二甲双胍在制备治疗手足口病的药物中的应用

摘要

本发明提供一种二甲双胍在制备治疗手足口病的药中的应用，本发明提供的二甲双胍具有显著的抗引起手足口病的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CVA16)复制的作用，该抗病毒作用与二甲双胍现有的临床应用不同，存在广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药用途领域，特别涉及二甲双胍在制备治疗手足口病的药物中的应用。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CVA16)均为开环单正链的RNA病毒，均属于小RNA病毒科肠道病毒属，二者是引起儿童手足口病(HFMD)的主要病原体，可造成严重的社会危害。

2015年12月，国家食品药品监督管理总局批准了北京科兴生物制品有限公司和中国医学科学院医学生物学研究所研发的预防用生物制品1类新药-肠道病毒71型灭活疫苗生产注册申请，疫苗于2016年上半年正式上市。根据中国法定传染病报告，疫苗上市以来，手足口病的发病人数出现了下降，说明该疫苗确实起到一定预防保护作用。但是由于EV71亚型众多，该疫苗是否能够预防所有亚型的EV71感染尚不清楚，而且其对同样能引起手足口病的柯萨奇病毒A16等肠道病毒没有交叉保护作用。另外，由于目前EV71灭活疫苗属于非免疫规划疫苗，全国范围内婴幼儿接种率还不是很高，因此手足口病的的治疗仍是一个至关重要的问题。目前临床上没有针对EV71和CVA16感染的特效药物，临床上多采用干扰素(interferon，IFN)和利巴韦林(RBV)以及中药等进行对症治疗。因此迫切需要研发治疗手足口病的药物。

二甲双胍临床上适用于单纯饮食控制不满意的非胰岛素依赖型糖尿病人，文献报道二甲双胍具有抗肿瘤、免疫调节、降糖及抗病毒的作用。其中，文献报道二甲双胍具有抑制多种病毒的作用，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、柯萨奇病毒B3等，但是目前文献中尚无二甲双胍在抗引起手足口病的EV71和CVA16方面的应用。

发明内容

本发明提供一种二甲双胍在制备治疗手足口病的药物中的应用。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种式一所示的二甲双胍在制备治疗手足口病的药中的应用，

本发明所述的二甲双胍能剂量依赖性降低细胞内能够反映活病毒含量的EV71和CVA16的病毒滴度。

本发明所述的二甲双胍通过下调EV71和CVA16的受体蛋白人清道夫受体B2的水平，从而降低病毒的吸附结合发挥抗病毒作用。

本发明所述的二甲双胍具有显著抗EV71和CVA16复制的作用。

式一所示的二甲双胍、其溶剂合物或药学可接受的盐在制备治疗手足口病药物中的应用。

本发明式一所示的二甲双胍可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等。一般来说，与药学可接受的溶剂如水、乙醇等形成的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。

本发明所述的药学可接受的盐，可以是盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐。

本发明式一所示的二甲双胍还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术，本发明对此不做限制。

本发明式一化合物或其药学可接受的盐还可以以晶体存在，本发明包含式一所示的二甲双胍或其药学可接受的盐的任意晶型。

本发明式一所示的二甲双胍、其溶剂合物或药学可接受的盐可以通过以下途径给药：胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、肌内途径或作为吸入剂。

本发明式一所示的二甲双胍、其溶剂合物或药学可接受的盐可以药物制剂的形式给药，该药物组合物包括式一所示的二甲双胍、其溶剂合物或药学可接受的盐及药学可接受的载体或辅料。

本发明的式一所示的二甲双胍、其溶剂合物或药学可接受的盐可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明式一所示的二甲双胍、其溶剂合物或药学可接受的盐还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液，也可以是冻干形式。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

本发明的药物制剂包括药学上可实施的任何制剂，例如口服制剂、肠胃外给药制剂等。

1.应用CCK细胞活性检测试剂检测了二甲双胍在对人结肠癌细胞HCT-8的毒性；同时观察各药物浓度对细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)情况，以确定二甲双胍在细胞中抗EV71和CVA16药效评价所用的工作浓度。结果显示二甲双胍50mM及以下浓度时细胞活力与对照组无明显差异，且显微镜下细胞形态没有变化。因此，后续实验中我们选择20mM、5mM和1.25mM二甲双胍进行体外药效评价。

2.从荧光定量PCR结果看出本发明提供的二甲双胍能剂量依赖性降低细胞内EV71和CVA16的RNA水平。从Western blot结果看出本发明提供的二甲双胍能剂量依赖性降低细胞内EV71和CVA16的病毒蛋白水平。从病毒滴度结果看出本发明提供的二甲双胍能剂量依赖性降低细胞内能够反映活病毒含量的EV71和CVA16的病毒滴度。

3.本发明提供的二甲双胍对EV71和CVA16无直接灭活作用，但二甲双胍通过下调EV71和CVA16的受体蛋白人清道夫受体B2(SCARB2)的水平，从而降低病毒的吸附结合发挥抗病毒作用。

由此得出本发明提供的二甲双胍具有显著抗EV71和CVA16复制的作用。

附图说明

图1为二甲双胍在HCT-8细胞中细胞活力的影响结果图。

图2为二甲双胍在HCT-8细胞内抑制病毒RNA水平的影响结果图。图中A表示实时荧光定量PCR方法检测二甲双胍对EV71 RNA水平的影响结果图；图中B表示实时荧光定量PCR方法检测二甲双胍对CVA16 RNA水平的影响结果图。

图3为二甲双胍在HCT-8细胞内抑制病毒蛋白水平的影响结果图；图中A表示Western blot方法检测二甲双胍对EV71蛋白水平的影响结果图；图中B表示Western blot方法检测二甲双胍对CVA16蛋白水平的影响结果图。

图4为二甲双胍在HCT-8细胞内抑制活病毒滴度的影响结果图；图中A表示CPE方法检测二甲双胍对EV71病毒滴度的影响结果图；图中B表示CPE方法检测二甲双胍对CVA16病毒滴度的影响结果图。

图5为二甲双胍在HCT-8细胞内直接灭活病毒的影响结果图；图中A表示CPE方法检测二甲双胍对EV71病毒灭活的影响结果图；图中B表示CPE方法检测二甲双胍对CVA16病毒灭活的影响结果图。

图6为二甲双胍在HCT-8细胞内对EV71和CVA16受体蛋白SCARB2表达的影响结果图。

图7为二甲双胍在HCT-8细胞内对EV71(A)和CVA16(B)吸附结合的影响结果图。

具体实施方式

为了更好理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。同时，以下实施例也不对本发明作进一步的限制作用。

实施例1二甲双胍对EV71和CVA16复制的抑制作用

1.细胞培养

HCT-8细胞传代用培养液：含10％胎牛血清(Gbico)、青霉素和链霉素双抗100U/ml(Gibco)的DMEM(Gibco)培养液。

HCT-8细胞稀释病毒所用培养液：含青霉素和链霉素双抗100U/ml(Gibco)的DMEM培养液。

HCT-8细胞稀释药物所用培养液：含2％胎牛血清(Gbico)、青霉素和链霉素双抗100U/ml(Gibco)的DMEM培养液。

HCT-8细胞汇合度达90％时，培养瓶内加入0.25％胰酶-EDTA(Gibco)，37℃消化2分钟，弃掉胰酶，加完全培养液吹散，1:3传代，1-2天传代一次。

2.细胞毒性检测

HCT-8细胞接种于96孔板中，3×10

图中显示50mM及以下浓度时细胞活力与对照组无明显差异，且显微镜下细胞形态没有变化。因此，后续实验中我们选择20mM、5mM和1.25mM二甲双胍进行体外药效评价。

3.二甲双胍对EV71和CVA16 RNA的抑制作用

HCT-8细胞接种于6孔板中，9×10

使用试剂盒TransScriptⅡGreen One-Step qRT-PCR Super Mix(北京全式金有限公司)在ABI7500Fast型高通量实时荧光定量PCR(qPCR)仪检测EV71和CVA16 RNA含量，每个RNA样品重复测定2次。

EV71 VP1 RNA引物：5’-GATATCCCACATTCGGTGA-3’(上游)；5’-TAGGACACGCTCCATACTCAAG-3’(下游)。CVA16 VP1 RNA引物：5’-GTTATCCCACCTTCGGAGA-3’(上游)；5’-TCGGGCATTGACCATAATCTAG-3’(下游)。GAPDH引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(上游)；5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(下游)。

反应体系如下所示：

实时荧光定量反应体系

反应条件

采用SYBR Green

ΔCt

ΔCt

ΔΔCt＝ΔCt

Fold difference＝2

从图2A中可以看出二甲双胍显著降低细胞内EV71 RNA的水平，且成剂量依赖性：20mM二甲双胍对EV71 RNA抑制率约为77％；5mM二甲双胍对EV71 RNA抑制率约为60％；而1.25mM二甲双胍对EV71 RNA无抑制作用。

从图2B中可以看出二甲双胍显著降低细胞内CVA16 RNA的水平，且成剂量依赖性：20mM二甲双胍对CVA16 RNA抑制率约为73％；5mM二甲双胍对CVA16 RNA抑制率约为44％；而1.25mM二甲双胍对CVA16RNA抑制率约为25％。

4.二甲双胍对EV71和CVA16 VP1蛋白的抑制作用

HCT-8细胞接种于6孔板中，9×10

Western blot检测

电泳：配制积层胶(浓度为5％)和分离胶(浓度为10％)，样品进行SDS-PAGE电泳，在积层胶采用电压60V，当溴酚蓝进入分离胶后，把电压提高到130V继续电泳，根据蛋白Marker位置判断跑胶完成后，转膜。

转膜：在电泳期间即制备转膜缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，20％(体积比)甲醇)，置于4℃预冷。PVDF膜预先用甲醇活化1min，然后浸于转膜缓冲液中。电泳结束后，小心取下凝胶，转移到转膜缓冲液中平衡5min，之后进行湿转。在转膜仪的阳极自下而上依次铺3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸，叠放整齐，注意气泡的撵除。制作三明治完毕，将转膜仪的阴极盖好，恒流250mA转约60min。

抗体孵育：转膜结束后，将膜取下，摇床上TBST洗10min。将膜放入封闭液(5％脱脂奶粉于TBST)中，室温振摇封闭1h。抗VP1(Millipore)和β-actin(Cell SignalingTechnology)一抗用一抗稀释液1：1000稀释，4℃孵育过夜。次日，移除一抗溶液，TBST洗3次，每次10min。用封闭液将辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(Cell SignalingTechnology)溶液1：5000稀释，室温孵育1h，TBST洗3次，每次10min。

显色：最后用ECL免疫印迹化学发光试剂(Millipore)孵育，通过ChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统(BIO-RAD)捕获图像，结果见图6。

从图3中可以看出二甲双胍能剂量依赖性降低细胞内EV71和CVA16的病毒蛋白水平。

5.二甲双胍对EV71和CVA16病毒滴度的抑制作用

HCT-8细胞接种于6孔板中，9×10

从图4中可以看出二甲双胍能剂量依赖性降低细胞内EV71和CVA16的病毒滴度水平。

实施例2二甲双胍对EV71和CVA16的灭活作用

Vero细胞接种于6孔板中，9×10

从图5中可以看出二甲双胍对EV71和CVA16无直接灭活作用。

实施例3二甲双胍对EV71和CVA16受体SCARB2蛋白含量的影响作用

HCT-8细胞接种于6孔板中，9×10

从图6中可以看出，二甲双胍剂量依赖性的下调EV71和CVA16受体SCARB2蛋白的含量。

实施例4二甲双胍对EV71和CVA16吸附结合的影响作用

HCT-8细胞接种于6孔板中，9×10

从图7中可以看出，二甲双胍处理细胞后降低EV71和CVA16对细胞的吸附结合。