哺乳动物细胞

摘要： 合成基因组学通过设计与合成大片段DNA序列,开展基因组尺度的工程化改造或从头合成,从而揭示基因型和表型的关联,并构建预定功能的生物。正如在大肠杆菌、酿酒酵母等低等模式生物中合成基因组学的实践,对哺乳动物基因组的大片段DNA设计再造也必然会加深对更为复杂的动物基因组的理解并加强对基因组的功能重塑。面对生命健康领域存在的重大挑战,设计合成哺乳动物大片段DNA为其提供了新的思路和解决方案,特别是在染色体疾病模型构建、人源化免疫系统等方面展示出独特的应用潜力。然而,目前大片段DNA在哺乳动物细胞中的设计和操纵仍是一个巨大的挑战,面临着高等哺乳动物基因组注释不完善、复杂序列组装困难、穿梭载体通用性差、大片段DNA转移低效等问题。本文围绕设计-组装-转移的技术路线,评述哺乳动物合成基因组学领域的重要研究进展,详细介绍重要的技术突破,并展望哺乳动物合成基因组学在医药健康领域的应用。

摘要： 为提高哺乳动物悬浮细胞表达系统用于日常膜蛋白表达制备的实用性、可控性及效率,改善传统工艺缺乏快速检测和质控的方法、缺乏快速且高通量的目的蛋白及融合标签的筛选策略等方面的不足,设计了新的pf系列质粒,优化并建立关联的检测方法,实现了病毒滴度在转染和扩增阶段的随时监测,并缩短了定量测量病毒感染效力的周期;同时设计了新的筛选策略和ESNX质粒系列,实现了目的蛋白和融合标签质粒库的快速构建以及对其表达效果的快速、高通量检测筛选。基于新质粒和对应使用方案的膜蛋白表达制备新体系提高了效率、实用性和可控性,可以简单地再现并用于各实验室,为膜蛋白的结构、功能等各方面研究提供助力。

摘要： 随着生物制品行业的快速发展,哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术已经运用到越来越多的领域中.该技术能够扩大哺乳动物细胞培养的规模,提高生物制品的产量及质量,拓宽哺乳动物细胞的应用领域,并促进哺乳动物细胞生产实现工业化与产业化.但悬浮驯化后的细胞,与父母代细胞相比,蛋白表达水平与生长调节通路均发生了不同程度的改变,使其生产性能受到影响.对此,国内外学者开展了大量的研究并取得了较好进展.作者阐述了哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的研究现状以及临床生产工艺的优化策略,以期为哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的发展提供参考.

摘要： pH传感器成为生物反应器上必不可少的过程分析类传感器——在工艺开发或生产中,使用人员该如何选择pH传感器,以获得最佳的使用体验呢?全球生物制药市场规模逐年增长,蛋白类药物和疫苗成为主要细分领域。整个生物制药加工过程中,生物反应器是上游生产的核心设备。按照培养的细胞类型统计,75%的生物反应器用于培养哺乳动物细胞。

摘要： 设计了一种新型玻底载液装置,实现了低成本的细胞培养与观测.采用下载器支撑载物玻片,硅胶垫密封上载器和载物玻片,既实现了装置稳定的载液功能,又方便装置拆卸以进行灭菌和更换零件,实现器件的重复使用.经过细胞培养、显微成像、灭菌等实验证明,该载液观察装置满足激光共聚焦显微镜承载厚度<0.17 mm的成像要求,能够直接用于哺乳动物细胞长时间培养并进行观测.它具有可装载于普通载玻片支架、可重复使用、成本低的特点.

摘要： 为了建立鉴定治疗性单克隆抗体识别蛋白质抗原表位的方法,选择程序死亡受体-1 (PD-1)作为目的蛋白.基于丙氨酸扫描策略,建立了定点突变技术和哺乳动物细胞表达系统相结合的抗原突变体快速表达方法,确定了真核表达元件扩增和细胞转染表达的条件.共表达了150个PD-1蛋白突变体,鉴定了这些突变体与抗PD-1抗体帕博利珠单抗的结合能力.根据蛋白突变体与抗体的结合力并结合蛋白结构分析确定了帕博利珠单抗的抗原表位,与已报道的基于晶体结构的抗原表位高度一致,表明本方法操作简单、准确性高,可用于治疗性单克隆抗体的抗原表位作图.

摘要： 杆状病毒是一类专职感染无脊椎动物的病毒,目前表达载体和基因转导载体广泛应用于科学研究和生物医药领域.研究在杆状病毒Bac-to-Bac操作系统基础上将杆状病毒载体改造成能在哺乳动物细胞内表达外源基因的载体.首先,将Bac-to-Bac操作系统中pFastBac-Dual质粒中的PH和p10启动子替换成巨细胞病毒(CMV)启动子和真核生物延伸因子(EF1)基因的启动子;然后将egfp基因和mCherry基因分别插入到EFI启动子和CMV启动子下游;通过转座获得表达egfp和mCherry基因的重组杆状病毒基因组,并转染Sf9细胞获得重组杆状病毒.重组杆状病毒可以在昆虫细胞和哺乳动物细胞内产生绿色荧光和红色荧光,表明以CMV启动子和EF1启动子构建的重组杆状病毒既可以在昆虫细胞内表达外源基因,又可以通过转导在哺乳动物细胞内表达外源基因.该载体可以应用于特殊蛋白的真核表达和基因治疗药物的研究开发.

摘要： 细胞培养工艺放大是生物抗体药物从实验室工艺走向临床和商业生产的必经之路,基于生物反应器的大规模细胞培养技术是制药企业的核心竞争力.哺乳动物细胞对环境变化高度敏感,大小规模反应器中工艺表现不一致成为放大的主要挑战,其中高二氧化碳分压(pCO2)问题给大规模反应器中细胞生长、代谢和蛋白产量与质量带来严重影响.二氧化碳(CO2)积累主要来自于细胞代谢产生CO2与反应器传质水平的失衡.通过分析CO2积累的原因,从培养工艺的优化和放大参数的合理设计两方面总结了降低大规模CO2积累的方法,最后结合新型大规模反应器pCO2预测模型,为工艺放大过程中pCO2的有效控制提供参考.

摘要： 生物技术药物是21世纪医药工业发展的中坚力量,其中单克隆抗体类药物是生物技术药物的典型代表,是恶性肿瘤、自身免疫病等领域全球销售额最高的药品种类.在抗体药物发展的几十年里,随着基因工程、蛋白质工程等领域的发展,抗体生产的宿主细胞建立、表达、纯化等各阶段的技术均不断取得突破,文中综述和讨论了抗体药物生产所采用的真核哺乳动物细胞表达系统、原核大肠杆菌表达系统、转基因动物反应器、无细胞蛋白质合成系统以及相关的关键技术进展.

摘要： 目的：在哺乳动物细胞中表达并纯化单纯疱疹病毒Ⅱ型表面糖蛋白C(glycoprotein C,gC)胞外抗原表位富集区片段,对其免疫活性进行分析.方法：优化筛选HSV-2 gC蛋白胞外抗原富集区基因序列并化学合成,以pMCE5为载体构建,构建真核表达质粒pMCE5-gC2并转染至CHO细胞进行真核表达,亲和层析纯化重组蛋白.以纯化的gC2重组蛋白为抗原,混合弗氏佐剂免疫小鼠,制备抗血清,间接ELISA法检测其效价.结果：成功构建真核表达重组质粒pMCE5-gC2,并纯化获得浓度为401tg/ml的gC2重组蛋白.通过三次免疫小鼠,获得抗体效价达到3×108的高滴度的抗血清.讨沦：在哺乳动物细胞中表达纯化获得的gC2重组蛋白具有良好的免疫原性,为HSV亚单位疫苗及检测试剂的研制打下了良好的基础.

摘要： 目的：探讨在哺乳动物细胞中表达的截短形式的单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV—2)包膜糖蛋白D(gD)作为单纯疱疹病毒亚单位疫苗候选疫苗的可行性。方法：Anthewin软件分析单纯疱疹病毒Ⅱ型包膜糖蛋白D(gD2)胞外区氨基酸序列,筛选抗原表位富集区,选用真核细胞及原核细胞均偏爱的密码子,化学合成全新的基因片段。将化学合成的基因gD2克隆到真核表达载体pCEP4中,构建重组质粒pCEP4—gD2,用脂质体转染法转染至CHO细胞中进行筛选、表达。表达的细胞上清上镍柱,用亲和层析的方法纯化表达的蛋白。96孔板包被纯化的gD2蛋白,羊抗HSV1+HSV2多抗检测蛋白抗原性。用纯化的重组蛋白联合福氏佐剂免疫6—8周龄雄性昆明小鼠,常规方法制备血清,间接ELISA检测小鼠体液免疫应答水平。结果：成功构建出真核重组质粒pCEP4—gD2,经测序基因序列完全正确。重组质粒转染至CHO细胞经选择性抗生素筛选后收集细胞上清进行SDS—PAGE电泳检测及WesternBlot检测,gD2蛋白样品在相对分子量46kD处出现特异性蛋白带,分子量符合预期大小,而空质粒载体转染组均没有此相应的蛋白质条带。ELISA检测蛋白抗原性,其OD值与蛋白浓度有良好线性关系,表明蛋白具有较好的抗原性。制备的小鼠抗血清用间接ELISA测抗体效价,结果显示制备的重组蛋白有较好的免疫原性。讨论：利用真核表达系统得到的重组蛋白gD2具有良好的免疫原性及抗原性,为单纯疱疹病毒亚单位疫苗候选疫苗的选择提供了实验依据。

摘要： 目的：研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建、以及在哺乳动物细胞中的表达.方法：用RT—PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因，用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因，将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体，并转染293细胞研究其表达和活性.结果：成功得到重组人活性蛋白C基因，并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞荻高效表达以及相关活性数据.结论：通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因，并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达.

摘要： 本文利用逆转录病毒载体特点构建针对人野生型p53的发夹环RNA(shRNA1、shRNA2和shRNA3),检测其对哺乳动物细胞中p53基因的干扰作用.

摘要： 近年来RNA干扰(RNAi)已成为分子生物学研究领域的新热点,尤其是在哺乳动物细胞的研究中,取得了一些突破性进展,为今后分析和研究目的基因功能、肿瘤和病毒性疾病基因治疗开辟了一条新的有效途径.

摘要： 单克隆抗体药物特异性高且疗效显著,是近年来研究的热点药物之一,在肿瘤的诊断与治疗、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等方面具有广阔的应用前景.抗体药物治疗的特点是所需剂量大且治疗周期长,故市场需求量巨大.因此,基于大规模生物反应器的哺乳动物细胞(特别是CHO细胞)培养技术已逐渐成为生产单抗药物的核心技术.哺乳动物细胞培养技术包括工程细胞株的筛选、无血清培养基的开发与优化、生物反应器培养工艺的优化等环节.本文重点介绍无血清培养基的发展、分类及优化策略.抗体产量与宿主细胞生存环境密切相关.因此通常在无血清培养基中添加一些额外的营养物质如糖类、氨基酸、脂类、维生素及微量元素等,以增加细胞密度、活率和延长培养周期,最终提高抗体产量.利用实验设计(DOE)的方法可以快速且高效的得到最优的无血清培养基配方及生物反应器的培养条件,从而建立经济高效的单抗体药物生产工艺.

摘要： 目的：利用哺乳动物细胞体外培养系统研究封堵器诱导的基因突变.方法：利用V79细胞,在含有和不含有代谢活化系统中加入不同浓度受试物的浸提液,细胞经一定时间作用后重新接种,测定细胞毒性,同时经过一定表达时间后,通过选择性和非选择性培养基上的细胞集落数计算突变频率.结果：在本试验中,既不存在突变频率随浓度增加而升高的浓度-效应关系,也未出现某一测试浓度突变频率的显著增加,此样品的突变试验为阴性反应.结论：此受试物封堵器不能引起本试验中培养的哺乳动物细胞基因突变.

摘要： 以细胞克隆法和双链断裂模型研究了羟自由基、(射线和125.5keV/(m碳离子束对B16细胞和V79细胞的致死效应.结果表明:三种处理对细胞都有明显的致死作用,剂量越大,效果越明显;重离子束的致死效应比(射线强,而且对抗常规辐射的黑色素瘤也有效,证明了重离子治癌的优势;羟自由基与DNA的作用没有一次击中的成分,碳离子束则以一次击中为主,(射线介于两者之间:两种细胞对羟自由基的敏感性与对电离辐射的敏感性不同,提示电离辐射的间接作用不是简单的自由基行为.

摘要： 以细胞克隆法和双链断裂模型研究了羟自由基、(射线和125.5keV/(m碳离子束对B16细胞和V79细胞的致死效应.结果表明:三种处理对细胞都有明显的致死作用,剂量越大,效果越明显;重离子束的致死效应比(射线强,而且对抗常规辐射的黑色素瘤也有效,证明了重离子治癌的优势;羟自由基与DNA的作用没有一次击中的成分,碳离子束则以一次击中为主,(射线介于两者之间:两种细胞对羟自由基的敏感性与对电离辐射的敏感性不同,提示电离辐射的间接作用不是简单的自由基行为.

摘要： 以细胞克隆法和双链断裂模型研究了羟自由基、(射线和125.5keV/(m碳离子束对B16细胞和V79细胞的致死效应.结果表明:三种处理对细胞都有明显的致死作用,剂量越大,效果越明显;重离子束的致死效应比(射线强,而且对抗常规辐射的黑色素瘤也有效,证明了重离子治癌的优势;羟自由基与DNA的作用没有一次击中的成分,碳离子束则以一次击中为主,(射线介于两者之间:两种细胞对羟自由基的敏感性与对电离辐射的敏感性不同,提示电离辐射的间接作用不是简单的自由基行为.

摘要： 本发明公开了一种使用电磁射线治疗各种皮肤病的方法。尤其优选窄带、多色电磁射线发射器，该发射器的主发射波长对应于被对准治疗的哺乳动物组织的峰值吸收波长。还公开了一种局部成分，用于对被对准的组织进行预处理以改变该组织的峰值吸收波长。

摘要： 本发明公开了一种使用电磁射线治疗各种皮肤病的方法。尤其优选窄带、多色电磁射线发射器，该发射器的主发射波长对应于被对准治疗的哺乳动物组织的峰值吸收波长。还公开了一种局部成分，用于对被对准的组织进行预处理以改变该组织的峰值吸收波长。

摘要： 本发明涉及一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用，属于生物技术领域。本发明利用人工合成的内含子，构建哺乳动物细胞重组表达载体，可以增强转录产物的稳定性，进而提高外源基因的表达量，降低哺乳动物细胞重组蛋白的生产成本。

摘要： 本发明涉及一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，在反应器中用含有甘油的培养基培养哺乳动物细胞，每代次生长至24～30h后，将反应器迅速降温，使所述哺乳动物细胞在4°C下进行低温胁迫培养0.5～1h，随后将反应器升温，使低温胁迫培养后的哺乳动物细胞在37°C培养16～18h，获得基本处于细胞周期同步化生长状态的动物细胞。本发明操作简单，安全、方便、规模大，对研究细胞同步化生长、群体代谢、病毒增殖、蛋白表达有着重大的应用价值。

摘要： 本发明涉及一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用，属于生物技术领域。本发明利用人工合成的内含子，构建哺乳动物细胞重组表达载体，可以增强转录产物的稳定性，进而提高外源基因的表达量，降低哺乳动物细胞重组蛋白的生产成本。

摘要： 本发明涉及一种人工合成的polyA、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及应用，属于生物技术领域。本发明polyA可用于哺乳动物细胞重组表达载体，polyA可以通过控制mRNA的稳定性，提高mRNA的翻译效率来增强哺乳动物或者其他来源蛋白质的分泌表达，能有效提高哺乳动物细胞中蛋白质的产量并降低生产成本。

摘要： 本发明提供了通过增量或减量调节哺乳动物细胞中的炎性介质的本地体内水平来治疗哺乳动物中的肺部疾病状态的新方法，包括使所述哺乳动物细胞与治疗有效量的炎症调节剂接触，其中所述炎性介质选自由细胞因子、转化生长因子-β、弹性蛋白酶和白细胞构成的组，其中所述炎症调节剂选自由丙酮酸盐和丙酮酸盐前体构成的组。

摘要： 公开了在哺乳动物细胞中表达外源基因的方法,其包括用基因组中携带外源基因的非哺乳动物病毒,例如杆状病毒感染细胞,并在使基因得以表达的条件下培养细胞。使用例如附图中描述的转移载体将外源基因送入哺乳动物。另外还公开了给细胞提供治疗上有效量的其基因组载体外源基因的病毒并在可使外源基因在哺乳动物体内得以表达的条件下增殖细胞,以治疗哺乳动物的基因缺陷性疾病的方法。

摘要： 本发明涉及一种在动物细胞反应器中同步化悬浮培养哺乳动物细胞的方法，在反应器中用含有甘油的培养基培养哺乳动物细胞，每代次生长至24～30h后，将反应器迅速降温，使所述哺乳动物细胞在4°C下进行低温胁迫培养0.5～1h，随后将反应器升温，使低温胁迫培养后的哺乳动物细胞在37°C培养16～18h，获得基本处于细胞周期同步化生长状态的动物细胞。本发明操作简单，安全、方便、规模大，对研究细胞同步化生长、群体代谢、病毒增殖、蛋白表达有着重大的应用价值。

摘要： 本发明涉及使用哺乳动物细胞以在哺乳动物细胞中高效生产靶材料的细胞培养基、使用所述细胞培养基的细胞培养方法以及生产所述靶材料的方法，并且更特别地涉及在培养物中包含浓度为30μM或更高的Zn离子、其盐或螯合化合物的细胞培养基、使用所述细胞培养基的细胞培养方法，以及生产靶材料的方法。根据本发明，可提供用于通过使用哺乳动物细胞来生产重组蛋白的细胞培养基，其在提高抗体产量方面可取得优异的效果而不表现出任何细胞生长抑制作用。