一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法

摘要

本发明提供了一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法，属于植物病毒接种技术领域，所述接种方法，包括以下步骤：将茎叶总长度为4～8cm的小麦幼苗置于CWMV浸润液中，在标准大气压下进行抽真空处理25～35min，然后将小麦幼苗移栽至土壤中进行培养；所述CWMV浸润液包括CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子。本发明所述接种方法能够显著提高中国小麦花叶病毒CWMV在小麦上的接种率，接毒步骤简单，能够实现快速批量接种。

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒接种技术领域，尤其涉及一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法。

背景技术

中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)是上世纪九十年代在我国山东冬小麦上鉴定的一种由禾谷多黏菌传播的土传病毒(Chen J.Annals of AppliedBiology,1993,123(1):55-61)近年来CWMV侵染的病区不断扩大，导致小麦减产10％～30％，甚至是70％。2018年冬季由于雨水充足，低温持续时间长，中国小麦花叶病毒病发病尤为严重。到目前为止尚未研究出有效且有针对性的防治土传病毒病害的防治措施，生产上唯一有效的防治办法是选育抗病品种，但抗性种质资源较匮乏，导致抗病品种的选育十分困难，以至于防控该病毒病害仍是世界性难题(陈剑平.浙江农业学报,2005,04:1004-1524)CWMV属于帚状病毒科的真菌传杆状病毒属(Furovirus)，其最适侵染温度为15-17℃，感染后的小麦表现出花叶、矮化、分蘖减少等症状。对CWMV的病毒粒子结构和基因组结构进行解析发现其为是单链正义RNA(ssRNA)病毒，包含RNA1和RNA2两条基因组。目前，对CWMV的研究主要集中于病毒的分布、生物学特性、病害流行规律等方面，但对于CWMV的致病机制鲜少报道。植物病毒的成功感染源于复杂的分子结构寄主植物和入侵病毒之间的相互作用。为了研究寄主是如何识别和抵抗CWMV侵染，在实验室条件下成功接种CWMV就显得尤为重要。目前小麦接种CWMV病毒采用的是摩擦接毒的方法，由于摩擦接毒效率低，步骤繁琐，且成本高导致小麦和CWMV互作的研究进展缓慢。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法，所述接种方法能够显著提高中国小麦花叶病毒CWMV在小麦上的接种率，接毒步骤简单，能够实现快速批量接种。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法，包括以下步骤：将茎叶总长度为4～8cm的小麦幼苗置于CWMV浸润液中，在标准大气压下进行抽真空处理25～35min，然后将小麦幼苗移栽至土壤中进行培养；

所述CWMV浸润液包括CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子。

优选的，每一株小麦幼苗置于400～600μL的CWMV浸润液中。

优选的，所述CWMV浸润液以MES缓冲液为溶剂，其中CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子的OD

优选的，所述CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子在所述CWMV浸润液中的OD

优选的，小麦幼苗移栽至土壤中培养的时间为7～28d。

优选的，所述培养的温度为7～9℃，所述培养的光照周期L:D为14:10；所述培养的湿度为73％～78％。

优选的，所述小麦幼苗的培育方法包括以下步骤：将小麦种子在自来水中24～26℃浸泡10～14h后获得芽头露白的种子；将所述芽头露白的种子保湿培养3～4d获得小麦幼苗。

本发明的有益效果：本发明提供的中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法，利用CWMV侵染性克隆，模拟小麦田间由根部侵入，通过抽真空处理将中国小麦花叶病毒CWMV从根部吸入小麦，并使得中国小麦花叶病毒CWMV在整株小麦上系统侵染；所述接种方法能够显著提高中国小麦花叶病毒CWMV在小麦上的接种率，简化了接毒步骤，并实现了快速批量接种。本发明所述的接种方法不涉及任何试剂盒及昂贵试剂，大大节约了接种中国小麦花叶病毒CWMV的成本；所述接种方法也不涉及如体外转录、人工摩擦等复杂的实验步骤，操作简单；能够实现在小麦上快速批量接种中国小麦花叶病毒CWMV。

附图说明

图1为本发明提供的接种方法的操作流程示意图；

图2为小麦幼苗移栽至土壤中培养7天、14天、28天时，根茎叶CWMV-CP检测结果；

图3为批量接种14天后小麦叶片CWMV-CP检测结果；其中M为Marker，+为阳性对照，-为阴性对照，1～34为34个接种样品；

图4为对比例1中的方法接种后14天时，叶片CWMV-CP检测结果，其中M为Marker，+为阳性对照，-为阴性对照，2～13分别为接种样品。

具体实施方式

本发明提供了一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法，包括以下步骤：将茎叶总长度为4～8cm的小麦幼苗置于CWMV浸润液中，在标准大气压下进行抽真空处理25～35min，然后将小麦幼苗移栽至土壤中进行培养；所述CWMV浸润液包括CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子。

在本发明中，所述小麦幼苗的培育方法优选的包括以下步骤：将小麦种子在自来水中24～26℃浸泡10～14h后获得芽头露白的种子；将所述芽头露白的种子保湿培养3～4d获得小麦幼苗。在本发明中，所述种子的浸泡温度优选为25℃，所述浸泡的时间优选为12h。在本发明中，所述芽头露白的种子保湿培养优选的在吸水纸上进行。

在本发明中，所述CWMV浸润液中CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子优选的以转化农杆菌培养液的形式存在。在本发明中，所述CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～3所示。在本发明中，所述转化农杆菌培养液的制备方法包括以下步骤：通过电击转化的方法将CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子分别转化入GV3101的农杆菌中，并用含有50μg/ml卡娜青霉素+50μg/ml庆大霉素+50μg/ml利福平三种抗生素的YEP培养基分别在28℃摇培14～16h获得CWMV RNA1-转化农杆菌培养液、CWMV RNA2转化农杆菌培养液和P19沉默抑制子-转化农杆菌培养液。在本发明中，分别将所述CWMV RNA1-转化农杆菌培养液、CWMV RNA2转化农杆菌培养液和P19沉默抑制子-转化农杆菌培养液离心后收集CWMV RNA1-转化农杆菌菌体、CWMV RNA2转化农杆菌菌体和P19沉默抑制子-转化农杆菌菌体；本发明对所述离心的转速和时间没有特殊限定，采用本领域常规的离心菌体的转速和时间即可。

在本发明中，所述CWMV浸润液优选以MES缓冲液为溶剂，稀释上述离心获得的菌体，其中CWMV RNA1-转化农杆菌菌体、CWMV RNA2转化农杆菌菌体和P19沉默抑制子-转化农杆菌菌体的浓度比例优选为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)，更优选为1:1:1。在本发明中，所述CWMV RNA1-转化农杆菌菌体、CWMV RNA2转化农杆菌菌体和P19沉默抑制子-转化农杆菌菌体在所述CWMV浸润液中的OD

在本发明中，将小麦幼苗置于CWMV浸润液中，在标准大气压下进行抽真空处理。在本发明中，每一株小麦幼苗优选的置于400～600μL的CWMV浸润液中，更优选的为450～550μL，最优选的为500μL。在本发明具体实施过程中，优选的将所述小麦幼苗和CWMV浸润液置于无菌离心管中；所述无菌离心管的规格优选为2ml；所述小麦幼苗根部朝下，根部浸没于CWMV浸润液中，所述离心管敞口放置。在本发明中，所述抽真空处理优选的在真空干燥器中进行，所述抽真空处理的时间优选为28～32min，更优选为30min；所述抽真空处理过程中，每隔8～12min停止一次，优选的每隔10min停止一次；停止抽真空处理后，通过轻弹离心管的方式去除CWMV浸润液中的气泡，然后继续进行抽真空处理。

本发明在所述抽真空处理后，将小麦幼苗移栽至土壤中进行培养。在本发明中，所述小麦幼苗移栽至土壤中培养的时间优选为7～28d；所述培养的温度优选为7～9℃，更优选为8℃；所述培养的光照周期L:D优选为14:10；所述培养的湿度优选为73％～78％，更优选为75％。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)小麦种子在自来水中25℃浸泡12h过夜；

2)将芽头露白的种子摆放在吸水纸上保湿培养3天，获得茎叶总长度为4～8cm小麦幼苗；

3)通过电击转化的方法将CWMV RNA1、CWMV RNA2和P19沉默抑制子分别转化入GV3101的农杆菌中，并用含有50μg/ml卡娜青霉素+50μg/ml庆大霉素+50μg/ml利福平三种抗生素的YEP培养基分别在28℃摇培15h，获得CWMV RNA1-转化农杆菌培养液、CWMV RNA2转化农杆菌培养液和P19沉默抑制子-转化农杆菌培养液。

4)用MES缓冲液(10mM MES；10mM MgCL

5)将培养好的小麦幼苗摆入2ml EP管，每管加入500μl CWMV浸润液；

6)将摆有小麦的2ml EP管放入真空干燥器中真空抽30min，期间每隔10min停一次，取出轻弹去气泡后继续；

7)将小麦幼苗取出种入土中，在8℃，每日光照14h，黑暗10h，湿度75％条件下培养，每隔七天取样检测一次。

用RNA试剂盒(R4151-03,Magen)分别提取小麦种植7天、14天和28天后的根茎叶RNA；

总RNA反转录成cDNA。反应体系为：1μL Random(10μM)，1μg总RNA，用DEPC水补齐至12μL。反应条件：42℃，5min，反应结束后，向其中加入4μL 5×RT buffer，2μLdNTP Mix，1μLRNase inhibitor，1μL Rever TraAce，用移液器轻轻吹打混匀，经30℃，10min；42℃，20min；99℃，5min；4℃，5min反应程序合成cDNA。反转录后以cDNA为模板，CWCPF:ATGGCCGTGAAATCTGGTTAT(SEQ ID No.4)；CWCPR:ACACTCGAACCTTCCCACTTAAG(SEQ ID No.5)为验证引物PCR反应程序为第一步95℃，5min；第二步95℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，30Sec；运行30个循环；第三步72℃，10min，4℃，5min鉴定确定小麦植株是否成功接种CWMV。

结果如图2和图3所示，小麦植株成功接种中国小麦花叶病毒CWMV，抽真空后种植7天、14天和28天后的根茎叶均能侵染CWMV，且CWMV稳定存在于小麦植株的根茎叶中。

对比例1

1)小麦种子在自来水中26℃浸泡10h过夜；

2)将芽头露白的种子摆放在吸水纸上保湿培养4天，获得茎叶总长度为4～8cm小麦幼苗；

3)将培养好的小麦幼苗栽培与营养土中，长到两叶一芯期；

4)将含有CWMV和CWMV R2的DH5α克隆菌5ml，接种于含50卡娜青霉素的新鲜LB液体培养基中。37℃，200r/min振荡培养24h。8000r/min离心10min收获菌体。用Magen PlasmidMidi Kit提取质粒，利用Pharmacia Biotech公司的Ultrospec 3000测定质粒浓度，要求质粒浓度大于1μg/μl。对质粒进行线性化备用。

5)利用Ambion Message Machine kit(Invitrogen)T7-capped体外转录试剂盒体外转录获得CWMV R1和CWMV R2 RNA。

6)将体外转录获得的RNA加入200μl FES中在无RNA酶的环境下摩擦接种在小麦二叶期的第二叶上。

7)将摩擦接种的小麦在30℃，湿度90％条件下黑暗培养24h后，按每日光照14h，黑暗10h条件培养，每隔七天取样检测一次。

分别提取小麦种植7天、14天和28天后的根茎叶RNA；

RNA反转录后通过PCR鉴定确定小麦植株是否成功接种CWMV。

(Yang et al,The Journal of general virology,2016,97,2441-2450.)

结果见图4小麦植株部分成功接种中国小麦花叶病毒CWMV，接种7天、14天和28天后CWMV侵染率低。且体外转录试剂盒价格昂贵。

由上述实施例可知，本发明提供的接种方法能够显著提高中国小麦花叶病毒CWMV在小麦上的接种率，简化了接毒步骤，并实现了快速批量接种。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7147

<212> DNA

<213> Chinese wheat mosaic virus

<400> 1

gtatttcttt ctctctacgt cgttagacag tgtagagtgt ttggaatact tgttgcaata 60

caaaggcacg cttcggcgat aaatcctttg tttgtaacaa aatgccgatc gatagcagtt 120

cgatacttgg tattattagt gaagaggatg tcattagggc cgccattagt actagtgcga 180

caaaatttgg ttcgcagttg catagtactg tgtgcgatca tgttaaagag acgtacttgg 240

acgctatgga aagacaaaaa acaaaaaaga agatagatgt gaggcgcgac ttgtcacagg 300

aacagcttca acttctaaat gacctttatc cggagagaca cattgtgtca agcaactgtg 360

aaagaggtac gcacagcttt gcagcggctt cgaggaaaat cgagactgat ttgttgttga 420

gtcgtattcc taaaaaatcg tgggtctacg atattggggg caactgggcc acgcacatca 480

agcgcaatga tgggcgtagg gtgcattgtt gttgccctac tattgacata agagattctg 540

cgaggaagac tgttagttgg gcgtctatag aaaaatattt ggatgagaag gacgagatac 600

ccaccgaagt cggtgagcgt attaagcgtg tgcaggctga tgaaattaag atttatgaga 660

atctgaagaa taaaagggct cagcctgaag atttagatgg taagtggtac tgtggaaaca 720

agtttgagga gtgtgtgttc agagcagaga gggcttatgc gatggctatc catagcattt 780

atgatattga tctcatggat ctggccaatg ctttagagga aaaaagaata aagatcatga 840

gtggcacgtt cctgttttcg gttgacctgt tacttgggaa aaagagcgga tcactaccga 900

ccatggatgg tttctttgag gtagaaggtg actacgtaaa gtatggtttc aaaaatgata 960

caaacccagg ttataaacat aagctcagtc agctgatgaa gtatctgacg aagacttttg 1020

tcgtcgcgaa agggggaaca atttactacc tagagcttac tgaacagcga ggtgatgtga 1080

tgttcttcac aatgacggat gcgacggaag cgaggatgaa cggtgttgtg gctgacgagt 1140

ctttcaagtg cataccaatt gataataagt ctgaggttgt atttcccata ttcgaggtgg 1200

ataagcagac tgattcgttg attttttccg aggtgttgtt gtcgaaggat ttcgttcaaa 1260

gggctatcga attcacagga aggcttaaac cgaatcaact cactccggat aatgtgaata 1320

cctatttgac ttccaccaac aacactatca ttattggtgg ttcatcaaaa aagaatacta 1380

cgaaagtcga tgctacgttg attcagcaaa ttactaccac tctggtggtt tggacggagc 1440

ttatgaattt gcgccaaaag agagtgttgg agaagttaag gttgcagatg aaagacgatg 1500

tggatttcaa gtcgttggcg catactgctt ttttgaaggt gttcggtaaa gtgagctatt 1560

atcagagagc gctgcgttgt ttcgctaatt ggctttcgta cgtgcatggc actgacgcca 1620

ttcaatttca cgatgtccct ctgtatgcgg aagtcacaga cagagtgaag ttgtggaaga 1680

cacacgcccc aaatcagggc tttgtgctcg acatggaaga cttggatgta aagatcaaga 1740

tgcatgaggt gtccgaaaga gaaaagagag atgttagtcg gtgcatagtg tctgggaagt 1800

tgggggagtt acagatccat tctgaatctt ctaataatga agaacaaatc aacggtgatt 1860

atcgtgacag tcggagacgt actacttttg aagacctact ggagggtgaa gtggctacga 1920

attttcttga tgattggtgt gagaagaatg atcatttcaa tttttcgcgt gatgacgccc 1980

agtctaaata tgcttggggt ttgaaattac tgaaaggtat ttgggagttt ttactcccgc 2040

ctatggattt cgcgcccgtt tatgtcgatg atgagcaagc aagactaagg atggtccgtg 2100

tgaatgaaag gagaaatact tctgacactg gtgctgacgg agacgtcgca gcttgtgaag 2160

ttgcagcaga tttttcgaaa gcgatggaca cgttggttga cgtggtgaag aagatggatc 2220

agaagaagtt gggattagtt gagaaggtga aagcatctgc ggttgctgtt gtcgaactga 2280

gtaagactaa acctgttact ggtaacagct gcgcggtgga tctctgggct gattttgaga 2340

agaatttgga cgacgatgat gaacccggtt gtggtatttc cgtagtgact aaaggtaaag 2400

aaatatgtca agataatgtc ggaccagtgc ttttgtgtgg tagttcttca tgctcctctg 2460

ttagtgaggt ggagaaagaa actgatgtgg ttagtgtgac tgattctggg aatagtcccg 2520

ccacatgctg cggaggaatg gttcttgata agtcggtaag tattgctggt aacgatgttt 2580

cggtcgaact acctgtcact gctacaactg tcgcgacagt tgagacaggg actgcggacg 2640

gtgttatcgc tagtacagac gagtcagcct ttagtgacgt taacgacaag tcgtggggct 2700

cggtcgctga ggaagaaagt gatgacactt tttattcatg ctctggtctg atttcagata 2760

aagtgaagaa aagtaatttg ccaaagaggc cagatttctc gaaatttcct actgtgcaac 2820

agaaggcgaa acacgaggcg atgtggtatc tgcaatgcaa gatcgtttct gataggacca 2880

ctctgaggag tattattgat gaccatctgc ggggaatgtt tcacaatgga acttgtgaac 2940

tgcctaaaga ttcagctttt ttggactaca ctgccgataa ctgcgggacc tggatgtacg 3000

gaaaaccgtc acgttttggt cacagttatg gagttggttt ttcactggat acgaggcaga 3060

gagtaagtaa gtgtgaactt gtgaagttga tgtggaatca tgacagccgt ggtcaggtaa 3120

atcagaaacc agtgaatacg agagctttcc agtatttact gcttagtgag ctctccttta 3180

tgatgaatga gatgataata taccgtaacc ttcagcaggt gatgcgtaaa agggagagga 3240

gtaagcaggc acgtattaca ttgagagatg gagttcccgg ttgcggaaaa tctacgtgga 3300

ttctgaacaa tgcaaatccc acaaaagata tgattctatc ggtgggaaaa gaggcaactg 3360

aggatttaaa agagaaattc atgaaaaaac acaggtgtgt agaatccgac ttgaagagga 3420

taagaactgt ggattcattt cttatgcacg attatgacaa gtacagggca gcaaccgtgc 3480

actttgatga agcacttatg gcgcacgctg gtatggtgta tttttgtgct gatatacttg 3540

gagctaagaa ggtcatttgt cagggtgatt ctcaacaaat accttttatt aatcgcgttg 3600

aatctatcac attgcagtac tcaaagcttg taattgacga gactgagcat gtgcgactaa 3660

cgtatagatc tcctgttgac gtggctcact atctcaccaa aaaatcgtgg tacagtggag 3720

gaagggttac tacaaagaac cctgtgatga gatctatgaa aactgtagga ccgagagacg 3780

tcaaacctat gacgtcagtt cactgtgttc cttattttaa agacgcgcag tacttgacgt 3840

ttacgcaatc tgaaaaaact gatttgtaca aggcgctgag gaataaaggt ccagtcacag 3900

tgaataccgt gcatgagact caaggaaaaa cctttgacga tgtcattgtg gtaaggttag 3960

aaactactga aaatgagatt tacccaggtg gtaggaaagg tcaaccttac gaaattgtgg 4020

caacaactag acatcgccga tcattggttt attatactgc tattgaagac aggctttttg 4080

aagatattag tgacatgcag gatgtcatgg aaagcaaact catgaagagt ttgtgtcctg 4140

aattcgacaa atgacggttt gggtcgaaat atgagtccat cttaatatgt gatagagagg 4200

taagggtacc cgacgtagga acacctgcaa ttttgcagga cttctacgac agggtgtttc 4260

ctggaaattc aacgatggat tcacatttcg acgggtatga agtttctact tctgacataa 4320

gcatcgaatt ggagaactgc acagtacaac ccaacaaaaa cgttagggtg tggcaagaca 4380

agaggggttt ggtgccggtg atgcggactg ctatgccgcc taaacgacag aatcttccgg 4440

ttgaggccat gttagcgttg aaaaaacgga atatggcagc accgaaattg caagaggcgg 4500

tcaatgaatt tgaggtgata gagaggacta taaatcgggc caaagagatc tttttcaatg 4560

tggaattgat cgacgacagt gaactttcta ctagagaatc caacttgcgt tggtggggaa 4620

gacaatctac gaccgcgagg gcgcagatga aaaaagaaat gcgggtattg catgagatag 4680

acctgtgttt ttacagttac aacatcaaag gtgatgagaa acctaagatg gacagatcac 4740

cccagcacga atacggagcg ttacagacgg tggtgtttcc cgataaaatt gtaaacgctc 4800

ttttcggtcc ggtcatgaag gaaatcaatg agcgtatcag aatggctttg aaaccgcatg 4860

ttgtatacaa ttctagaatg aatgccgacg agctcaaccg tacagttgag ttcttagatc 4920

cagatgaaga atacaatgcg tttgaaatcg atttttcaaa attcgacaaa tcaaaaacgt 4980

cattgcacat tcgagcggtt atcgagctat acaagctttt cggtctgaat gatttgatcg 5040

cccttctgtg ggagaaatcg caatctcgga ctaagataag ggactttgta tatggtatta 5100

ccgcatattt gctttatcag cagaaatccg gtaattgcga cacttatggt tcaaacacat 5160

ggtccgcggc gttggcgttg ttggaatcaa tgccattgga aaaagcaaag tttatgatct 5220

ttggaggtga cgactcattg atcctttttc caaaacaaca ggttgtagaa gatccctgca 5280

ggaggcttgc ctcactgtgg aacttcgact gcaaactgtt tgattttaag cataacatgt 5340

tctgtgggaa attcttgctt aagatcgggg acaggttcaa atttgcacct gaccctatga 5400

agttgattac gaaactgggt cgtaaggata ttgctgatgg gagattgctg tccgagattt 5460

ttgtgtctat tggagataat ttccggtctt accgggatta caggatactc gaacaacttt 5520

ctttggccgt acgggaaagg tacaagactg atgaagatcc gacggctacg ttgattactt 5580

tgaagaagta catcttcgat tttaagcttt ggggtagttt gtttaattat agtggtgagt 5640

ttgtggagag tagagtagat aggaactttg aatggtaatt cgctgtttct cgttgttttt 5700

atctattgtt cacttctctt tttctcttta ctgctaatca tgacttccaa agatgtcaaa 5760

ggtgaatcat acgagtcggt gtacaacaag atgttggata tgcaaactga agcggttggt 5820

gcaaatgagt tgcgtctgaa caggcagagg agtttcaatg ttgaaaatcg gtatgtcgag 5880

aaagcactca ttcaaccggg gattgttaca aagatggctg atgcttggac gagttttacg 5940

aaaacaaaca aggaggaagg gatgccatac aacttgtctt ttagctgcgt gttaataaac 6000

gttataccaa cagtacctaa gggttacgcg ggtaccgtgg aagtatcact gctcgattcg 6060

ggcctgtcac cgcttgagaa tatcattccg gatcagacgc aaatgatgga gttgggcgcg 6120

ggaccacatg tgatgtgttt ctttatgcat tacagcatac ctttaaatga caaggatcgt 6180

tcaatcaagt tggctttcaa aattgatgca gagatggcta acaaaggtat gagtgtgatg 6240

aacgtctaca cttattggac gcaaagacag ggggctcaat cttcgtattc tgaacctcag 6300

aggtcaactt gttcgaagtt gcttttaggt tatgataaga gtttgaagat gaagacaaga 6360

ggagatgtcc gacgttttgt tggtcgttca cttactttgc acaatttgga gcaatctgtg 6420

ccgcagatgc ttcctgctaa tattaatgtg cttaaagaga atgtcccttt gtatcggaaa 6480

gagagtataa tggatctcac taaagaggaa agggagaaaa atgctaagtt ggaggaactt 6540

agaaaaactc gtgctattca gacagaacgt aatgttgaag agatgaagaa gaggcagatg 6600

gagctgttga aagaggctcg tcgtaagacg gctgaagatt cggtcgctgc tgctgacaag 6660

cgtaagtacc aaattggttc atctagtgga caaccagaca tcacttttgg ctcttttaat 6720

aaggtgtgat aagtgtgtat actatacata tatacattat tgtatatggc ttgtaagttt 6780

gctactatat ttgtactttg tattattaca ttgtaaaaat agtctaactt gtcagactga 6840

gacaagtcgt tttcagtacg ataactggaa ccgcttgata agcgggttat aaaacattca 6900

aacctatttg agcaggttgc gctcaaacgt ggtcattacg ataaatgact ctgtttacca 6960

aacagaagta aattggttac gtagtacagt gcgttaaact gtacgactat cttctagtcc 7020

ctattgatgt aattgaaaaa agatcaatat tgggcaatga cgaagagcga ctgggcgtcg 7080

cggctgctaa gacacagcag ttaagagggg ttcaattccc ccccgaaccg gagggttatc 7140

cggccca 7147

<210> 2

<211> 3560

<212> DNA

<213> Chinese wheat mosaic virus

<400> 2

gtatttcaat ctgtacaagt gcggtgttaa ccaaactaaa tcagatatac ctttcttctc 60

ccgaaaagaa ataaaatatt ttcgggaatc gtggtaactg atactttgga actgtatact 120

aagccaagtt taggcccgtt atgcgataaa tcctaggttg gtggagaata cggtttcgtt 180

gttgaagtgg ctgctgttac gcggcgctgg ataagttcag taggctgaaa gacgaggttt 240

ctaccgcgtt atctaagtct acagggaaag taaccgttga ggacactggt gagggtagga 300

cgccggttac ggtggtatta cccatggccg tgaaatctgg ttatactgtt ttcaacaggg 360

agttgaatgt tatggccaat actcatgcat atatacgtct cagtgctctt ttgagccaag 420

ttgagacatg gcagagtacg aggacgagtg tgttgtctca ccttggtatt atgttgaacg 480

gggtaagtaa gttgggggaa cgtaatttct tctcacggag taaacgcttc ggtactcata 540

cccttgacgg ggatgagatc ttttgcgacc ttggcggaga gggggtcagt caggtactga 600

ctagactcac tgtcgctctc ggtgctgcta aaggtgaagg ggcgcagtcc aggaatgcaa 660

agaggggagc accaccggct gctggccaga tagaaacaga agaacaaggg cagactgatc 720

aatcgttggc tatatctaat gctttgggcg aactgatgac ttatgttagt tcgaaagaat 780

acactatgaa tgagtgttac acacaggatt ctttcgaggc taagtataat cttaagtggg 840

aaggttcgag ttgacgggat ggcgtctcgg ataagagtag ggtccaagtg gtggaggatc 900

tgtctaacag actcacactg gctgacgacc tgggtatctt accgagacgc gacaatatgg 960

ggatgatcat caaagatgaa cctgaagttg tgtactcaga actagaagac agattactga 1020

gttttgagca ttcagtttat catccctgtg cgataacagt tgagagagag atatctacta 1080

ctagtgatct actggttgta cctgacactg aagatgtgga gttcgttgag aacgatagtg 1140

ttatcgtcac ggaagtcatg gtggatgatg aatccaatta ctattggctt tatgcggtcc 1200

tgctcatcat ctcctttctt attactggtt ttatagctct gtcacgttct tttattcact 1260

ttcttggtga tggcagacag ggaccaggtg gacaaacacg gtatagaata gccagtgcgt 1320

tgtgggccgt aagactgtgg ttacttcgtc acgctacatt acgtttctgc ggattgggtg 1380

tcgttcgcaa gacgcacacc aggagttcca tgcgtaggta cttgcgtgac tacaattatc 1440

agcttgacat gtgggaagct gctgccagct gttcgcccag cgaggcactg atagtggcgg 1500

atcaacatat attcgtatct ggtgtcatgc gtttgcttga ttacgagggc gatctaacat 1560

gtgtcggcga catcagaaaa gtgatgacca actacggaat gaaaaatttt tcttttgaaa 1620

aatggttaga caagcagacc gttagttgtt ctctagtcgt cctgaatgac aaagtaaaaa 1680

atgatgacgt gcatctcgat gaaaatatgt tatctttgga gaatgcatct atcgaggagg 1740

ttcttgcatg cgttattgaa acgcaaaggg gtagtctcta ctttaatgac atcatcgctt 1800

tgcagttcgc ttttaagctc attggtacac ctgaattttc agactttgta cttgcttaca 1860

aaggccctct gtatccttgt tacgttgaag ccataaagag acatggcgac gagttggcta 1920

agtggcgagt tgatgaggac agaaatagac agagtgaaaa agctatcgag tggttgctgt 1980

tagcaggtca aggtgctttt gttgtatcat caggtgtgac ggtgggagtt ctcatctatc 2040

ggattcataa atggttgaag aagaggttgt tgttgcgtgc tttacagtct ctaccatctg 2100

tgggtgggag ttctggtgga ggtggtggtg cactgcctat gtcagtgctc aatcagtttg 2160

gtcaggctct cacgttcgat gagcgtttgg cggcgttgca acaccatctt gatcttggag 2220

aggataactt ggattattgc tcttctactg accttaaaca agaagttgct aacgttcttg 2280

ctactagggc tgacgatgcc tttcatgttg ctgacgtgcc gtacgttgtc gatgttgtta 2340

ggtctgttgg gtctgtgtcc accaatcttg gtggatctgt tgttggaggt gtaagtgcta 2400

gggtctctga cggtgccagt tcttctctag tgttgagtaa tgcgcgtagt actaagtcta 2460

ggcgtcgttc agtgtccaag aaagataggg tctttcctgg tggttacagt gtgtatagtg 2520

atatgttacc tagtaaaata ggtgggaaaa gtggtgtgag tagtttgaaa atgaaaattg 2580

ctagtaagcc tttggcgatc tagcatgttg tttttgtatt cacactcaat cttaccatta 2640

acgtaatcgt tatgactact ggtactcatt cttgtgagaa gtgtgctaac ggtttctcta 2700

atgtcatctg cgttagtaag tatcgtacta gcgtgtataa atctctaggt ttggttcctg 2760

ttaagtgtcg tctgcctgca gattgtggtg ttaattgtgg tatgcctgca gcttttgttc 2820

tggtgaaagg acatccagag ttgtccatgg atggtttctg cggtgaaaaa cataggggtt 2880

atgtggtttc aggggcatgg cgtatggctc aacttcaaac tttaaatgct gagttggata 2940

agttggaagc cagggaagaa tcgttgcgtt cgcagattcg cggtctgaat gaggccatta 3000

aggcctcaac cgcacccgtt tacgctccaa ttaaacttca aaagctgaaa gttgaagctt 3060

ccagcgtcga tgaaaaaaaa cagactcgta gcactgatct ctgtgctgtg atgacttctg 3120

ttatgactaa gctgtcacct gattccacac cgaaaaaaac tcgtgtggag taattgtgta 3180

tgtccttact gacatctgcg tttgtatctg tgtgtgcgtg ctggattcgg taaccaggat 3240

aaagaacccg gccgaaaatc gttccaaaaa atatggaata aaggaggggc aagtctgtca 3300

ctttggctag aagagttatc acactctata aagaatgacg cggtctttgc gataaaagat 3360

ggtgcttgct atttcaccta aatcgaaata gcgactgggc gtcccgcagt acgtttaaac 3420

tgtagggact atcctctagt ctctactgat gtaattgaaa aaagatcagt attagattgt 3480

gatggggagc gactgggtgt cgcggttgct aagacacagc aactaagagg ggttcaattc 3540

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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atggaacgag ctatacaagg aaacgacgct agggaacaag ctaacagtga acgttgggat 60

ggaggatcag gaggtaccac ttctcccttc aaacttcctg acgaaagtcc gagttggact 120

gagtggcggc tacataacga tgagacgaat tcgaatcaag ataatcccct tggtttcaag 180

gaaagctggg gtttcgggaa agttgtattt aagagatatc tcagatacga caggacggaa 240

gcttcactgc acagagtcct tggatcttgg acgggagatt cggttaacta tgcagcatct 300

cgatttttcg gtttcgacca gatcggatgt acctatagta ttcggtttcg aggagttagt 360

atcaccgttt ctggagggtc gcgaactctt cagcatctct gtgagatggc aattcggtct 420

aagcaagaac tgctacagct tgccccaatc gaagtggaaa gtaatgtatc aagaggatgc 480

cctgaaggta ctgagacctt cgaaaaagaa agcgagtaa 519

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