减少。结论CVB3在感染心肌微血管内皮细胞时,通过抑制miR-1的表达促进细胞凋亡,可为进一步研究CVB3的感染机制提供参考。

摘要： 目的 就柯萨奇病毒B3(CVB3)对心肌微血管内皮细胞的感染情况及其半数感染量(TCID50)进行测定,并检测感染过程中微小RNA-1(miR-1)表达及心肌细胞凋亡的作用.方法 采用Reed-Muench法计算TCID50,TUNEL法检测细胞的凋亡,Western Blot检测CVB3对心肌微血管内皮细胞的感染过程中Bcl-2和Bax的表达情况.用定量PCR检测miR-1的表达.结果 CVB3对心肌微血管内皮细胞的半数感染量TCID50为6.825.随着CVB3作用时间的增加,心肌细胞的凋亡情况逐渐加深.Bax随着作用时间的增加表达量逐渐增加,而Bcl-2和miR 1则逐渐减少.结论 CVB3在感染心肌微血管内皮细胞时,通过抑制miR-1的表达促进细胞凋亡,可为进一步研究CVB3的感染机制提供参考.

摘要： 目的:探讨高糖、低氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)新生功能的影响.方法:体外培养成年大鼠CMEC,随机分为4组:正常对照组(NG组)、高糖组(HG组)、低氧组(HNG组)和高糖+低氧联合组(HHG组).Real-time PCR法检测各组CMEC的HIF-1α、VEGF的mRNA表达水平;CCK-8法检测各组CMEC的体外增殖能力;transwell小室实验评价各组CMEC的迁移能力;体外小管形成实验评价各组CMEC的成管能力.结果:(1)HIF-1α的mRNA表达水平:NG组与HG组之间、HNG组与HHG组之间无统计学差异(P>0.05);HNG组明显高于NG组(P0.05),HNG组明显高于HHG组(P<0.05);HNG组明显高于NG组(P<0.05),HHG组明显高于HG组(P<0.05),表明高糖可抑制CMEC的VEGF mRNA表达,而低氧可促进其表达.(2)细胞的增殖能力:NG组明显高于HG组(P<0.05),HNG组明显高于HHG组(P<0.05);NG组明显高于HNG组(P<0.05),HG组明显高于HHG组(P<0.05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC增殖.(3)细胞的迁移能力:NG组明显高于HG组(P<0.05),HNG组明显高于HHG组(P<0.05);NG组明显高于HNG组(P<0.05),HG组明显高于HHG组(P<0.05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC迁移.(4)细胞的成管能力:NG组明显高于HG组(P<0.05),HNG组明显高于HHG组(P<0.05);NG组明显高于HNG组(P<0.05),HG组明显高于HHG组(P<0.05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC小管形成能力.结论:高糖对CMEC的HIF-1αmRNA表达的影响不明显,但可明显抑制CMEC的VEGF mRNA表达;低氧可促进CMEC的HIF-1α和VEGF mRNA表达;高糖和低氧均可降低CMEC的增殖能力、迁移能力和成管能力,两者联合时作用更为明显.

摘要： 目的：观察心肌微血管内皮细胞条件培养液对心肌细胞的影响及通心络的干预作用. 方法：制备3种心肌微血管内皮细胞条件培养液：正常内皮细胞条件培养液(N-CM),同型半胱氨酸诱导损伤的心肌微血管内皮细胞条件培养液(H-CM)和通心络干预的心肌微血管内皮细胞条件培养液(T-CM).将心肌细胞随机分为4组：正常对照组、N-CM组、T-CM组及H-CM组,采用相应培养液培养.倒置显微镜观察心肌细胞形态,酶联免疫吸附法检测细胞上清液心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量,JC-1试剂盒测定细胞中线粒体膜电位(MMP),Western blot法检测细胞色素C(CytC)和钙网蛋白(CRT)蛋白表达. 结果：与正常对照组比较,N-CM组细胞形态无明显变化,细胞上清液cTnT含量、MMP水平、CRT及CytC蛋白表达无明显变化(P＞0.05);与N-CM组比较,H-CM组细胞皱缩,细胞边缘模糊,有大量坏死细胞漂浮,细胞上清液cTnT含量、CRT及CytC蛋白表达升高,MMP水平降低(P＜0.01);与N-CM组比较,T-CM组细胞无明显皱缩,细胞边缘较清楚,坏死漂浮细胞减少,细胞上清液cTnT含量、CRT及CytC蛋白表达降低,MMP水平升高(P＜0.05,P＜0.01). 结论：受损心肌微血管内皮细胞的条件培养液可损伤心肌细胞,其损伤机制可能与CRT介导的线粒体功能受损有关,通心络可抑制该损伤过程.

摘要： 目的：探讨通心络(Tongxinluo,TXL)对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcv)诱导大鼠心肌微血管内皮细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress.ERS)致细胞凋亡的影响及其机制. 方法：采用植块法原代培养乳鼠心肌微血管内皮细胞,倒置显微镜观察细胞形态并通过CD31免疫荧光法对培养的大鼠心肌微血管内皮细胞进行辨别、鉴定.取2-4代生长良好的大鼠心肌微血管内皮细胞,采用免疫荧光法检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)表达以确定Hcv最佳作用时间.后续实验分为5组：空白对照组、Hcy诱导组(Hcy10mmol/L,10h)、Hcy+TXL组(Hcy lOmmol/L+TXL400μg/mL)、Hcy+LY294002组(Hcy10mmol/L+LY2940025μmol/L,LY294002为PI3K抑制剂)及Hcv+LY294002+TXL组(Hcy10mmol/L+LY2940025μmol/L+TXL400μg/mL).采用流式细胞仪检测大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡率,实时荧光定量反转录PCR(Real-Time Reverse Transcription PCR,RT-PCR)及Western blot法检测GRP78、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(cvsteinyl aspartate specific proteinase-12,caspase-12)mRNA及蛋白表达,Western blot法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation of phosphatidylinositol3-kinase,p-PI3K)、总磷脂酰肌醇3-激酶(total phosphatidylinositol3-kinase,t-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylation of kinase B,p-Akt)及总的蛋白激酶B(total kinase B,t-Akt)蛋白表达. 结果：确定Hcy作用时间为10h.与空白对照组比较,Hcy诱导组细胞凋亡率(22.77％)升高,GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA及蛋白表达升高,p-PI3K和p-Akt蛋白表达降低,p-PI3K/t-PI3K及p-Akt/t-Akt降低(P＜0.05,P＜0.01);与Hcv诱导组比较,Hcv+TXL组细胞凋亡率(10.17％)降低,GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA及蛋白表达降低,p-PI3K和p-Akt蛋白表达升高,p-PB K/t-PBK及p-Akt/t-Akt升高(P＜0.05,P＜0.01);与Hcv+TXL组比较,Hcv+TXL+LY294002组细胞凋亡率(17.9％)升高,GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA及蛋白表达升高,p-PI3K和p-Akt蛋白表达降低,p-PI3K/t-PI3K及p-Akt/t-Akt降低(P＜0.05,P＜0.01) 结论：通心络可抑制Hcy诱导的ERS致大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关.

摘要： 目的：观察过表达Nrf2对缺氧诱导大鼠心肌微血管内皮细胞迁移及成血管能力的影响。方法：分离和培养大鼠心肌微血管内皮细胞，分别将过表达Nrf2及空载病毒的慢病毒载体转染至大鼠心肌微血管内皮细胞,采用RT-PCR 和Western blot检测Nrf2的mRNA及蛋白表达水平,transwell实验及胶原基质胶三维培养分别检测缺氧条件(1％O2)下细胞迁移能力及细胞体外血管生成能力.结果：与空载病毒对照组比较,转染Nrf2组Nrf2 mRNA和蛋白表达明显增高,在缺氧条件(1％O2)下细胞迁移能力及血管生成能力明显增强。结论：过表达Nrf2可促进大鼠心肌微血管内皮细胞迁移及成血管能力。

摘要： 本文建立了SD大鼠心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemiareperfusion mjury，MIRI)模型，观察甘草酸对MIPI大鼠心肌微血管内皮细胞(myocardialmicrovascular endothelialcell，MMVEC)的影响，探讨甘草酸治疗MIRI的微血管机制，为防治MIRI提供新的思路。

摘要： 本发明提供了永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在制备修复组织皮肤全层缺损生物制剂和制备治疗缺血缺氧性组织损伤生物制剂中的应用，所述的复合细胞因子为低氧培养永生化人肺微血管内皮细胞所分泌的细胞因子，所述的复合细胞因子不含有遗传物质（DNA或RNA）。用低氧培养的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子局部应用，促进局部血管的形成，具有明显的效果。并且对于皮肤组织缺损等损伤疾病具有明显的组织再生作用。复合细胞因子具有多种促进血管生成的有效成分，能够促进血管再生，并对损伤组织进行修复，促进损伤组织的生长愈合，调节免疫反应等等。

摘要： 本发明提供一种原代脊髓微血管内皮细胞的分离培养方法及由其得到的脊髓微血管内皮细胞，所述方法包括如下步骤：（1）将脊髓组织与平衡盐溶液混合，进行研磨，离心，收集沉淀；（2）将步骤（1）得到的沉淀与富集试剂混合，离心，弃上清，得富集的脊髓微血管片段；（3）将得到的脊髓微血管片段与酶混合，消化，得脊髓微血管内皮细胞；（4）将脊髓微血管内皮细胞与增殖培养基混合，接种于蛋白质和/或多肽包被的细胞培养板上，进行一次培养，后换用选择培养基进行二次培养，即得。所述方法稳定性高、可重复性好、简便快速、成本低、得到的脊髓微血管内皮细胞纯度高且产量高，具有重要的应用价值。

摘要： 本说明书提供：一种分离血管内皮细胞的纯培养物的方法，该方法能够在从由人多能干细胞分化的内皮细胞谱系的细胞系中分离在特定时间粘附在基质上的同质内皮细胞；一种维持血管内皮细胞特性的培养基，其包括通过该方法分离的高纯度血管内皮细胞，4ng/ml至6ng/ml的FGF2、5ng/ml至10ng/ml的EGF、10ng/ml至30ng/ml的VEGF‑A、20ng/ml至50ng/ml的抗坏血酸和DMEM/F‑12作为活性成分；以及包括它们的培养方法。

摘要： 本发明提供一种小鼠脑微血管内皮细胞与周细胞联合提取培养方法，该方法新颖而简单，采用“两步酶解法”可从小鼠中枢神经系统中分离和培养大量内皮细胞与周细胞，该方法易于建立，并在较短时间内提供大量高纯度的内皮细胞和周细胞，进而用于多种下游应用，包括体外和体内实验，转录组学、蛋白质组学、代谢组学、表观基因组学和单细胞分析。

摘要： 本发明提供了永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在制备修复组织皮肤全层缺损生物制剂和制备治疗缺血缺氧性组织损伤生物制剂中的应用，所述的复合细胞因子为低氧培养永生化人肺微血管内皮细胞所分泌的细胞因子，所述的复合细胞因子不含有遗传物质（DNA或RNA）。用低氧培养的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子局部应用，促进局部血管的形成，具有明显的效果。并且对于皮肤组织缺损等损伤疾病具有明显的组织再生作用。复合细胞因子具有多种促进血管生成的有效成分，能够促进血管再生，并对损伤组织进行修复，促进损伤组织的生长愈合，调节免疫反应等等。

摘要： 本发明公开一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，包括以下步骤：S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离：分离新生小鼠边缘肺组织，用眼科剪刀将组织剪成小块，制备单细胞悬液，磁珠阴性选择去除CD45+、CD90.2+和CD326+的细胞，筛选内皮细胞集落进行体外增殖；S2、内皮细胞永生化：转染六种慢病毒并进行筛选，根据细胞的生长速率和形态选择永生化细胞株；S3、囊泡提取：采用超声离心法提取囊泡。本发明通过磁珠阴性选择和圈选手段，避免了传统磁珠阳性选择提取细胞的损害，极大改善内皮细胞的损耗；本发明通过转染慢病毒至原代细胞，构建永生化细胞，永生化细胞分泌囊泡保留了原代细胞分泌囊泡的特性，极大降低囊泡提取成本。

摘要： 本发明公开了脑微血管内皮细胞在制备用于修复血脑屏障损伤的药物中的应用，涉及细胞制剂领域。本发明解决了目前技术下缺血性脑卒中后血脑屏障不可逆开放引发了损伤扩大化，改善了卒中治疗的预后；本发明中的细胞制剂来源广泛，易于获得，且可以快速修复脑血屏障。本发明中的细胞制剂能够靶向至脑缺血部位，可采用简单的静脉注射进行给药便于临床操作。

摘要： 本发明涉一种永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株及其构建方法与应用。该方法是使用混合酶消化法，采用Ⅱ型胶原酶、分散酶和脱氧核糖核酸酶I从树鼩视网膜组织中分离并通过差速消化法纯化获得原代树鼩视网膜微血管内皮细胞，然后利用携带SV40T的慢病毒转染原代细胞，胰酶消化后挑选单克隆并经过50代以上的传代，获得永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞；本发明方法获得的细胞能够稳定传代至50代以上，有效维持了树鼩视网膜微血管内皮细胞稳定的生长状态和增殖能力，改善了目前视网膜血管研究只能现用现取的烦琐程序，为眼科相关疾病的研究提供了稳定的视网膜微血管内皮细胞系，真正做到省时、省力、高效、便利。

摘要： 本发明公开了一种脑微血管内皮细胞提取纯化方法，涉及细胞纯化的技术领域。其提取纯化方法，包括以下步骤：S1、粗提小鼠脑组织中的脑微血管内皮细胞；S2、对S1处理后的脑微血管内皮细胞混合物进行第一次CD31免疫磁珠分选以纯化；S3、对S2处理后的脑微血管内皮细胞进行第二次CD31免疫磁珠分选以纯化，即得纯化后的脑微血管内皮细胞。本申请采用CD31磁珠二次分选的方式，降低对脑微血管内皮细胞活性的损伤，分离纯化效率高，操作步骤相对简单，可以获得高纯度、高产量及高活性的脑微血管内皮细胞。

摘要： 本发明公开了A型肉毒毒素(BTXA)预处理真皮微血管内皮细胞拮抗再灌注的处理过程，利用手术过程中多余的皮肤组织，通过中性蛋白酶和胶原酶进行孵育消化，提取独立的真皮细胞，进行磁珠分选，以获得真皮微血管内皮细胞，进行细胞培养。通过传代培养将细胞分成八组：第一组置于低氧舱(通入低氧混合气体5％O2、5％CO2、90％N2)内8小时；第二组置于低氧舱8小时后，转入普通培养箱内复氧24小时；第三组到第八组分别加入含0.1U/mL，0.2U/mL，0.4U/mL，0.8U/mL，1.6U/mL，3.2U/mLBTXA的内皮细胞培养基培养12小时，然后将细胞置于低氧舱内8小时，随后在普通培养箱内复氧24小时。