α毒素

摘要： 诺维氏梭菌是羊黑疫的致病菌,该菌可使1岁以上的绵羊发病,山羊也可以患此病。由诺维氏梭菌引起的羊黑疫发病急,死亡快,家畜往往还没有表现出明显症状就死亡,给畜牧业带来了巨大损失。本研究利用重组诺维氏梭菌ɑ毒素制备单克隆抗体,研究过程中成功制备了2株针对诺维氏梭菌α毒素重组蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为1978CT716.15.65和1978CT142.38.7。对所得2株杂交瘤细胞分泌的抗体进行间接ELISA测抗体效价,最高可达到1:512000。对所获得的2株杂交瘤细胞进行Western Blot分析发现,2种单克隆抗体均能与重组蛋白发生特异性结合。鉴于单克隆抗体具有生物活性单一、纯度相对比较高且与抗原结合特异性强等优势,可以利用单克隆抗体达到快速检测疾病及治疗疾病的目的,为构建快速检测诺维氏梭菌的检测技术和检测方法奠定了基础。

摘要： 为获得分泌表达的无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白并分析其免疫原性,根据A型产气荚膜梭菌α毒素基因序列,对α毒素的第176位组氨酸突变为天冬酰胺,同时对信号肽序列进行密码子优化,将化学合成的该序列插入到载体pET32a,获得重组质粒pET32a-αH176N,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过自诱导的方法分泌表达重组αH176N蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,αH176N蛋白在乳糖1~2 g/L、28°C诱导条件下高效分泌表达。卵磷脂酶试验及小鼠毒力试验显示,αH176N蛋白失去磷脂酶C活性及毒性。免疫保护试验结果显示,αH176N蛋白与氢氧化铝胶配制成的疫苗,以0.25 mL/只免疫试验兔就能达到100%(6/6)的免疫保护效果,优于传统灭活疫苗免疫2 mL/只的保护效果。

摘要： 将腐败梭菌参考株增殖、鉴定,使用饱和硫酸铵沉淀法粗提腐败梭菌天然α毒素,并通过SDS-PAGE方法对其进行检测。将扩增的α毒素目的片段和经酶切的p ET-21a(+)载体同源重组,将构建好的重组质粒转入到BL21(DE3)感受态细胞中,并筛选阳性克隆株。在优化的表达条件下,对α毒素重组蛋白进行了大规模的表达。免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞筛选。制备及纯化腹水,进行效价、浓度、纯度及特异性测定。结果表明,本研究成功表达了可溶性腐败梭菌α毒素蛋白,大小约为46 kDa,筛选出的单抗3 E8和单抗6B12对重组蛋白效价检测结果均为1:256 000,对天然α毒素的效价检测结果均为1:128 000;纯度均已达到85%以上;单克隆抗体的浓度分别为3E8:2.27 mg/ml,6B12:1.96 mg/ml;均能够与腐败梭菌重组α毒素、天然α毒素特异性结合,而与产气荚膜梭菌α毒素无交叉反应。结论:得到特异性强、稳定性高的单抗3E8和单抗6B12,有助于腐败梭菌病的早期诊断及研究。

摘要： 利用PCR技术将α毒素羧基端基因CPA251-370克隆到pET-32a载体上,构建了重组表达质粒pXETCPA-C,酶切鉴定和序列分析证实其含有CPA251-370基因且序列和阅读框架均正确。对重组菌株BL21(DE3)(pXETCPA-C)表达的蛋白质进行SDS-PAGE分析,结果表明CPA251-370蛋白表达量占菌体总蛋白质相对含量的16.43%。SOPMA法预测表明CPA251-370蛋白二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其3D结构与α毒素羧基端部分相似。CPA和CPA251-370蛋白的圆二色(CD)光谱分析发现两者的CD光谱仅有一些微小变化。免疫攻毒试验表明CPA251-370蛋白免疫的小鼠能抵抗最小致死剂量(MLD) 0.5 mL·只-1(活菌数约为5×109 cfu)的A型魏氏梭菌标准株C57-1毒素攻击。该研究深入阐释了A型魏氏梭菌α毒素的分子结构,为揭示其作用的分子机制奠定了坚实基础。

摘要： 根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌和腐败梭菌的α毒素基因序列,分别设计并合成针对2种α毒素基因的特异性引物,通过扩增条件的优化,建立快速鉴别产气荚膜梭菌和腐败梭菌的双重PCR方法.特异性试验显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌则均未能扩增出相应条带.灵敏度试验结果显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌基因组DNA最低检测量分别为17.95 pg/μL和1.261 pg/μL.应用该方法对样品进行检测,其中5份为产气荚膜梭菌阳性.成功建立了特异性强、敏感性高的双重PCR方法,可以有效进行产气荚膜梭菌和腐败梭菌的快速鉴别,对羊梭菌病病原快速鉴定及流行病学调查具有重要意义.

摘要： 为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 mL/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击.结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 mL,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 mL;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准.结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础.

摘要： 为了评价重组腐败梭菌α毒素在联苗中的免疫效果,试验用不同含量的重组腐败梭菌α毒素替代羊三联四防苗中腐败梭菌组分制备联苗,分别免疫兔和绵羊,在免疫后的第10,14,21天分别测定血清中和效价,免疫后第25天用1个最小致死量(MLD)的腐败梭菌毒素对免疫兔和绵羊分别进行攻毒,以期得到能使动物获得足够保护的抗原含量.结果 表明:对于兔和绵羊联苗中重组腐败梭菌α毒素蛋白最小免疫剂量分别为0.3 mg、0.25 mg时,在免疫后第14天腐败梭菌毒素血清中和效价均能达到1;免疫后第25天进行攻毒保护试验,免疫兔和绵羊攻毒保护率分别为100％、75％.说明重组腐败梭菌α毒素可以替代羊三联四防苗中腐败梭菌组分用来进行免疫.

摘要： 为了制备大肠杆菌源的重组腐败梭菌α毒素并对其生物学特性鉴定.利用PCR扩增α毒素基因,构建重组表达质粒pET32a-csa,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,对产物的反应原性、溶血活性、细胞毒性、小鼠致死毒性、毒力和毒性中和等生物学特性鉴定.结果 显示,重组α毒素主要表达形式为包涵体,产物能够与腐败梭菌抗毒素血清反应,不能使绵羊红细胞发生溶血,具有细胞毒性和小鼠致死毒性,毒力超过300 MLD/mL,而且这种毒性可以被抗毒素中和.结果 表明,通过大肠杆菌原核表达可以制备具有一定生物活性的重组腐败梭菌α毒素.

摘要： 目前,对产气荚膜梭菌α毒素致病作用存在很多争议,为了研究A型产气荚膜梭菌α毒素(磷脂酶C,PLC)的致病性,本实验采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,构建重组表达质粒pGEX-plc,IPTG诱导表达获得重组蛋白PLC.对纯化鉴定后PLC蛋白进行细胞毒性试验,体外细胞毒性试验结果表明4h时Hela细胞开始出现病变,并随时间延长而逐渐严重,说明α毒素对Hela细胞有毒性作用.本实验进一步通过腹腔注射产气荚膜梭菌及其α毒素的方式建立小鼠疾病模型，在动物体内完整的还原了疾病的发展进程。小鼠发病迅速，腹部膨大，肠道臌气明显。72h后，感染组小鼠均呈现不同程度的多器官病变。通过病理组织学观察，可以看出感染组小鼠的心脏、肝脏、肾脏和小肠都出现不同程度的病理变化，其中以小肠为主要病变器官，表现为肠黏膜损伤，绒毛脱落等。同时，也发现，单独感染A型产气荚膜梭菌ɑ毒素组病变略轻于感染产气荚膜梭菌标准株ATCC13124组，但病变规律相一致。这一结果表明ɑ毒素是A型产气荚膜梭菌主要致病毒素，对Hela细胞和小鼠均有致病性，并导致小鼠表现典型的肠道病理变化。也推测产气荚膜梭菌野生菌中仍存在其他致病毒素，与ɑ毒素一起参与该疾病的致病机理。相关研究表明，该菌在动物体内大量繁殖，产生毒素，毒素随血液循环系统到达全身，因ɑ毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶的活性，破坏细胞膜结构的完整性，所以本模型在攻菌小鼠的心脏、肝脏、肾脏和小肠等组织器官中发现有出血、充血、坏死等病变，为进一步阐明产气荚膜梭菌的致病机制提供一定的理论基础。

摘要： 为了对A型产气荚膜梭菌α毒素快速准确地做出检测,本实验应用的A型产气荚膜梭菌的标准菌株CVCC38,利用厌氧肉肝汤培养A型产气荚膜梭菌,经革兰染色观察以及含铁牛奶培养基观察其生化特性.然后使用饱和度为60％的硫酸铵粗提其α毒素蛋白,进行透析纯化并应用SDS-PAGE方法鉴定A型产气荚膜梭菌的α毒素,鉴定之后将纯化的α毒素给小鼠腹腔注射来检测其活性.果表明，厌氧肉肝汤培养基变浑浊且产生大量气体，含铁牛奶培养基发生爆烈发酵现象，革兰染色镜检可见到一种呈阳性的粗大杆菌，菌体两端钝圆，多单个存在，有荚膜，很少见到芽胞，可确定所培养细菌为产气荚膜梭菌；SDS-PAGE检测结果，α毒素分子量为43.6kDa，实验组小鼠出现梭菌病的典型临床症状。此外，根据Gene Bank上已发表的CVCC38 A型产气荚膜梭菌序列设计1对引物对α毒素基因进行克隆，菌落PCR成功扩增出1127bp α毒素基因片段。本实验中所提供的检测产气荚膜梭菌方法具有灵敏、快速、简便等优点而且具有实践意义。产气荚膜梭菌主要致死性毒素的毒性，主要取决于毒素质粒的存在和缺失，由于α毒素是产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原。所以从分子生物学角度对该毒素的研究具有重要实际意义，并且将对该毒素引起的疾病的预防和诊治起到极大的作用。本实验中将产气荚膜梭菌α毒素经硫酸铵盐析、透析脱盐后，能够较好地提纯α毒素，可以作为一种毒素蛋白的提纯、检测方法，并由此可确定产气荚膜梭菌的毒素类型。该方法能对α毒素进行提纯并获得纯化的毒素，表明通过该方法既除去了大量的杂蛋白和其他物质，又保证了毒素蛋白的质量浓度，最终获得了较纯的产气荚膜梭菌α毒素。此次试验中对饱和度为60%硫酸铵沉淀的α毒素进行实验室快速提取与纯化，并将复性后的α毒素注射小鼠，小白鼠出现腹痛，腹泻并迅速死亡典型临床症状，说明复性的α毒素可直接用于下一步研究。可以进一步获得丧失生物毒性但具有良好免疫原性的α毒素，从而为研制α毒素基因工程亚单位疫苗研制提供理想材料。为进一步开展梭菌毒素的致病机理及制备类毒素疫苗奠定重要的实验基础。

摘要： 通过设计引物及其PCR扩增实验，将实验室所保存的淡水鱼产气荚膜梭茵C型分离菌株的a毒素全长基因进行扩增；将扩增产物进行克隆和核苷酸序列测定，再与Genbank中相应的α毒素基因序列进行同源性比较；构建pet28c-α表达载体，表达并纯化α毒素蛋白。结果表明：通过PCR扩增后凝胶电泳显示，成功扩增出了1200bp的α毒素片段；通过Blast比较，淡水鱼产气荚膜梭菌分离菌株α毒素全基因序列与畜禽源分离株的同源性为98%；成功构建了pet28c-α表达载体，表达并纯化出分子量为45kDa的目的蛋白。

摘要： 本文分离了一株魏氏梭菌,对其分型后克隆了α毒素基因,并与基因库中α毒素基因进行了比较分析,讨论了分析结果.

摘要： 用提取的Ａ型产气荚膜梭菌α毒素包涵体免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取小鼠脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞进行融合和克隆化，经间接ＥＬＩＳＡ筛选，共获得７株稳定分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ａ８、１Ｃ３、１Ｄ５、１Ｄ８、１Ｆ１、１Ｈ１和２Ｅ３。经鉴定，７株ＭｃＡｂ的Ｉｇ亚类有ＩｇＧ１（１Ｄ８）、ＩｇＧ３（１Ａ８、１Ｃ３和２Ｅ３）和ＩｇＭ（１Ｄ５、１Ｆ１和１Ｈ１）。细胞培养上清和腹水抗体效价分别为１：５２～１：１０２４和１：１０〈’６〉～１：１０〈’８〉。尤为重要的是，２Ｅ３杂交瘤细胞株分泌的ＭｃＡｂ不仅能够中和α毒素的磷脂酶Ｃ活性和溶血活性，而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的补动保护作用。

摘要： 本项研究的目的是通过改进培养基及类毒素提取条件选择，提高金黄色葡萄球菌α-毒素的效价，选择更合理的解毒方法，尽量去掉异蛋白以降低金葡菌素副作用。

摘要： 本项研究的目的是通过改进培养基及类毒素提取条件选择，提高金黄色葡萄球菌α-毒素的效价，选择更合理的解毒方法，尽量去掉异蛋白以降低金葡菌素副作用。

摘要： 本项研究的目的是通过改进培养基及类毒素提取条件选择，提高金黄色葡萄球菌α-毒素的效价，选择更合理的解毒方法，尽量去掉异蛋白以降低金葡菌素副作用。

摘要： 本项研究的目的是通过改进培养基及类毒素提取条件选择，提高金黄色葡萄球菌α-毒素的效价，选择更合理的解毒方法，尽量去掉异蛋白以降低金葡菌素副作用。

摘要： 本项研究的目的是通过改进培养基及类毒素提取条件选择，提高金黄色葡萄球菌α-毒素的效价，选择更合理的解毒方法，尽量去掉异蛋白以降低金葡菌素副作用。

摘要： 本发明提供鉴定具有合成腾毒素前体即二氢腾毒素活性的酶，进一步鉴定具有以二氢腾毒素为底物合成腾毒素活性的酶。本发明提供编码如下蛋白质的腾毒素合成相关基因，所述蛋白质由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成且具有二氢腾毒素的非核糖体肽合成活性；以及提供编码如下蛋白质的腾毒素合成相关基因，所述蛋白质由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成且具有将二氢腾毒素转化为腾毒素的活性。

摘要： 本发明公开了一种藻毒素降解菌的分子标记、藻毒素降解菌及藻毒素降解菌的制备方法。所述分子标记的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。所述藻毒素降解菌包括上述分子标记。该藻毒素降解菌的分子标记能够作为特异性标识物能够用于筛选藻毒素降解菌，含有该分子标记的目的基因的感受态细胞能够有效降解藻毒素。本发明实施例提供的制备方法，将启动子构建到含有该分子标记的枯草芽孢杆菌RIK1285后能够得到藻毒素降解菌，且枯草芽孢杆菌RIK1285为分泌型的益生菌，这使得该藻毒素降解菌不仅能够有效分泌藻毒素降解酶，从而降解水体中的藻毒素解决藻毒素污染的问题，而且枯草芽孢杆菌RIK1285具有益生功能，这使得本发明实施例制备的藻毒素降解菌能够在实际中应用。

摘要： 本发明涉及净化伏马毒素B1、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮免疫吸附剂及复合亲和柱。所述的免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的伏马毒素B1单克隆抗体、黄曲霉毒素单克隆抗体、赭曲霉毒素A单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体，所述的伏马毒素抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201636的杂交瘤细胞株Fm7A11分泌产生的单克隆抗体，所述的杂交瘤细胞株Fm7A11已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学。装载有权利要求1所述的伏马毒素B

摘要： 本发明涉及净化伏马毒素B1、黄曲霉毒素B1等五种真菌毒素免疫吸附剂及复合亲和柱。所述的免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的伏马毒素B1单克隆抗体、黄曲霉毒素B1单克隆抗体、赭曲霉毒素A单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体和杂色曲霉毒素单克隆抗体，所述的伏马毒素抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201636的杂交瘤细胞株Fm7A11分泌产生的单克隆抗体,所述的杂交瘤细胞株Fm7A11已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201636。此复合亲和柱可同时用于伏马毒素B1、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉毒素样品的净化检测。

摘要： 本发明涉及净化伏马毒素B

摘要： 本发明公开了一种同时吸附霉菌毒素、内毒素和肠毒素的广谱脱霉剂，该广谱脱霉剂包括以下组份原料：云母粉20‑50份、活化伊利粉50‑100份、蒙脱石10‑30份、沸石粉50‑100份、防腐剂2‑4份、酶制素10‑20份、中药5‑10份、大蒜素4‑8份、矿物质1‑3份。有益效果：该广谱脱霉剂唯一的一个可以同时吸附霉菌毒素、内毒素和肠毒素的产品，独特加工工艺，成份可控，产品质量功能保障安全性高：全天然，杂质及重金属低于欧盟限定最低值，二噁英含量很低，该广谱脱霉剂大大提高了霉菌毒素、内毒素和肠毒素的吸附性，同时刺激食欲及促进消化的作用，可增强饲料的适口性，具备更广的使用范围。

摘要： 一种在基本上是水的系统中通过固相萃取材料从已知的或可疑的含有内毒素的源中去掉或去除内毒素的方法，包括以下步骤：‑提供已知或疑似含内毒素的源，‑使所述已知或疑似含内毒素的源与带正电荷的固相材料接触，所述固相材料的表面固定有三价铁，其中所述固相萃取材料已通过(2‑氨基乙基)胺(TREN)配体固定了三价铁；‑孵育所述已知或疑似含内毒素的源一段时间，所述时间足以将内毒素结合到多孔固相材料上，‑将所述固相材料与所述基本上是水的体系分开，‑任选地分离所述基本上是水的体系，该系统不含或去掉了内毒素。

摘要： 本发明公开了一种同时测定谷物中DON毒素、NIV毒素及ZEN毒素的方法。它包括如下步骤：(1)采用高效液相色谱法分别检测DON毒素、NIV毒素和ZEN毒素的标准品溶液，分别以各标准峰面积为纵坐标，以标准品溶液的浓度为横坐标，进行拟合建立标准曲线；(2)对待测谷物样品进行萃取和多功能净化柱进行分离，收集样品滤液；(3)待测谷物样品中DON毒素、NIV毒素和ZEN毒素含量的测定：按照与步骤(1)相同的色谱检测条件，采用高效液相色谱法测定步骤2)所得样品滤液中组分的峰面积，根据步骤(1)所得标准曲线采用外标法计算，即可得到待测谷物样品中DON毒素、NIV毒素和ZEN毒素的含量。本发明实验过程简、检测效率高、测量结果准确。

摘要： 本发明涉及眼镜蛇科蛇突触后神经毒素、心脏毒素、细胞毒素、磷脂酶A2及粗毒在抗病毒感染上的应用。呼吸道由于它对外界开放式的解剖结构而容易受到病毒的侵袭和感染，病毒性流感和肺炎是日常生活中比较常见的病例；除此以外，乙肝病毒、艾滋病毒也会通过多种途径感染人类致病。病毒性引起的呼吸道疾病目前的治疗手段无论是疫苗还是药物效果都不太理想，病毒性肝炎和艾滋病的治疗效果也有待进一步提高，故开发一种对病毒具有广谱抑制能力而副作用小的产品已成为一种临床急需。眼镜蛇科蛇突触后神经毒素、心脏毒素、细胞毒素、磷脂酶A2及粗毒都显示出其在抗病毒感染上的有效性，有可能成为新的抗病毒产品的候选者。

摘要： 本发明提供鉴定具有合成腾毒素前体即二氢腾毒素活性的酶，进一步鉴定具有以二氢腾毒素为底物合成腾毒素活性的酶。本发明提供编码如下蛋白质的腾毒素合成相关基因，所述蛋白质由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成且具有二氢腾毒素的非核糖体肽合成活性；以及提供编码如下蛋白质的腾毒素合成相关基因，所述蛋白质由SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成且具有将二氢腾毒素转化为腾毒素的活性。