同时降解黄曲霉毒素和呕吐毒素的娄彻氏链霉菌及其制剂

摘要

本发明公开了同时降解黄曲霉毒素和呕吐毒素的娄彻氏链霉菌及其制剂，所述娄彻氏链霉菌的保藏编号为CGMCC NO.20894，所述制剂含有娄彻氏链霉菌的培养物的提取物；本发明的优点在于：同时降解黄曲霉毒素和呕吐毒素，反应24小时对黄曲霉毒素的降解率可达到90%以上，对呕吐毒素的降解率为80%以上；降解效率高、作用条件温和，其浓缩产物不破坏饲料中的营养成分，其提取物可用于饲料的生物降解脱毒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种娄彻氏链霉菌，具体地说是同时降解黄曲霉毒素和呕吐毒素的娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei N8729，属于农业生物领域。

背景技术

霉菌毒素是由曲霉菌属、镰刀菌属和青霉菌属等真菌在生长过程中产生的有毒的次级代谢产物。目前已经报道的有超过300种对人和动物有毒害作用的霉菌毒素，常见霉菌毒素包括黄曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、呕吐毒素（DON）、烟曲霉毒素（FB）、赭曲霉毒素（OT）、T-2毒素。实际生产中，经常出现几种霉菌毒素同时污染的情况，现有技术和产品更多是采用单独一种微生物降解一种毒素。寻找可同时降解两种或两种以上霉菌毒素的微生物是有效解决霉菌毒素危害的方法之一。

发明内容

本发明的目的在于，提供了能够改善动物肠道、降解黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮的娄彻氏链霉菌及其制剂，为解决饲料及其制作原料中霉菌毒素污染提供技术支持。

本发明的技术方案为：

一种同时降解黄曲霉毒素和呕吐毒素的娄彻氏链霉菌，中文名为娄彻氏链霉菌，学名为Streptomyces rochei，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.20894。

所述娄彻氏链霉菌的液体培养基配方重量分数为：10‰玉米面、10‰蛋白胨、8‰酵母粉、0.2‰一水硫酸镁，培养条件为：32℃，pH维持在6.6 – 6.8，通气发酵，得到娄彻氏链霉菌液体培养物；固体培养基配方重量分数为：70%细麸皮、3%蛋白胨、5%酵母粉、22%玉米面，水分为35%，培养条件为：32℃，通气发酵，得到娄彻氏链霉菌固体培养物。

一种霉菌毒素降解制剂，所述制剂含有上述娄彻氏链霉菌的培养物的提取物。

所述提取物的制备方法为：将娄彻氏链霉菌固体培养物在32℃培养5天后，用30℃温水浸提24小时，然后以载体吸附并低温晾干。

所述载体包括麦麸、玉米芯粉、酵母细胞壁、玉米淀粉、米糠、葡萄糖、沸石粉、膨润土、蒙脱石中的一种或几种。

所述制剂中提取物的含量为重量分数20-60%。

所述娄彻氏链霉菌发酵提取物与载体的质量比例为：20-60：80-40。

本发明制剂的作用对象包括饲料及其制作原料等。

所述娄彻氏链霉菌菌株16SrDNA基因序列测定：

GGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCCGTGAGTCCCCAGCACCACAAGGGCCTGCTGGCAACACGGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGACCCTGTCTCCAGGGTTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGACAACGTGGAATGTTGCCCACACCTAGTGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATGTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTATCGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCGAACTCTAGCCTGCCCGTATCGACTGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACAACCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTGCACCGCCGGAGCTTTCGAACCTCGCAGATGCCTGCGAGGATCAGTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGCAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCACCGAAGTGGTCATCGTTCGAC。

本发明的有益效果为：同时降解黄曲霉毒素和呕吐毒素，反应24小时对黄曲霉毒素的降解率可达到90%以上，对呕吐毒素的降解率为80%以上；降解效率高、作用条件温和，其浓缩产物不破坏饲料中的营养成分，其提取物可用于饲料的生物降解脱毒。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明实施例娄彻氏链霉菌在1600 X显微镜下的菌丝图；

图2为本发明实施例娄彻氏链霉菌在1600 X显微镜下的孢子图；

图3所示为0h所取样品中黄曲霉毒素B1含量色谱图；

图4所示为本发明菌株降解24h后样品中黄曲霉毒素B1含量色谱图；

图5所示为0h所取样品中呕吐毒素含量色谱图；

图6所示为本发明菌株降解24h后样品中呕吐毒素含量色谱图；

图7所示为0h所取样品中黄曲霉毒素B1含量色谱图；

图8所示为本发明菌株降解24h后样品中黄曲霉毒素B1含量色谱图

图9所示为0h所取样品中呕吐毒素含量色谱图；

图10所示为本发明菌株降解24h后样品中呕吐毒素含量色谱图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种同时降解黄曲霉毒素和呕吐毒素的娄彻氏链霉菌，所述娄彻氏链霉菌的液体培养基配方重量分数为：10‰玉米面、10‰蛋白胨、8‰酵母粉、0.2‰一水硫酸镁，培养条件为：32℃，pH维持在6.6 – 6.8，通气发酵，得到娄彻氏链霉菌液体培养物；固体培养基配方重量分数为：70%细麸皮、3%蛋白胨、5%酵母粉、22%玉米面，水分为35%，培养条件为：32℃，通气发酵，得到娄彻氏链霉菌固体培养物。

一种霉菌毒素降解制剂，所述制剂含有上述娄彻氏链霉菌的培养物的提取物。

所述提取物的制备方法为：将娄彻氏链霉菌固体培养物在32℃培养5天后，用30℃温水浸提24小时，然后以载体吸附并低温晾干。

所述载体包括麦麸、玉米芯粉、酵母细胞壁、玉米淀粉、米糠、葡萄糖、沸石粉、膨润土、蒙脱石中的一种或几种。

本发明制剂的作用对象包括饲料及其制作原料等。

所述生物制剂中提取物的含量为重量分数20-60%。

所述娄彻氏链霉菌发酵提取物与载体的质量比例为：20：80或30：70或40：60或50：60或60：40。

本发明娄彻氏链霉菌为从玉米田地土壤经过大量筛选分离得到的。

收集玉米田地土壤里的样品，稀释10倍后用于筛选实验。稀释液涂布于PDA平板上，30℃培养36hr。对平板上的每个单菌落，转接至空白PDA平板上，得到纯培养菌株。将纯化菌株在液体土豆培养基中培养36hr后，检测其对黄曲霉毒素和呕吐毒素的降解能力。

毒素降解检测方法：

实施例2 对黄曲霉毒素标准品和呕吐毒素标准品的降解效率

一、样品处理：

将实施例1纯化的菌株进行液体土豆培养基活化，活化36hr后得到本发明菌株的培养液。在无菌操作前提下，准确量取50mL上述培养液置于250mL的三角瓶中，如果为固体样品，则在50mL的灭菌培养基（培养基组成：10‰玉米面、10‰蛋白胨、8‰酵母粉、0.2‰一水硫酸镁）中加入0.1g固体物料。然后加入1mL黄曲霉毒素B1或1mL呕吐毒素标准品，使得最终反应体系中AFB1的浓度为50μg/L，DON的浓度为1000μg/L，混合均匀，将其置于30℃，200rpm条件下培养。同时做不添加任何培养液或固体物料的空白对照，其他处理相同。

分别于培养的0h和24h取样1mL，加入4mL色谱级甲醇，混合均匀。置于摇床中震荡提取30min。提取结束后，4000rpm离心5min，玻璃纤维滤纸进行过滤，收集滤液进行免疫亲和柱净化，高效液相色谱检测。

二、检测：

1.净化过程：

取通过玻璃纤维滤纸的滤液5mL，加入20mL PBS缓冲溶液，混合均匀，待检。

将免疫亲和柱上方接上10mL玻璃注射器。去掉免疫亲和柱下方的堵头，弃去柱中的保护液，准确移取上述稀释好的待检液20mL于注射器中（可以移取2次，每次10mL）。将空气压力泵与注射器相连接，调节压力，使溶液以约1mL/min左右的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。加入10mL双蒸水洗涤2次，调节流速为3mL/min左右，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。

最后分2次各准确加入0.5 mL（总体积为1 mL，）色谱纯甲醇，每次孵育2min，

流速为1mL/min左右，收集洗脱液于棕色小瓶中用于HPLC分析。

其中，DON的洗脱液收集于试管中，40℃氮气吹干，用1mL流动相复溶，用于HPLC分析。

2.标准曲线绘制：

根据使用需要，准确吸取一定量的黄曲霉毒素标准贮备液（B1 100 ng/mL），用色谱级甲醇稀释，分别配成系列浓度的标准工作液：AFB1的浓度分别为0μg/L、1μg/L、5μg/L、25μg/L、50μg/L。以黄曲霉毒素标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准曲线对样品进行定量。

3.检测：

黄曲霉毒素检测条件：

色谱柱：C18色谱柱，4.6 mm×150 mm，5μm；

流动相：甲醇：水=45:55；

流速：1 mL/min；

荧光检测器波长：激发波长λex 360 nm，发射波长λem 440 nm（开柱后衍生池）；

进样量：20 μL；

黄曲霉毒素B1 出峰时间：17-19 min。

呕吐毒素检测条件：

色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×150mm，5μm；

流动相：乙腈：水=1：9；

流速：1 mL/min；

柱温：35℃；

检测波长：λ=218 nm；

进样量：20μL。

呕吐毒素的出峰时间：11~12min。

4.结果：

实验结果显示：根据高效液相色谱检测数据，0h样品AFB1含量为43.88μg/L，24h样品AFB1含量为0.97μg/L，则本发明菌株对AFB1标准品的降解率为97.79%，0h样品DON含量为1116.87 μg/L，24h样品DON含量为153.69 μg/L，则本发明菌株对DON标准品的降解率为86.24%。

实施例3 对饲料原料和饲料中黄曲霉毒素和呕吐毒素的降解效率

一、样品处理：

取500mL三角瓶，瓶中称50g粉碎好的饲料或饲料原料，加入250mL甲醇，摇床震荡提取2小时，定性滤纸过滤，将滤液混合均匀。按照免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定其中的毒素含量。

将上述提取液置于250mL的脂肪瓶中，65℃旋干（根据测得的样品中的AFB1和DON含量，确定需要旋干的提取液的量，使旋干后加入甲醇溶解的液体中AFB1浓度约为2.5ppm，DON浓度约为50ppm）

将实施例1纯化的菌株进行液体土豆培养基活化，活化36hr后得到本发明菌株的培养液。在无菌操作前提下，准确量取50mL上述培养液置于250mL的三角瓶中，如果为固体样品，则在50mL的灭菌培养基（培养基组成：10‰玉米面、10‰蛋白胨、8‰酵母粉、0.2‰一水硫酸镁）中加入0.1g固体物料。然后加入1mL浓缩的黄曲霉毒素B1或1mL浓缩的呕吐毒素，使得最终反应体系中AFB1的浓度为50μg/L，DON的浓度为1000μg/L，混合均匀，将其置于30℃，200rpm条件下培养。同时做不添加任何培养液或固体物料的空白对照，其他处理相同。

分别于培养的0h和24h取样1mL，加入4mL色谱级甲醇，混合均匀。置于摇床中震荡提取30min。提取结束后，4000rpm离心5min，玻璃纤维滤纸进行过滤，收集滤液进行免疫亲和柱净化，高效液相色谱检测。

二、检测：

1.净化过程：

取通过玻璃纤维滤纸的滤液5mL，加入20mL PBS缓冲溶液，混合均匀，待检。

将免疫亲和柱上方接上10mL玻璃注射器。去掉免疫亲和柱下方的堵头，弃去柱中的保护液，准确移取上述稀释好的待检液20mL于注射器中（可以移取2次，每次10mL）。将空气压力泵与注射器相连接，调节压力，使溶液以约1mL/min左右的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。加入10mL双蒸水洗涤2次，调节流速为3mL/min左右，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。

最后分2次各准确加入0.5 mL（总体积为1 mL，）色谱纯甲醇，每次孵育2min，

流速为1mL/min左右，收集洗脱液于棕色小瓶中用于HPLC分析。

其中，DON的洗脱液收集于试管中，40℃氮气吹干，用1mL流动相复溶，用于HPLC分析。

2.标准曲线绘制：

根据使用需要，准确吸取一定量的黄曲霉毒素标准贮备液（B1 100 ng/mL）和呕吐毒素标准贮备液（DON 50 μg/mL），用色谱级甲醇稀释，分别配成系列浓度的标准工作液：AFB1的浓度分别为0μg/L、1μg/L、5μg/L、25μg/L、50μg/L；DON的浓度分别为：0μg/L、100μg/L、200μg/L、1000μg/L、5000μg/L以标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准曲线对样品进行定量。

3.检测：

黄曲霉毒素检测条件：

色谱柱：C18色谱柱，4.6 mm×150 mm，5μm；

流动相：甲醇：水=45:55；

流速：1 mL/min；

荧光检测器波长：激发波长λex 360 nm，发射波长λem 440 nm（开柱后衍生池）；

进样量：20μL；

黄曲霉毒素B1 出峰时间：17-19 min。

呕吐毒素检测条件：

色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×150mm，5μm；

流动相：乙腈：水=1：9；

流速：1 mL/min；

柱温：35℃；

检测波长：λ=218 nm；

进样量：20μL。

呕吐毒素的出峰时间：11~12min。

4.结果：

实验结果显示：根据高下液相色谱检测数据，0h样品AFB1含量为73.95μg/L，24h样品AFB1含量为2.27μg/L，则本发明菌株对饲料或饲料原料中AFB1的降解率为96.93%，0h样品DON含量为1061.72，24h样品DON含量为274.42μg/L，则本发明菌株对对饲料或饲料原料中DON的降解率为74.15%。

序列表

<110> 科润生科技发展有限公司

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1370

<212> DNA

<213> 娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)

<400> 1

gggttgggcc accggcttcg ggtgttaccg actttcgtga cgtgacgggc ggtgtgtaca 60

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