土鳖虫

摘要： 目的:建立QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS)同时测定6种含土鳖虫的成方制剂中9种真菌毒素的方法。方法:样品用QuEChERS方法进行前处理,经10%甲酸乙腈提取,用N-丙基-乙二胺硅烷和无水硫酸镁进行净化,采用UHPLC-MS在多反应监测模式下进行测定,外标法定量。结果:9种真菌毒素的含量在各自质量浓度范围内具有较好的线性关系(r≥0.9956),目标化合物在低、中、高3个质量浓度下的平均回收率为70.42%~101.28%,RSD<12%,定量限(LOQ)为1.2~18.6μg·kg^(–1)。结论:该方法灵敏度高、准确性好,适合于土鳖虫及其成方制剂中9种真菌毒素的测定。

摘要： 目的采用脂质组学方法研究干土鳖虫和甘草制土鳖虫两种饮片中的脂肪油含量。方法以石油醚为提取溶剂,采用连续回流方法提取土鳖虫焙干品和甘草制土鳖虫中的脂肪油,采用脂质组学技术,辅以SIMCA-P 14.0和SPSS 20.0软件,结合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)和Pearson相关性分析对土鳖虫两种不同炮制品中的脂质进行系统分析,并找出其差异成分。结果在土鳖虫干品中鉴定出85个脂质成分,其中甘油脂(GL)37个,脂肪酸(FA)37个,甘油磷脂(GP)10个,固醇脂(ST)1个。经PCA和OPLS-DA分析,结合VIP值和Pcorr的变量,以P<0.05为阈值,得出两种土鳖虫炮制品差异性脂质成分有68个,其中GL 32个,FA 26个,GP 9个,ST 1个。且多种脂质成分在两个炮制品内的相对含量不尽相同。结论不同炮制方法对土鳖虫中的脂质成分影响较大,这为不同土鳖虫炮制品的相关研究提供了基础。

摘要： 目的探讨土鳖虫调控黏结合蛋白聚糖3(SDC3)对胆碱缺乏(CDAA)诱导的非酒精性脂肪性肝炎的作用及其机制。方法18只雄性C57BL/6小鼠随机分为胆碱充足(CSAA)组、CDAA组和胆碱缺乏加土鳖虫(CDAA+T)组。造模第12周开始,CDAA+T组小鼠给予0.108 g/kg土鳖虫(相当于成人用量10倍量)灌胃,CSAA、CDAA组以等体积生理盐水灌胃,18周末取血清和肝组织,检测小鼠肝功能、TC和TG,观测肝组织病理形态学。实时定量PCR检测转化生长因子(TGF)β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col1α1)、SDC3 mRNA表达;检测SDC3在人和小鼠原代肝细胞、肝星状细胞(HSC)、内皮细胞和Kupffer细胞中的表达,应用Si-RNA沉默SDC3,检测SDC3在HSC活化中的作用。蛋白免疫印迹法检测SDC3蛋白表达。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,组内进一步两两比较采用SNK或LSD-t检验。结果与CSAA组相比,CDAA组肝功能(ALT、AST)、血清和肝脏TC、TG水平显著升高(P值均<0.01),CDAA+T组小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平较CDAA组均显著下降(P值均<0.05)。HE染色显示CDAA组脂肪变明显,炎症细胞浸润增多,CDAA+T组炎症细胞浸润减轻;天狼星红染色显示CDAA组胶原增生显著增加,CDAA+T组胶原增生则减少;油红染色中CDAA组脂肪沉积明显,而CDAA+T组脂肪沉积减少。与CDAA组相比,CDAA+T组肝组织TGFβ、SDC3、α-SMA、COL1α1的mRNA表达和SDC3、α-SMA蛋白表达水平显著降低。免疫组化结果显示:SDC3在CSAA组中表达非常低,CDAA组中SDC3表达显著升高,主要在间质细胞,土鳖虫干预后表达显著降低(P值均<0.05)。PCR结果显示:人和小鼠肝脏各类型细胞中SDC3在HSC细胞表达最高(P值均<0.001)。体外培养LX2细胞,土鳖虫处理能显著降低TGFβ诱导的α-SMA、Col1α1上调,基因沉默SDC3后,土鳖虫不能抑制α-SMA、Col1α1升高(P值均<0.05)。结论土鳖虫显著改善CDAA诱导的非酒精性脂肪性肝炎,其机制可能通过调控HSC中SDC3表达实现的。

摘要： 本文对土鳖虫人工养殖技术、真伪鉴别、化学成分、临床药理、有害物质及毒性等方面的研究进行归纳总结,旨在全面客观地报道中药土鳖虫研究取得的成果,对未来科研工作者进一步开发其药用价值提供一定的指导和借鉴。

摘要： 通过搜集古医籍及现代医家临床经验,总结出土鳖虫具有以下特点:1)汤剂用量为4~23.75 g,常用剂量为6~10 g,丸散剂用量为0.1~16.75 g。2)根据疾病、证型、症状寻求最佳用量,如治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、慢性胃炎、慢性肾衰、急性腰扭伤等疾病,可用土鳖虫活血通络止痛,剂量为6~23.75 g,丸散剂量为0.1~16.75 g;各种肿瘤、慢性肝病、慢性萎缩性胃炎、乳腺增生、前列腺增生等疾病,可用土鳖虫活血散瘀、消癥破坚,剂量为4~12 g,丸散剂量为0.1~3.76 g;治疗心脑血管病及其后遗症、偏头痛等疾病,可用土鳖虫活血化瘀、通利血脉,剂量为6~12 g;治疗痛风时常取其利湿化浊之功,剂量为6~10 g。3)根据疾病、证型及症状配伍相应中药,如活血通络止痛配伍露蜂房、当归、鸡血藤、片姜黄、炮山甲、独一味、山茱萸等;活血散瘀、消癥破坚配伍炙鳖甲、水蛭、地龙、昆布、海藻等;活血化瘀、通利血脉配伍川芎、桃仁、蜈蚣、人参;利湿化浊配伍土茯苓、萆薢、威灵仙。

摘要： 为研究土鳖虫脂溶性成分及水溶性成分对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响,将土鳖虫粉用索氏提取法制得石油醚和乙酸乙酯提取物,采用冻融法在不同温度下处理获得不同温度水提物,以噻唑蓝(MTT)法进行细胞增殖活性检测。结果发现,土鳖虫索氏提取物对成骨细胞生长有抑制作用(P0.05)。土鳖虫的25°C水提物的25°C、37°C及50°C二次水提产物对成骨细胞有促增殖的效果,75°C二次水提物无效(P>0.05),100°C二次水提物对细胞生长有抑制作用(P<0.05)。土鳖虫的25°C水提物经50°C处理4、6、8和10 h后对细胞生长有促增殖作用(P<0.05),处理12 h时的提取物对细胞生长有抑制效果(P<0.05)。土鳖虫的水溶性成分对MC3T3 E1成骨细胞有促增殖作用。

摘要： 目的:基于网络药理学分析土鳖虫对破血逐瘀相关疾病的作用机制.方法:经文献查阅并结合PubChem、SwissADME、SwissTargetPrediction和TCMSP等数据库对土鳖虫已知成分及其对应靶点进行搜集,并与经GeneCards、OMIM、TTD、HPO数据库搜索得到的"破血逐瘀"相关靶点进行交互分析得到共同靶点;通过蛋白-蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析、基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析,构建土鳖虫"成分-靶点-疾病"网络,探讨土鳖虫破血逐瘀功效的作用机制.同时采用体外纤溶实验评价土鳖虫水溶性蛋白质与其他成分的活性差异.结果:筛选得到土鳖虫活性化合物54个,共对应靶点653个;与血瘀相关的17种疾病的16141个作用靶点经交互分析得出两者共有靶点26个.GO和KEGG分析结果表明,土鳖虫已知成分主要涉及嘌呤代谢通路、细胞能量代谢通路、环磷酸鸟苷(cGMP)信号通路、Toll样受体信号通路、醛固酮合成代谢通路、三酰甘油合成通路等13条信号通路,通过干预DNA转录、细胞能量代谢等生物功能发挥药效.同时体外纤溶实验得出土鳖虫水溶性蛋白质较其他成分表现出更强的纤溶活性.结论:土鳖虫已知活性成分并不能很好的证明其对破血逐瘀相关疾病的治疗有显著的效果.结合土鳖虫水溶性蛋白质促纤溶作用,为下一步土鳖虫纤溶物质基础的研究提供参考.

摘要： 为研究土鳖虫脂溶性成分及水溶性成分对MC3T3-E1成骨细胞增殖活性的影响,将土鳖虫粉用索氏提取法制得石油醚和乙酸乙酯提取物,采用冻融法在不同温度下处理获得不同温度水提物,以噻唑蓝(MTT)法进行细胞增殖活性检测.结果发现,土鳖虫索氏提取物对成骨细胞生长有抑制作用(P＜0.05).土鳖虫的25°C水提物对成骨细胞有促增殖作用(P＜0.001),最大促增殖率为39.8％;50和90°C水提物对成骨细胞生长无影响(P＞0.05).土鳖虫的25°C水提物的25°C、37°C及50°C二次水提产物对成骨细胞有促增殖的效果,75°C二次水提物无效(P＞0.05),100°C二次水提物对细胞生长有抑制作用(P＜0.05).土鳖虫的25°C水提物经50°C处理4、6、8和10 h后对细胞生长有促增殖作用(P＜0.05),处理12 h时的提取物对细胞生长有抑制效果(P＜0.05).土鳖虫的水溶性成分对MC3T3-E1成骨细胞有促增殖作用.

摘要： 笔者认为导致肝纤维化的病机为正虚血瘀,毒瘀内蕴,肝体失养,肝用不畅,气血运行涩滞,化而为积.笔者团队拟通络除瘀、滋阴软坚法,并效景岳之尤,参选具有抗肿瘤活性及多靶点的单味中药,提出"抗肝纤维化药中四维",其中土鳖虫、姜黄为抗肝纤维化之"良将",破血逐瘀、通经止痛用于先;鳖甲、白芍为抗肝纤维化之"良相"滋阴柔肝、补损缓中养肝体,一破一养,一气一血,攻补兼施,相须为用,增其疗效,从而调节肝损伤和肝再生的动态平衡.

摘要： 中医药在恶性肿瘤的治疗中有着几千年的历史,发挥着不可替代的作用.随着虫类药物的抗肿瘤成分不断被发现、研究,其在恶性肿瘤的治疗中运用越来越广泛.骨肿瘤的发生途径较多,转移性骨肿瘤较为多见,且其引起的疼痛症状严重影响患者的生活质量;因此,对骨肿瘤的研究不容轻视.但是,相较于其他恶性肿瘤的研究,对于骨肿瘤的研究甚少,故笔者查阅古籍及近年来文献,总结了虫类药物在骨肿瘤中的研究及运用现状,以供其他研究者参考.现对骨肿瘤的研究综述如下.

摘要： 目的：建立高效毛细管电泳(HPCE)法研究土鳖虫Eupolyphaga seu Steleophaga镇痛作用与其指纹图谱的关系.方法：分析采用熔融硅胶毛细管(75μm,30cm×21cm);10mmol/L硼砂(pH=9.7)为缓冲液;进样电压5kV10s;分离电压15kV;检测波长214nm.然后,通过醋酸致小鼠扭体实验来探索各组分对镇痛作用的影响.结果：土鳖虫指纹图谱中有7个特征峰,其中有2个为尿囊素与氯氮卓.两者的含有量与土鳖虫的镇痛作用成正比关系.结论：各批次土鳖虫样品间存在差异,其镇痛作用可用于质量评价.

摘要： 目的：建立土鳖虫多种氨基酸的HPLC指纹图谱,并测定其主要氨基酸成分的含量. 方法：0.1mol·L-1盐酸超声处理提取游离氨基酸,6mol·L-1盐酸水解土鳖虫蛋白,以OPA为衍生试剂,采用HPLC法测定土鳖虫药材中的氨基酸含量.色谱条件：色谱柱为Thermo Hypersil GOLD aQ柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相A为磷酸盐缓冲液(0.1mol·L-1,pH=6.89),流动相B为甲醇,激发波长340nm,发射波长450nm,流速1mL·min-1,柱温30°C,采用梯度洗脱,建立土鳖虫的指纹图谱. 结果：17种氨基酸衍生物在60min内分离完全,各氨基酸浓度在一定范围内成线性,相关系数均大于0.9990.采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件进行相似度评价,10批药材相似度均不低于0.990. 结论：初步建立了土鳖虫氨基酸的HPLC指纹图谱,标定共有峰21个,定量分析了17种氨基酸成分.

摘要： 目的：通过体外细胞实验考察土鳖虫抗凝活性组分对过氧化氢损伤的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的保护作用.方法：通过MTT法细胞毒性实验确定给药剂量;建立HUVEC细胞损伤模型,以LDH漏出率为指标,考察土鳖虫抗凝活性组分对细胞的保护作用.结果：与空白组及模型组比较,土鳖虫抗凝活性组分在250～4000 mg·L-1浓度范围内能使LDH漏出率降低,且当药效大于48小时趋于稳定,表明土鳖虫抗凝活性组分具有抑制和改善过氧化氢对血管内皮细胞的损伤作用.结论：土鳖虫抗凝活性组分可一定程度保护血管内皮细胞,具有后续研究价值.

摘要： 目的：以PT、APTT、TT、FIB、血小板聚集率及纤溶图参数为指标,评价土鳖虫抗凝组分F2-2的体内抗凝药效.方法：大鼠皮下注射肾上腺素造成急性血瘀症模型后,对模型大鼠灌胃给药土鳖虫抗凝组分F2-2,9d后,对各指标进行测量.结果：与空白组相比,灌胃给药后的大鼠PT/APTT均延长、FIB含量升高、血小板聚集率与血液最大凝固程度下降,TT则无差异.结论：土鳖虫抗凝组分F2-2有很好的体内抗凝药效.

摘要： 目的:采用溶剂萃取和凝胶柱色谱法对土鳖虫胰酶解物进行分离纯化，初步确定其抗凝活性部位及化学成分组成。rn 方法:应用胰酶酶解法制备土鳖虫胰酶酶解物，以APTT 凝血时间为指标，采用溶剂萃取法，获得抗凝活性部位IV，经凝胶柱色谱法对其进行进一步分离纯化获得胰酶酶解纯化物，采用考马斯亮蓝法对其进行定量，通过MALDI-TOF-MS 法检测分离部分的分子量分布范围。rn 结果:土鳖虫胰酶酶解物部位IV 有较强的抗凝活性，其抗凝活性强度与浓度相关；部位IV 经Sephadex G-25 纯化后考马斯亮蓝法测得其蛋白含量为 5.5%；进一步用Sephadex G-10 脱盐的纯化物，采用MALDI-TOF-MS 检测确定为分子量在 850～910Da 间的3 组多肽混合物。rn 结论:体外抗凝实验表明，凝胶柱色谱法分离纯化土鳖虫胰酶酶解物方法可行，抗凝活性组分为小于1000Da的小分子肽类。

摘要： 本文以男性患者生吃土鳖虫引发脑病的病例进行分析，主要描述了该患者的临床症状和病理诊断，怀疑土鳖虫体内的寄生虫感染所致，于是从当地收集土鳖虫28作解剖，分头，胸、腹及足四大部分组织进行观蔡。结果发现:1)在腹部血腔内有一种线虫,每个土鳖虫均有,最少者2条,最多者达42条,大的虫体(雌虫)长约为0.4mm,宽约为0.1mm,体透明,在不染色的条件下可清晰见到内部器官,其中多数还可见子宫内虫卵,尾尖呈长尾杆型,小的虫体(雄虫)长约为0.26mm,宽约为0.04m,虫体透明可见内部器官,同样具长尾杆;2)在消化道内发现一种纤毛虫,但只有少数土鳖虫体内才有.线虫及原虫，但均未见本线虫形态结构的描述。为验证此患者脑部病变是否为刺线虫所感染，用线虫制备抗原检测了生吃土鳖虫后第30-50天感染期的患者血清中抗体，但结果均为阴性，为此认为:此种线虫侵入人体组织后虽可致病但由于死亡快，不足以诱导人体产生抗体应答，特别是侵入脑部组织的病原则更不容易诱发免疫应答;进一步的诊断还得依赖于用当地土鳖虫直接感染动物或用其体内的线虫直接感染动物获得证据(此实验目前在进行中)。该患者在住院期间经脱水、抗感染和抗线虫治疗而基本康复出院。

摘要： 本发明属于中药复方制剂鉴定领域，公开了一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法。该方法包括(1)土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤；(2)PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤；(3)扩增产物电泳鉴定步骤。通过该方法能够成功提取土鳖虫基因组DNA，并扩增出土鳖虫线粒体16S rRNA片段，从而准确鉴定土鳖虫的真伪、种类、产地以及胶囊中是否含有土鳖虫。

摘要： 本发明涉及糖蛋白提取技术领域，尤其涉及一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，该方法包括下列步骤：(1)预处理：土鳖虫清洗、烘干和粉碎；(2)脱脂处理：加入脱脂溶剂进行超声处理；(3)糖蛋白的提取：微波辅助浸提及水浴浸提；(4)糖蛋白的纯化：乙醇分级沉淀及复合酶酶解法来除去游离的蛋白质，进行超滤，冷冻干燥得到糖蛋白。本发明中的提取纯化方法，操作简单，条件温和，能有效去除游离蛋白质，同时还不破坏糖蛋白的活性，大大提高了糖蛋白的提取效率。

摘要： 本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及一种土鳖虫多肽的制备方法，该方法包括下列步骤：(1)预处理：土鳖虫清洗、匀浆；(2)一次酶解：加入无花果蛋白酶酶解；(3)发酵处理：加入混合菌种进行发酵；(4)二次酶解：加入胰蛋白酶酶解；(5)超滤处理。本发明中制备方法，得到的土鳖虫多肽质量好，而且土鳖虫多肽的提取率高，能抑制离体胃癌细胞的生长。

摘要： 本发明属于中药复方制剂鉴定领域，公开了一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法。该方法包括(1)土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤；(2)PCR扩增土鳖虫16S rRNA步骤；(3)扩增产物电泳鉴定步骤。通过该方法能够成功提取土鳖虫基因组DNA，并扩增出土鳖虫线粒体16S rRNA片段，从而准确鉴定土鳖虫的真伪、种类、产地以及胶囊中是否含有土鳖虫。

摘要： 本发明属于中药检测技术领域，具体公开了一种土鳖虫水提取物及其制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，(1)供试品溶液的制备；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，流动相包括水溶液和乙腈，梯度洗脱程序包括：0→10‑15min→17‑25min，流动相中乙腈的体积百分数为：90‑92％→90％→65‑88％。以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，流动相包括水和乙腈，通过优选梯度洗脱程序，最终仅使用2个洗脱程序即可得到5个共有特征峰，并实现了包括尿嘧啶和次黄嘌呤在内的共有特征峰的分离，洗脱程序简单，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离度高。

摘要： 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及COI基因、引物对、试剂盒及其在土鳖虫真伪鉴定中的应用。本发明所述COI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对土鳖虫药材及其混伪品大量DNA条形码序列的筛选比对确定，SEQ ID NO.1所示的序列可作为鉴别土鳖虫的分子标志物。本发明实施例中，根据土鳖虫正品的COI基因序列设计的特定引物，可以特异性的鉴定出土鳖虫正品，且机器型号对扩增无显著影响；本发明提供的鉴定方法，不仅可以特异性的鉴定出土鳖虫正品，且具有灵敏度高的优势，可以鉴定模板量在1.5ng～71.9ng的样品。

摘要： 本发明公开了基于高效液相色谱(HPLC)法的活血止痛胶囊中土鳖虫的鉴别方法，包括以下测定条件及步骤：S1对照溶液的制备，S2供试品溶液的制备，S3色谱分析条件，S4特征峰图谱确定，S5鉴别，将特征峰图谱与三批活血止痛胶囊内容物检测的特征图谱进行比对，根据特征峰的有无即可判定活血止痛胶囊的质量。本发明利用高效液相色谱分析技术，采用特征峰图谱对照方式，可以快速高效地检测出活血止痛胶囊质量以及掺伪情况；本发明中的土鳖虫的特征峰检测方式方便快捷，供试品制备简单，准确性高，在液相色谱仪的帮助下可以有效快速地监控活血止痛胶囊中土鳖虫药材的质量，从而保障产品的质量稳定、可控，杜绝假冒伪劣药材的混入。

摘要： 本发明公开了一种具有抗肝癌和抑制肝纤维化功效的土鳖虫蛋白提取物，其制备方法为：取干燥土鳖虫打粉，加入乙醇中，回流提取，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，冷冻干燥，得土鳖虫乙醇提取物EE粉末；将土鳖虫乙醇提取物EE粉末溶解于Tris‑HCl缓冲液中，将硫酸铵添加到溶液中至饱和状态，搅拌，静置，离心，收集沉淀，复溶后透析以脱除盐分，冷冻干燥可得土鳖虫粗蛋白样品EEP。本发明通过大量实验筛选，对土鳖虫蛋白成分系统深入研究，分离出了活性蛋白部位EEPC及活性蛋白成分PC3‑III，活性蛋白部位EEPC及活性蛋白成分PC3‑III通过抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移来共同发挥抗肝癌药效，并且能通过抑制活化的HSC细胞增殖来延缓肝纤维化的进程。

摘要： 本发明涉及土鳖虫喂养领域，具体涉及一种土鳖虫精细化喂养方法，一种土鳖虫精细化喂养及入药方法，采用古法与新技术结合的方式进行喂养与入药，整体包括如下步骤：S1、建造饲养池；S2、选成虫投放，所述成虫生长期在6个月以上，投放至临时容器中；S3、喂养管理；S4、杂物清除；S5、除死虫管理；S6、成虫炮制。本发明具有成虫喂养成活率高、成本低、便于规模化推广的效果。

摘要： 本发明涉及中药药物分析方法技术领域，尤其是涉及一种含水蛭、全蝎、僵蚕和/或土鳖虫的制剂的鉴别方法及其应用。所述鉴别方法，包括如下步骤：采用UPLC‑QqQ/MS对制剂的供试品溶液进行检测，获得MRM色谱图；液相色谱条件：色谱柱为Hss T3C18色谱柱；柱温为30±5°C；以甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱；质谱条件：ESI+模式，采用多反应监测采集方式。本发明采用上述方法可对含水蛭、全蝎、僵蚕、土鳖虫4味动物药中的任一种或多种的制剂进行定性鉴别，该方法专属性强、灵敏度高，可以有效提高制剂的质量控制。