一种生酮饮食在预防单纯疱疹病毒性脑炎中的应用

摘要

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种生酮饮食在预防单纯疱疹病毒性脑炎中的应用。本发明提前喂食生酮饮食，通过多步动物实验，在动物水平上直接建立疾病模型，再通过处死小鼠解剖获得相关组织进行微观水平实验，在分子水平以及组织病理学水平上探究生酮饮食对单纯疱疹病毒性脑炎的影响，最终证实了生酮饮食发挥抗HSE功能需要通过肠道菌群，在利用ABX处理清除肠道菌群后，其抗HSE作用消失。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种生酮饮食在预防单纯疱疹病毒性脑炎中的应用。

背景技术

HSV-1在全球范围内广泛传播，据统计约70％的人都感染过该病毒，由此可见HSV-1的传播广泛性。且随着对HSV-1的研究不断深入，研究发现由于HSV-1的潜伏感染以及噬神经性等特性，HSV-1已经成为许多疾病的致病因素之一，例如神经退行性疾病AD，PD等。HSV-1引起的单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)是全球最常见的病毒性脑炎，其一旦发病未得到有效治疗情况下，几乎总是致命的，即使在得到阿昔洛韦治疗后，大多数幸存者都表现出严重的神经系统后遗症[102]，由此可见HSV-1引起疾病的多样性与严重性。由于HSV-1具有传播广泛性，又是多种疾病的发病因素，且可引起致命性脑炎，治疗后仍有后遗症等一系列危害人类健康的特点，针对HSV-1进行相关研究刻不容缓。

目前临床治疗HSV-1的阳性药为阿昔洛韦(ACV)，阿昔洛韦对HSV-1的抗病毒效果良好，但是由于ACV的滥用，越来越多的耐ACV株不断出现，导致ACV治疗无效化。所以，针对HSV-1开发新的抗病毒策略迫在眉睫。在由HSV-1引起的HSE中，HSV-1导致患者脑组织坏死，其中很大程度上除了HSV-1本身导致的病毒感染损伤外，宿主自身的炎症反应也是导致HSE患者具有极高死亡率和神经系统后遗症的原因。

生酮饮食作为一种高脂中等蛋白低碳水的饮食方案，由于其改变了身体进行能量代谢的方式，对于多种疾病都有其独特的效果，也具有着抗炎，提高免疫力从而抵抗病毒感染，抗癌，减肥等多重作用。其中，生酮饮食对于帕金森综合症以及阿尔兹海默症等神经退行性疾病也都有其独特效果，以及对多发型硬化症(MS)等中枢神经炎性疾病也有一定的改善作用，可见生酮饮食与神经系统具有一定的相关性，又因为其具有的抗炎功效，从而可以作为临床的一种治疗策略，而HSV-1作为一种与神经息息相关的病毒，可以引发HSE，同时也是阿尔兹海默症，帕金森综合症的致病因素，那么生酮饮食是否可以起到预防或者治疗改善HSE的作用呢？且由于生酮饮食作为一种饮食方案，其与肠道菌群的关系极为密切，例如生酮饮食已显示可以使肠道菌群中“有益细菌”如SCFA的生产者Akkermansia muciniphila(黏液阿克曼氏菌)和Lactobacillus(乳酸菌)增加，这与脑血流量增加和β-淀粉样蛋白清除有关，这可以降低患AD的风险[58]。除此之外，有关生酮饮食与肠道菌群的相关研究在近些年越来越多，可见生酮饮食与肠道菌群的关联性。

肠道菌群在神经系统疾病中发挥着重要的作用，已有研究证明肠道菌群对于人体多个器官都有重要作用，包括脑，且出现了脑肠轴这样的概念，脑肠轴是一个虚拟但动态的双向神经内分泌系统。肠道菌群与脑中的炎症细胞例如小胶质细胞的关系也十分密切，肠道菌群是小胶质细胞成熟和发挥功能的前提，而小胶质细胞对HSV-1的侵入起到了极其重要的抵御作用。这表明神经系统与肠道菌群具有密切关联。

综上所述，可见生酮饮食，肠道菌群以及神经系统相关疾病三者的关联性和研究的可行性，同时HSV-1引起的HSE作为一种可危及生命的病毒性脑炎，也具有十分重要的研究意义。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明通过对生酮饮食的深入研究，首次证实了其可用于预防单纯疱疹病毒性脑炎。有效扩大了生酮饮食的应用范围。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种生酮饮食在预防在预防单纯疱疹病毒性脑炎中的应用，所述生酮饮食通过肠道菌群发挥作用。

优选地，所述生酮饮食由高含量脂肪，中等含量蛋白和低含量碳水化合物组成，所述脂肪含量为78％，蛋白质含量为17％，碳水化合物含量为5％，可购自睿博天津生物科技有限公司，采用Harlan Teklad TD.07797.PWD的配方。

优选地，所述生酮饮食在感染单纯孢疹病毒性脑炎之前喂食。

优选地，所述单纯疱疹病毒性脑炎是由Ⅰ型单纯疱疹病毒感染引起的，所述Ⅰ型单纯疱疹病毒为球型颗粒状病毒，由囊膜，皮层，衣壳，核心四个部分组成。

优选地，所述肠道菌群包括厚壁菌门，拟杆菌门，放线菌门，变形菌门，梭杆菌门，疣微菌门。

优选地，所述厚壁菌门及拟杆菌门占肠道菌群总量的90％，所述厚壁菌门包括乳酸菌，杆菌，梭菌，肠球菌，瘤胃球菌。

优选地，所述生酮饮食通过调节肠道菌群的组成，降低肠道菌群多样性，达到预防单纯疱疹病毒性脑炎作用的。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：首次探讨了生酮饮食与HSE的关系，发现提前喂食生酮饮食具有一定的抗HSE作用并证明了生酮饮食发挥其抗HSE作用需要通过肠道菌群。

附图说明

图1为HSE小鼠模型构建结果；

图2为在动物水平上生酮饮食对HSE的表观作用；

图3为生酮饮食降低脑中各组织炎症因子表达量结果图；

图4为HE染色切片结果图；

图5为提前喂食生酮饮食预防HSV-1对脑部的感染效果图；

图6为抗生素清除肠道菌群不影响小鼠生长情况图；

图7为肠道菌群缺失后在动物水平上生酮饮食对HSE的表观作用结果；

图8为肠道菌群缺失后生酮饮食抗炎作用消失情况；

图9为肠道菌群缺失后生酮饮食预防HSV-1对脑部感染的作用消失情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1小鼠模型建立

1.试验材料：非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞购买于美国菌种收集中心(ATCC)，放置于37℃，5％CO

2.试验过程：经细胞复苏、细胞的处理传代与铺板、细胞冻存、HSV-1的活化培养、HSV-1的纯化等过程进行病毒增殖，根据细胞最终病变情况计算病毒滴度TCID

2.1动物试验

自广东省医学实验动物中心购入22只雄性5周龄BALB/c小鼠，置于SPF级动物房饲养，首先为使小鼠处于正常生理状态以防更换饲养环境带来刺激，自购入起适应性喂养一周。鼠房灯光模仿自然条件，早上7点开灯，晚上7点关灯，控制12h白天，12h黑夜，模仿自然界昼夜交替规律。适应性饲养全程保证充足的水与鼠粮。

适应性喂养结束后，称量小鼠体重，根据小鼠体重随机分笼，尽可能使组别之间没有体重显著差异，以排除初始体重因素对实验的干扰。将22只小鼠分为两组，分别为CTRL组和HSE组，每组11只。HSE组小鼠进行滴鼻感染，接种HSV-1病毒，每只小鼠滴鼻2×10

使用颈椎脱臼法快速处死小鼠，喷75％酒精至小鼠头颈部，使用提前高温高压灭菌过的手术器械取出脑组织，注意需取全脑以便后续进行组织病理学实验。需小心剪开小鼠皮毛，掀起头盖骨，将包括嗅球(Olfactory bulb，OB)，大脑皮层(Cerebral cortex，CX)，脑桥/延髓/小脑(Pons/medulla oblongata/cerebellum，P/M/C)的全脑完整取出，放入提前准备好的生理盐水中清洗，随后使用滤纸吸干表面水分，多聚甲醛固定。

2.2组织病理学实验

2.2.1 HE染色

提前将5mL4％多聚甲醛倒入15mL离心管中，解剖小鼠取出全脑，用生理盐水将全脑清洗后使用滤纸吸干水分，放入含有多聚甲醛的离心管中，常温保存即可。具体操作过程如下：

(1)组织经多聚甲醛固定后，在做切片前，需使用纯水冲洗1h。其目的是去除组织中残留固定液，避免影响后续染色。然后依次放入70％、75％、80％、85％、90％不同浓度乙醇溶液中脱水处理，随后使用酒精、二甲苯等量混合液浸泡组织15min。接着放入二甲苯：石蜡等于1:1的混合液中浸泡1h，再分别放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ中透蜡1h后，将组织放入包埋盒的底部，向其中加入熔化的石蜡，降温后使其凝固；(2)切片：推动刀片贴近组织石蜡块；调整刀片与石蜡块的位置，使两者角度约成18°左右；转动厚度调节器到所需的约5μm的切片厚度；全部准备就绪后开始切片。使用右手摇动转轮，将蜡块切割成蜡带，左手使用毛笔提起蜡带，注意需缓慢摇动转轮；切成的蜡带至25cm左右时，使用另一支毛笔将蜡带挑起，避免卷曲，随后牵引成带；(3)展片：提前向展片机中加入水且预热到37℃，随后切割蜡带，光滑面朝下放入水中，待其展开以后，将提前准备好的洁净载玻片放入水下，使用镊子拨动蜡片使其附于载玻片上；随后将载玻片做好标记后置于37℃温箱中烘干水分，过夜，干燥后取出存放于切片盒等待染色；(4)石蜡切片脱蜡至水：切片放入二甲苯Ⅰ中20min后拿出，随后放入二甲苯Ⅱ中浸泡20min，再使用无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ浸泡各5min，最后放入75％酒精中5min，使用纯水冲洗；(5)苏木素染色：切片放入苏木精中染色约5min，再用自来水冲洗约10min，将切片放入1％盐酸乙醇液(分化液)中分化，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒钟，再使用返蓝液返蓝，流水冲洗；(6)伊红染色：切片放入85％酒精脱水5min，再更换95％酒精后脱水5min，随后用0.5％伊红水溶液对比染色2～5min。随后用水冲洗4min，洗去浮色；(7)脱水封片：依次使用无水乙醇I和无水乙醇II和无水乙醇Ⅲ浸泡切片各5min后，随后使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ浸泡5min透明，随后滴树胶在组织上，盖压盖玻片，避免气泡产生。

2.2.2免疫组化

提前将5mL4％多聚甲醛倒入15mL离心管中，解剖小鼠取出全脑，用生理盐水将全脑清洗后使用滤纸吸干水分，放入含有多聚甲醛的离心管中，常温保存固定，后续孵育anti-HSV-1抗体。具体操作过程如下：

(1)组织的脱水，包埋，切片，展片同HE染色；(2)首先用二甲苯脱蜡，使用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ和二甲苯III分别浸泡切片各15min，随后使用不同浓度的酒精和水使切片复水，使用无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ依次浸泡切片5min，随后按顺序使用85％酒精、75％酒精、纯水分别冲洗5min；(3)抗原修复：提前使用微波炉预热配置好的抗原修复液(枸橼酸缓冲液)，将切片置于盛满EDTA(PH9.0)抗原修复液的修复盒中，随后微波炉中火加热8min至沸腾(注意此步不能让修复液过度蒸发，避免切片变干)，停火8min冷却再转中低火加热6min。等待温度下降后将玻片浸没于PBS中，摇动洗涤4次，每次4min；(4)阻断内源性过氧化物酶活性：将组织切片置于3％双氧水溶液中，在室温下孵育25min，注意此步需避光，将玻片浸没于PBS中，摇动洗涤4次，每次4min，；(5)血清封闭：向组织上滴加3％BSA均匀覆盖，在室温下封闭30min；(6)加一抗：结束封闭后，甩去封闭液，使用滤纸吸去残存液体，随后在切片上缓慢滴加由PBS按比例稀释好的一抗直至可以将组织完全覆盖，切片置于湿盒内放在4℃冰箱孵育过夜(使用湿盒的目的是为了防止抗体蒸发)；(7)加二抗：将切片从冰箱取出后放入PBS中，使用摇床清洗三次，每次5min。甩干切片后，向其中滴加与一抗相对应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，在室温下孵育55min；(8)DAB显色：首先提前配制DAB显色液，将玻片放入PBS(PH7.4)中，使用摇床清洗三次，每次5min。甩干切片后，滴加提前配制的DAB显色液，放于显微镜下观察，出现棕色且背景无明显颜色时即可停止，阳性颜色为棕黄色，使用自来水冲洗，显色终止；(9)复染细胞核：使用苏木素复染3min，使用流水冲走浮色，随后使用分化液，进行分化10秒，再次冲洗后，使用返蓝液返蓝后，流水冲洗；(10)脱水封片：使用75％酒精和85％酒精各浸泡5min，随后依次使用无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ和二甲苯Ⅰ各5min透明，拿出后稍晾干，滴树胶在组织上，盖压盖玻片，避免气泡产生；赛维尔生物科技有限公司代工完成本实验。

2.3数据处理

使用Graphpad prime 5作图分析，两组作Student’s t检验对比，p<0.5为显著差异，表示为*；p<0.1为极显著差异，表示为**。所有实验数据呈现方式为平均值(Mean)±标准误(SEM)。

3实验结果：

通过上述动物实验方法利用HSV-1滴鼻感染HSE组小鼠。在感染5天左右，HSE组小鼠眼部有溃烂，精神萎靡，行动迟缓，刺激反应缓慢，出现身体震颤，步态失衡等症状，头部外观与正常小鼠出现显著差异(图1A)。分析对比CTRL组小鼠和HSE组小鼠体重可知，在感染前4天HSE组小鼠同CTRL组小鼠趋势一致，都在平稳小幅上升。在第6天时，HSE组小鼠体重骤降，直至处死前体重不断下降,CTRL组小鼠体重依然平稳小幅上升(图1B)，同时HSE组出现HSE相关症状后有小鼠死亡，在第8天生存率已降到50％，CTRL组小鼠存活率为100％(图1C)。CTRL组和HSE组小鼠出现症状后即开始进行神经行为学评分，从眼部溃烂程度，刺激有无反应，爬行步态是否正常三个方面分析其行为，处死前将症状评分相加得到最后总分(图1D-G)，根据严重程度分为0，1，2，3四个评分等级，0表示无症状，3表示出现严重症状。如图2D-G所示，HSE组小鼠评分无论在眼部，步态，刺激三个方面评分都显著高于正常组小鼠。将解剖后固定在多聚甲醛中的脑组织进行免疫组化和HE染色，发现HSE组小鼠脑部出现了病毒蛋白，且出现了炎症反应。CTRL组小鼠脑组织中并未发现病毒蛋白和炎症反应(图1H-I)。

综上所述，HSE组小鼠出现了显著的单纯疱疹病毒性脑炎症状，利用滴鼻感染建立HSE小鼠模型行之有效，后续实验会继续利用该方法建立HSE疾病动物模型。

实施例2生酮饮食预防HSE作用探究

1.试验样品：生酮饲料采用Harlan Teklad TD.07797.PWD的配方，购买于睿博(天津)生物科技有限公司；普通饲料购买于广东省医学实验动物中心；其他涉及到的细胞、病毒及动物来源与实施例1相同；

2.试验方法：先进行病毒扩增(按照实施例1所述方法进行病毒扩增)，然后进行动物试验；动物试验过程如下：自广东省医学实验动物中心购入96只雄性5周龄BALB/c小鼠，置于SPF级动物房饲养，首先为使小鼠处于正常生理状态以防更换饲养环境带来刺激，自购入起适应性喂养一周。鼠房灯光模仿自然条件，早上7点开灯，晚上7点关灯，控制12h白天，12h黑夜，模仿自然界昼夜交替规律。适应性饲养全程保证充足的水与鼠粮。适应性喂养结束后，称量小鼠体重，根据小鼠体重随机分笼，尽可能使组别之间没有体重显著差异，以排除初始体重因素对实验的干扰。

将96只小鼠分为六组，分别为CTRL+CD组，CTRL+KD组，HSE组，HSE+KD组(造模后喂食生酮饲料)，KD+HSE+KD组(造模前一周提前喂食生酮饲料)，HSE+ACV组，每组16只。HSE组，HSE+KD组，KD+HSE+KD组，HSE+ACV组小鼠进行滴鼻感染，接种HSV-1病毒，每只小鼠滴鼻2×106PFU病毒，在接种过程中，需两人共同完成，一人负责抓握老鼠固定牢固，一人负责滴入病毒，需逐滴缓慢滴入以防小鼠直接喷出。CTRL+CD组，CTRL+KD组作阴性对照需接种等体积培养基，接种操作方法同病毒处理组。接种完成后，随后每天进行小鼠称重及观察生理状态，饲养过程中保证小鼠水粮充足，当小鼠体重显著下降且生理状态很差时，准备进行处死。

使用颈椎脱臼法快速处死小鼠，喷75％酒精至小鼠头颈部，使用提前高温高压灭菌过的手术器械取出脑组织，每组6只小鼠取全脑以便后续进行组织病理学实验，需小心剪开小鼠皮毛，掀起头盖骨，将全脑完整取出，放入提前准备好的生理盐水中清洗，随后使用滤纸吸干表面水分，放入装有多聚甲醛的15mL离心管中固定。每组6只小鼠分别取出嗅球(Olfactory bulb，OB)，大脑皮层(Cerebral cortex，CX)，脑桥/延髓/小脑(Pons/medullaoblongata/cerebellum，P/M/C)，使用生理盐水清洗干净并使用滤纸吸干表面水分后，分别装入1.5mL进口EP管后立即加入300μLTrizol，以备后续提取组织RNA。每组4只小鼠取全脑，使用生理盐水清洗干净并使用滤纸吸干表面水分后，装入空的已灭菌的1.5mL进口EP管，以备后续提取组织中的病毒DNA，以上1.5mL进口EP管皆放置于冰上，随后快速转移至-80℃冰箱中保存样品，分别获得Trizol组织、全脑组织等。

组织病理学试验，试验过程与实施例1中的2.2过程相同；

动物组织RNA的提取：(1)动物样品处理：将获得的Trizol组织使用提前灭菌后的剪刀和电动匀浆器剪碎研磨，补充700μLtrizol至1mL，放入-20℃冰箱过夜，使其充分裂解，第二天提前取出解冻，预冷制冷离心机至4℃，设置800rcf，10min离心，随后取上清至新EP管，做好标记，一般OB可以取上清800μL，CX与PMC可取500μL，然后向每管滴加Trizol至1mL；(2)RNA的提取：①向每管按Trizol与氯仿5：1的比例加入200μL氯仿，使用涡旋混匀器震荡至粉红色，随后冰上静置3min；②4℃，12000g(rcf)，15min离心；③离心后取新EP管做好标记后，吸取最上层的透明层300μL至新EP管中,再加入等体积异丙醇上下颠倒混匀，冰上静置10min；④4℃，12000g，10min离心；⑤离心后观察EP管底部出现小白点，小白点朝上倾倒废液，小白点即为RNA；⑥加入75％乙醇洗涤，使用涡旋混匀器振荡，4℃，12000g，5min进行离心；⑦离心完成后倾倒废液，使用掌上离心机离心1min，吸取废液；⑧加入DEPC水溶解RNA，将样品放置冰上；⑨使用紫外分光光度计测量提取出的RNA浓度和纯度；(3)RNA反转录为cDNA：①根据紫外分光光度计测出的每个样品的RNA浓度，计算反转为cDNA的所需体积，采用20μL反转录体系，2000ng/每个样品的RNA浓度＝x样品体积(μL)，16-x＝DEPC水所需体积(μL)，再每管加入4ul逆转录酶PrimeScript

动物组织DNA的提取：(1)样品处理：将全脑组织从-80℃冰箱中拿出，使用天平称量，保证每管内的脑组织重量一致，随后加入不含血清的DMEM，加完后使用提前灭菌的剪刀将组织块剪碎，放入-80℃冰箱反复冻融三次，观察若发现依然有大组织块团，可以使用电动匀浆器轻微研磨，注意不要研磨过头。随后放入制冷离心机离心(800rcf，10min)后取上清至新EP管中，使用全式金病毒基因组DNA试剂盒提取病毒DNA；(2)病毒DNA的提取：采用全式金生物病毒DNA提取试剂盒，货号为ER201-02，按照试剂盒中说明书进行病毒DNA提取。(3)DNA浓度的测定：使用紫外分光光度计测量提取出的DNA浓度和纯度，记录于记录本上。后续进行qPCR实验，根据qPCR板每孔可以检测到的分子量范围，加入DEPC水稀释DNA至相同倍数；DNA样品制备完成，放于-20℃冰箱保存。

引物设计：本研究中均从NCBI网站获取得到目的基因的CDS序列，采用NCBI网站Primer BLAST设计，引物为跨内含子设计(引物信息同表1)，合成均在擎科生物技术有限公司完成，使用DEPC水将引物粉末溶解为10μM的母液，保存于-20℃。

实时荧光定量PCR扩增：(1)提前准备材料：①提前打开制冰机，随后实验过程中将待测样品放置冰上；根据检测基因与样品数确定PCR板数，将PCR板与膜准备完毕。找到待测基因的相关引物与荧光酶，将cDNA样品从-20℃冰箱取出，4℃解冻；②预先计算好每个基因所需孔数，规划好加样顺序，根据所需孔数计算得出上下游引物(各引物序列信息见表1)以及荧光酶所需体积，提前混合反复抽吸混匀(根据每孔引物(Forward)0.5μL；引物(Reverse)0.5μL；(2xSYBR Premix Ex TaqTMII)5μL的比例配置混合液)，避光置于4℃冰箱备用；③稀释cDNA样品，根据浓度和PCR仪的每孔适宜检测量确定稀释倍数，加入DEPC水，将样品放入掌上离心机，离心后拨弄混匀再离心，置于冰上备用。(2)开始加样：①将稀释好的cDNA样品依次加入PCR板中，注意需直接加到板底，每孔4μL；②将提前配置好的引物与荧光酶的混合液依次加入PCR板中，注意直接加到板壁上，避免接触板底cDNA样品，每孔6μL，全程需避光；③加完样品后，使用配套PCR膜将PCR板粘牢密封；④将板置于96孔板离心机中离心，使用废旧PCR板配平，4℃，2500rpm/min，3min；⑤在电脑上设板，离心结束后，将板置于PCR仪中，按照下列程序开始扩增：95℃30s，95℃5s，60℃30s，GO TO Step2 39循环，MeltCurve from 65℃to 95℃，Read every0.5℃，For 5s+Plate read，end；⑥扩增结束后，得到各个孔的CT值，首先通过观察溶解曲线，判断引物的特异性，选择内参基因GAPDH作为参照基因，使用系统自身分析软件CFX manager software软件分析结果。

数据处理：使用Graphpad prime 5作图分析，两组作Student’s t检验对比，p<0.5为显著差异，表示为*；p<0.1为极显著差异，表示为**。所有实验数据呈现方式为平均值(Mean)±标准误(SEM)。

表1 qPCR涉及到的引物序列

3.试验结果：

3.1生酮饮食对HSE的表观作用：具体试验结果如图2所示，通过采用上步HSE造模实验方法，对HSE组，HSE+KD组，KD+HSE+KD组，HSE+ACV组小鼠进行滴鼻感染。在感染4天左右，病毒处理组出现明显HSE相关症状，外观与CTRL组小鼠出现显著差异，随着感染时间延长，可明显见到接种病毒处理组的小鼠眼部溃烂，且HSE组与HSE+KD组溃烂的严重程度较高，KHK组与HSE+ACV组眼部溃烂的严重程度较低，CTRL+CD与CTRL+KD组眼部正常(图2A)。在病毒接种后第4天，病毒处理组出现了明显的体重下降趋势，降幅平均在1-2g之间，且HSE组小鼠的体重下降幅度更大，处死前的平均体重最低，而CTRL+CD与CTRL+KD组体重保持平稳(图2C)。KD预处理会导致小鼠体重相比于正常饮食生理性减轻(图2B)，如前所述，这可能与生酮饮食的减重效果有关。在小鼠出现HSE相关症状后开始进行行为学评分，从眼部溃烂程度，刺激反应以及爬行步态3个方面对病毒处理组每只小鼠评分并每天记录，观察3种症状的不同处理组的发展趋势，处死前将症状评分相加得到最后总分，可以看出，HSE组小鼠无论是在症状发展趋势以及最终的综合症状都是得分最高(图2D-G)，生酮处理组的神经相关疾病行为学评分显著下降。在生存率方面，HSE组率先出现小鼠死亡，且最终死亡率最高，KHK组与HSE+KD组小鼠死亡率相比于HSE组有所下降(图2H)。KHK组曾有最低体重在12.3的小鼠依然存活，综合以上结果初步表明，生酮饮食具有一定的抗HSE作用，尤其是提前喂食KD的KD预处理组在动物实验表观水平上效果更好。我们接下来对生酮饮食是如何发挥抗HSE作用进行了进一步的探究。

3.2生酮饮食可以减轻HSE脑部炎症：具体试验结果如图3所示，HSE是由病毒感染导致的大脑炎症反应，其会持续激活小胶质细胞等免疫细胞，引起一系列免疫反应，释放TNF-α等细胞因子，造成神经元的损伤，神经元的损伤后又会进一步激活小胶质细胞，进入恶性循环，造成脑组织的不可逆损伤。由此，我们检测了小鼠的OB，CX，PMC中炎症相关因子表达量。IL-6是白细胞介素的一种，它可以激活免疫细胞。TNF-α是肿瘤坏死因子，它可以促进T细胞释放多种炎症相关因子，进而发挥促炎作用。NOS2在细胞接受到刺激后发挥作用，可产生NO，严重损伤神经元刺激炎症反应。由图3A-I所示，我们分别检测了IL-6，TNF-α，NOS2在各区脑组织中的表达量，可以看出，KHK组相比于HSE组，在各区脑组织中大部分炎症相关因子的表达量都显著下调，HSE+KD组与HSE组在炎症相关因子表达量上基本没有显著性差异。

HE染色切片结果显示，CTRL+CD组与CTRL+KD组切片视野内神经元数量多、排列十分紧密，神经元形态结构正常、极其少量神经元发生皱缩(黑色箭头)，核质分界清晰、核仁明显，未见明显炎症。HSE组切片视野内多见神经元出现皱缩，细胞染色加深，核质分界模糊(黑色箭头)；局部可见胞质空泡化(黄色箭头)；局部可见组织软化，较多神经元坏死，核碎裂或溶解(红色箭头)，伴有淋巴细胞点状浸润(蓝色箭头)。HSE+ACV组切片视野内可见少量神经元皱缩，细胞染色加深，胞核胞质分界模糊(黑色箭头)。HK组切片视野内局部可见少量神经元坏死，细胞核碎裂(黑色箭头)；少量神经元胞质出现空泡化(黄色箭头)。KHK组切片视野内可见少量神经元皱缩，细胞染色加深，核质分界模糊(黑色箭头)(图4)。KHK组与HK组在病变程度上均小于HSE组。

切片评分标准如下：显微镜下仔细观察组织切片并记录组织学变化。组织病变程度采用五级分法，无病变或极少量病变计分为0；有轻度病变或少量病变计分为1；有中度病变或中等量病变计分为2；有重度病变或多量病变计分为3；有极重度病变或大量病变计分为4。组织病理学切片评分见如下表2所示：

表2组织病理学切片评分结果

综上结果表明，提前喂食生酮饮食在感染HSV-1后具有一定的减轻HSE脑部炎症的作用。

3.3提前喂食生酮饮食可以预防HSV-1对脑部的感染：通过提取小鼠全脑中的病毒DNA来检测在生酮处理后的脑中病毒DNA含量，由图5A-C可以看出，提前喂食生酮饮食的KD预处理组小鼠相比于HSE组脑中的病毒DNA含量显著下降，而在感染病毒后再喂食生酮饮食的HSE+KD组则没有抵抗病毒感染的效果。免疫组化结果显示，KHK组中小鼠脑部的病毒含量要小于HSE组小鼠中脑部病毒含量(图5D)。综上表明，提前喂食生酮饮食会提高小鼠的抗病毒感染能力。

实施例3生酮饮食通过肠道菌群发挥抗HSE作用

1.试验材料：试验中涉及到的细胞，病毒，动物及动物饲料均与实施例2相同；

2.试验方法：先进行病毒扩增，然后进行动物试验，动物试验过程如下：自广东省医学实验动物中心购入22只和80只5周龄雄性BALB/c小鼠，置于SPF级动物房饲养，首先为使小鼠处于正常生理状态以防更换饲养环境带来刺激，自购入起适应性喂养一周。鼠房灯光模仿自然条件，早上7点开灯，晚上7点关灯，控制12h白天，12h黑夜，模仿自然界昼夜交替规律。适应性饲养全程保证充足的水与鼠粮。适应性喂养结束后，称量小鼠体重，根据小鼠体重随机分笼，尽可能使组别之间没有体重显著差异，以排除初始体重因素对实验的干扰。

将22只小鼠分为两组，分别为CTRL组和ABX组，探究抗生素处理对小鼠带来的影响。将80只小鼠分为5组，分别为HSE组，HSE+KD组，KD+HSE+KD组，ABX+KD+HSE组(造模前一周开始喂食ABX+KD)，HSE+KD+ABX组(造模后开始喂食ABX+KD)，每组16只。全部进行滴鼻感染接种HSV-1病毒，每只小鼠滴鼻2×106PFU病毒，在接种过程中，需两人共同完成，一人负责抓握老鼠固定牢固，一人负责滴入病毒，需逐滴缓慢滴入以防小鼠直接喷出。接种完成后，随后每天进行小鼠称重及观察生理状态，饲养过程中保证小鼠水粮充足，当小鼠体重显著下降且生理状态很差时，准备进行处死。

使用颈椎脱臼法快速处死小鼠，喷75％酒精至小鼠头颈部，使用提前高温高压灭菌过的手术器械取出脑组织，每组至少三只小鼠分别取出嗅球(Olfactory bulb，OB)，大脑皮层(Cerebral cortex，CX)，脑桥/延髓/小脑(Pons/medulla oblongata/cerebellum，P/M/C)，使用生理盐水清洗干净并使用滤纸吸干表面水分后，分别装入进口EP管后立即加入300μLTrizol，以备后续提取组织RNA。每组至少三只小鼠取全脑，使用生理盐水清洗干净并使用滤纸吸干表面水分后，装入空的已灭菌后的1.5mL进口EP管，以备后续提取组织DNA，以上1.5mL进口EP管皆置于冰上，随后快速转移至-80℃冰箱中保存样品。

动物组织RNA的提取、DNA提取、引物设计、实时荧光定量PCR扩增及数据处理过程均与实施例2相同。

3.试验结果：

3.1抗生素清除肠道菌群不影响小鼠生长：喂食ABX组小鼠饮用由新霉素1g，甲硝唑1g，氨苄霉素1g，万古霉素0.5g配制的1L抗生素水2周，随后观察其生理状态，可见ABX组小鼠与饮用普通纯水的CTRL组小鼠在行为以及生理状态上并无差异。ABX组小鼠体重一开始略小于CTRL组，逐渐适应抗生素水后体重逐渐上升。处死ABX组与CTRL组小鼠后，取其心肝脾肺肾，对比两组中脏器与体重的比例，ABX组小鼠的脏器与体重比与CTRL组基本一致，说明抗生素处理并没有对小鼠各项机能造成负面影响(图6A)。对比ABX组与CTRL组小鼠的盲肠，发现经ABX处理的小鼠盲肠更加粗大，内容物发黑(图6B)。通常，由于缺乏肠道微生物组，无菌动物的盲肠增大，盲肠内容物含量增多。这与之前文献报道一致，说明ABX处理达到了预期效果。

3.2肠道菌群缺失后生酮饮食对HSE的表观作用：通过对HSE组，HSE+KD组，KD+HSE+KD组，ABX+KD+HSE组，HSE+KD+ABX组小鼠进行滴鼻感染。在处死前进行小鼠外观拍照，可以看出经ABX处理的小鼠的头部脑炎症状更加明显(图7A)。在病毒接种后，ABX处理组小鼠的死亡率最高。(图7B)。ABX+KD预处理会导致小鼠体重相比于仅KD处理小鼠降幅更大，这与上一步实验中ABX组和CTRL组小鼠中ABX处理小鼠的体重变化一致，小鼠对于抗生素水的不适应是其主要原因(图7C)。在造模后，ABX处理组的小鼠体重依然是最小的(图7D)。在小鼠出现HSE相关症状后开始进行行为学评分，从眼部溃烂程度，刺激反应以及爬行步态3个方面对病毒处理组每只小鼠评分并每天记录，观察3种症状的不同处理组的发展趋势，处死前将症状评分相加得到最后总分，可以看出，在经ABX处理后小鼠无论是在症状发展趋势以及最终的综合症状得分都相较于仅KD处理组显著升高(图7E-H)。综合以上结果发现，生酮饮食的抗HSE作用，在经由ABX清除肠道菌群后消失，初步表明生酮饮食发挥该作用需要肠道菌群的参与。

3.3肠道菌群缺失后生酮饮食抗炎作用消失：在利用分子实验检测了ABX处理后对于KD抗HSE作用影响时。检测了每组小鼠的OB，CX，PMC中炎症相关因子IL-6，TNF-α，NOS2的表达量，由图8A-I所示，KHK组相比于HSE组，在各区脑组织中大部分炎症相关因子的表达量都显著下调，而在经ABX处理清除肠道菌群后，炎症相关因子的表达量上调，说明KD需要通过肠道菌群才能发挥其抗炎作用。

3.4肠道菌群缺失后生酮饮食预防HSV-1对脑部感染的作用消失：通过提取小鼠全脑中的病毒DNA来检测在生酮处理后的脑中病毒DNA含量，由图9A-C可以看出，提前喂食生酮饮食的KD预处理组小鼠相比于HSE组脑中的病毒DNA含量下降，但经ABX处理清除肠道菌群后，其KD预处理组一定的预防病毒感染的作用消失，综上表明，提前喂食生酮饮食的所具有的一定的预防病毒感染的能力也需要通过肠道菌群来发挥作用。

最后应当说明的是，上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种生酮饮食在预防单纯疱疹病毒性脑炎中的应用

<130> 2021.6.2

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> mGAPDH-F

<400> 1

gtcattgaga gcaatgccag 20

<210> 2

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