一种保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽及其制备方法

摘要

一种保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽及其制备方法，属于活性肽制备技术领域。本发明以压榨后核桃粕(油脂质量分数为23.56％)为原料，采用螺杆挤压(单、双)和超声预处理，利用酶控制水解技术，增加底物浓度和水解度，通过分离纯化，制备具有保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽(＜3kDa)组分和氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK，其酶解底物浓度(质量分数)达到9％～15％，水解度达到29.3％～42％；核桃活性肽(＜3kDa)组分可以改善东莨菪碱诱导小鼠学习和记忆损伤，核桃肽YVLLPSPK可以改善Aβ

说明书

技术领域

本发明属于活性肽制备技术领域，具体涉及一种直接以压榨后核桃粕为原料高效制备具有保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽(＜3kDa组分和序列YVLLPSPK)及其制备方法。

背景技术

随着全球人口老龄化进程加快，我国亦面临着剧烈的人口结构变化。据国家统计局公报显示，截止2018年底，我国60岁以上人口高达2.49亿，预计2050年将达到4.79亿。其中，约有17.9％患有严重的记忆障碍。并且随着年龄增长，记忆功能加速恶化，一般在初发阶段的3～9年内导致失语、失认、失用、视空间损害、执行功能障碍、人格障碍以及生活自理能力障碍等全面性功能障碍，更严重者为痴呆症。2019年9月世界卫生组织统计，全球5000万人正在被痴呆症所困扰，预计2030年将增加到8200万人，2050年将增加到1.52亿人。因痴呆症发病机理不明确，治疗手段受限，给患者、家庭和社会带来沉重的精神压力及经济负担。临床治疗显示，阿尔茨海默症初期(记忆功能障碍阶段)的治疗和干预是延缓痴呆症发生和发展的最佳时期。而食源性功能因子在膳食营养干预方面具有预防早、无毒无害、无思想负担等药物治疗无法比拟的优势。因此，寻找绿色、安全、高效且具有神经保护活性的天然分子进行膳食干预对预防或延缓记忆损伤具有重要意义。

大量研究表明，氧化应激、细胞自噬、线粒体功能障碍、细胞凋亡、神经递质的释放与传递以及神经炎症因子广泛参与了其致病过程。其中，氧化应激在记忆损伤、减退及丧失的发展过程中起着非常重要的作用。氧化应激是指由于细胞内源性抗氧化系统不能有效清除堆积的自由基，导致机体氧化和抗氧化系统失衡，ROS大量积累，促使细胞产生毒性，从而诱发一系列生理活动紊乱，最终引发多种疾病。由氧化应激诱导神经元内信号传导异常是导致记忆功能障碍的主要诱因。因此，改善神经细胞氧化应激是预防记忆减退及丧失，延缓痴呆症发生与发展的重要手段之一。

随着人们对食源性植物蛋白开发与利用关注的日益激增，利用酶工程技术制备活性肽进而探讨其所具有的生理功能已经成为科研工作者的研究热点。其中，植物源的抗氧化性受到越来越多学者的青睐。目前，利用压榨核桃粕制备功能性肽过程中，底物浓度通常为质量分数3％～13％，水解度为11％～27％，因此，限制了工业化高效生产及应用。同时，压榨后核桃粕中含有的油脂质量分数高达33％，严重降低了酶解效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽组分(＜3kDa)和氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK(氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK是由改善记忆力活性肽组分(＜3kDa)通过Sephadex G-25凝胶渗透层析柱、Sephadex G-15凝胶渗透层析柱、反向-高效液相分离纯化，最后由高效液相电喷雾串联质谱鉴定得到，分子量为916.14Da)及其制备方法。

为提高活性肽制备效率，本发明以压榨后核桃粕(油脂质量分数为23.56％)为原料，采用螺杆挤压(单、双)和超声预处理，利用酶控制水解技术，增加底物浓度和水解度，通过分离纯化，制备具有保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽(＜3kDa)组分(以质量分数为9％～15％的脱脂核桃粕为底物，根据本发明的酶解条件进行酶解，所获得蛋白水解度最大，达到29.3％～42％)和氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK。本发明高效制备了保护神经细胞氧化应激的明显改善记忆力的核桃活性肽，为活性肽工业化高效制备以及产品开发提供依据和参考。

本发明所述的一种保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽的制备方法，其步骤如下：

(1)核桃粉预处理

将压榨核桃粕(直接购买得到)粉碎后(出料粒度为50～300目)与蒸馏水配成水分含量为10％～40％的核桃粉溶液，倒入螺杆挤压膨化机进料口，调节螺杆转速至70r/min～300r/min，套杆温度至80℃～160℃，进行挤压处理；将挤压后的核桃粉再与蒸馏水按照质量1：2～18的比例搅拌混合，在20kHz～90kHz条件下超声处理10min～60min，然后于3000rpm～8000rpm条件下离心10min～40min，倒掉上清液，留取沉淀；

(2)核桃酶解液制备

将步骤(1)得到的沉淀物溶于蒸馏水配成质量分数为2％～25％溶液，在80℃～100℃条件下水浴5min～20min使蛋白变性，冷却至室温后调节溶液pH至6.0～9.0；加入碱性蛋白酶，加酶量为1000U/g～20000U/g，调节溶液pH至8.0～11.0，在40℃～70℃下酶解0.5h～6h，然后在90℃～100℃下灭酶10min～20min；冷却至室温后调节溶液pH至6.0～9.5，3000rpm～9000rpm条件下离心10min～30min，得到的上清液即为核桃酶解液；

(3)核桃活性肽分离纯化

将步骤(2)得到的核桃酶解液依次采用截流分子量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分离，调节进口压力至0.5bar～5bar，出口压力至0.1bar～2bar，得到本发明所述的具有保护神经细胞氧化应激的分子量＜3kDa的核桃活性肽组分；

将分子量＜3kDa的核桃活性肽组分加入Sephadex G-25凝胶渗透层析柱中，流速调至0.1mL/min～2mL/min，上样量至1mL～10mL，利用自动分步收集器收集洗脱液(1mL/管～5mL/管)；将收集的洗脱液加入Sephadex G-15凝胶渗透层析柱中，流速调至0.1mL/min～2mL/min，上样量至1mL～8mL，利用自动分步收集器收集洗脱液(1mL/管～5mL/管)；利用反向-高效液相(RP-HPLC)对洗脱液进行纯化，纯化条件为：柱温20℃～60℃、流速0.1mL/min～6mL/min、进样量5μL～15μL；随后，采用高效液相电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)鉴定得到一条氨基酸序列为YVLLPSPK的活性肽，鉴定条件为：质量扫描范围100m/z～2000m/z、干燥气流速1L/min～10L/min、干燥气温度100℃～500℃，得到本发明所述的具有保护神经细胞氧化应激的氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK。

本发明相比现有技术优点为：

本发明首次公开了一种具有保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽组分(＜3kDa)和氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK高效制备方法。采用螺杆挤压(单、双)和超声技术对压榨核桃粕预处理后，直接进行酶控制水解，增加底物浓度和水解度，提高产物得率，进而促进工业化高效生产及应用。通过超滤、凝胶渗透层析柱、RP-HPLC和LC-ESI-MS/MS对其进行分离纯化及结构鉴定，得到具有保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽组分(＜3kDa)及氨基酸序列明确的活性肽YVLLPSPK，为活性肽功能因子和保健食品甚至是药物开发提供理论依据。本发明公布的利用螺杆挤压(单、双)和超声技术对压榨后核桃粕进行预处理，提高底物浓度，通过酶控制水解技术获得高水解度酶解物；经分离纯化及鉴定分别获得具有改善记忆力活性肽组分(＜3kDa)和保护神经细胞氧化应激的氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK。本发明按照《保健食品检验与评价规范》对核桃活性肽组分(＜3kDa)改善东莨菪碱诱导衰老模型小鼠学习和记忆功效及氨基酸序列明确的核桃抗氧化肽YVLLPSPK改善Aβ

附图说明

图1：经Sephadex G-25分离纯化后产物的峰图；

Sephadex G-25凝胶渗透层析柱被用来分离纯化多肽小分子，适用的分子量范围是1000～5000Da。如图1所示，核桃活性肽组分(＜3kDa)经Sephadex G-25凝胶渗透层析柱过滤分离得到4个峰。

图2：经Sephadex G-15分离纯化后产物的峰图；

Sephadex G-15凝胶渗透层析柱用于分离分子量较小及分子量接近的混合物，其适用范围为100～1500Da。如图2所示，将Sephadex G-25凝胶渗透层析柱过滤得到的组分经Sephadex G-15凝胶渗透层析柱过滤分离得到4个峰。

图3：经RP-HPLC分离纯化后产物的峰图；

RP-HPLC是以高压下的液体为流动相，采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术，分离纯化蛋白的原理为按照氨基酸疏水性的不同进行混合物的分离。如图3所示，将Sephadex G-15凝胶渗透层析柱过滤得到的组分经RP-HPLC分离得到6个峰。

图4：氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK的二级质谱图；

采用LC-ESI-MS/MS对RP-HPLC纯化后的产物进行鉴定，按照一定方式选择母离子肽段，将其逐个解离，分析所形成的子离子的质荷比和强度，得到核桃活性肽分子量、结构，获得氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK二级质谱图。

图5：小鼠定位航行实验路径图；

图中白色圆圈为计算机探头所监测的包括泳池在内的实验区域，白色大圆圈为泳池，白色小圆圈和在小圆圈与大圆圈中间的圆圈为计算机自动将泳池平均分成三等分，其中“十字”将泳池划分为四个象限，右上区域为NE象限，右下区域为SE象限，左上区域为NW象限，左下区域为SW象限。图5为将小鼠在SW象限面向池壁放入水中，直径为8cm，高为35cm的圆形平台放在NE象限，白色杂乱曲线轨迹为小鼠在泳池内寻找平台的游走路线。图中Control为不做任何处理的空白对照组；Model为用东莨菪碱(9％生理盐水溶解至1mg/kg.bw)诱导的记忆功能障碍模型组；Pisitive为吡拉西坦(9％生理盐水溶解至400mg/kg.bw)阳性对照组；Low dose、Medium dose和High dose分别为9％生理盐水配制的核桃活性肽组分(＜3kDa)低(200mg/kg.bw)、中(400mg/kg.bw)、高(800mg/kg.bw)剂量治疗组。

图6：小鼠空间探索实验路径图；

图中白色圆圈为计算机探头所监测的包括泳池在内的实验区域，白色大圆圈为泳池，白色小圆圈和在小圆圈与大圆圈中间的圆圈为计算机自动将泳池平均分成三等分，其中“十字”将泳池划分为四个象限，右上区域为NE象限，右下区域为SE象限，左上区域为NW象限，左下区域为SW象限。图6为将小鼠在SW象限面向池壁放入水中，将原来放在NE象限直径为8cm，高为35cm的圆形平台移走，观察小鼠在60s内穿过原平台的次数，白色杂乱曲线为小鼠在泳池内寻找原平台的游走路线。图中Control为不做任何处理的空白对照组；Model为用东莨菪碱(9％生理盐水溶解至1mg/kg.bw)诱导的记忆功能障碍模型组；Pisitive为吡拉西坦(9％生理盐水溶解至400mg/kg.bw)阳性对照组；Low dose,Medium dose和High dose分别为9％生理盐水配制的核桃活性肽组分(＜3kDa)低(200mg/kg.bw)、中(400mg/kg.bw)、高(800mg/kg.bw)剂量治疗组。

图7：核桃活性肽YVLLPSPK对Aβ

活性氧(ROS)是反应机体氧化损伤的一个重要指标。其中，DCFH-DA探针是细胞内ROS检测探针。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，当其进入细胞内后，会被细胞内的相关酯酶水解为DCFH，而DCFH不能透过细胞膜，从而使探针很容易被标记在细胞内。当细胞内有ROS存在时，DCFH被氧化为荧光物质DCF，其荧光强度与细胞内ROS含量成正比。图7荧光成像图中，白点为PC12细胞内ROS荧光强度，白点越多代表着细胞内ROS含量越多。图中Control为不做任何处理的空白对照组；Model为Aβ

图8：核桃活性肽YVLLPSPK对Aβ

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，保护细胞膜结构和功能不受过氧化物的干扰及损害。图8中Control为不做任何处理的空白对照组；Model为Aβ

图9：核桃活性肽YVLLPSPK对Aβ

细胞凋亡在机体生长发育和衰老等许多生理、病理过程中有着重要的作用。研究发现，ROS所致的氧化应激是造成细胞凋亡的重要因素。其中，Annexin是一类广泛分布于真核细胞胞浆内钙离子依赖的磷脂结合蛋白，参与细胞信号转导。Annexin V选择性结合分布在细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸(PS)。在细胞凋亡早期，细胞将PS外翻到细胞表面，促进凝血和炎症反应。而Annexin V和外翻到细胞表面的PS结合后可以阻断PS促凝血和促炎症反应活性。因此，Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。图中“十字”将黑色大方框分成4个象限，左上象限为坏死细胞，左下象限为正常细胞，右上象限为早期凋亡细胞，右下象限为晚期凋亡细胞。图9中黑点即为每个象限内相应的细胞状态。图中Control为不做任何处理的空白对照组；Model为Aβ

图7～图9说明氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK具有保护Aβ

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何限定。

实施例1：

一、高效制备具有保护神经细胞氧化应激的改善记忆力活性肽组分(＜3kDa)及氨基酸序列明确的活性肽YVLLPSPK

1、核桃粉预处理

将压榨核桃粕(吉林农业大学，食品科学与工程学院，发酵工程实验室自制)粉碎后与蒸馏水配成水分含量为12％的核桃粉溶液，倒入双螺杆膨化机(DS30-B，山东赛信膨化机械有限公司)挤压进料口，调节螺杆转速至200r/min，套杆温度至100℃，进行挤压处理；将挤压后的核桃粉与蒸馏水按照质量1：10的比例搅拌混合，调节超声破碎仪(JY 92-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司)频率为55kHz，超声处理30min；4000rpm离心20min，倒掉上清液，留取沉淀。

2、核桃酶解液制备

将步骤1制备的沉淀物溶于蒸馏水配成质量分数为20％溶液，在100℃条件下恒温水浴20min使蛋白变性，冷却至室温后用1mol/L的NaOH调节溶液pH至7.0；加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L(酶活力2.4AU-A/g，丹麦诺维信公司)，按照沉淀物质量进行计算，加酶量为10000U/g，用1mol/L的NaOH调节溶液pH至8.5，在45℃下酶解1h，溶液在90℃下灭酶15min；冷却至室温后用1mol/L的NaOH调节溶液pH至7.0，4000rpm离心15min，得到的上清液即为核桃酶解液。

3、核桃活性肽分离纯化

将步骤2得到的核桃酶解液依次采用膜分子截流量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分离。调节进口压力至1.5bar，出口压力至1bar，得到＜3kDa组分核桃活性肽；将＜3kDa组分核桃活性肽加入Sephadex G-25凝胶渗透层析柱(1.6cm×80cm)中，流速调至1mL/min，上样量至1mL，利用自动分步收集器(DBS，上海嘉鹏科技有限公司)收集洗脱液(3mL/管)，同时利用层析图谱采集分析仪(HD-A，上海嘉鹏科技有限公司)获得图1经Sephadex G-25分离纯化后产物的峰图；将收集的洗脱液加入Sephadex G-15凝胶渗透层析柱(1.6cm×80cm)中，流速调至0.3mL/min，上样量至2mL，利用自动分步收集器(DBS，上海嘉鹏科技有限公司)收集洗脱液(2mL/管)，同时利用层析图谱采集分析仪(HD-A，上海嘉鹏科技有限公司)获得图2经Sephadex G-15分离纯化后产物的峰图；利用RP-HPLC(e2695，美国Waters公司)对洗脱液进行纯化，同时获得图3经RP-HPLC分离纯化后产物的峰图，纯化条件为：柱温30℃、流速0.5mL/min、进样量6μL；随后，采用LC-ESI-MS/MS(Q Exactive，美国Thermo公司)鉴定活性肽并得到本发明所述的具有保护神经细胞氧化应激的图4氨基酸序列明确的核桃活性肽YVLLPSPK二级质谱图，鉴定条件为：质量扫描范围1000m/z、干燥气流速5L/min、干燥气温度150℃。

二、本发明物对东莨菪碱诱导记忆功能障碍小鼠学习和记忆影响的研究

1、受试动物：SPF级昆明小鼠，体重18～20g，60只，由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

2、实验分组

将购买后的小鼠自由适应一周后，随机分为6组，分别为空白对照(Control)组、记忆功能障碍模型(Model)组、阳性对照(Positive)组和核桃活性肽组分(＜3kDa)低剂量(Low dose)组、中剂量(Medium dose)组、高剂量(High dose)组，每组10只小鼠。饲养期间，每天上午8点，按体重计算，分别用核桃活性肽(＜3kDa)溶液(9％生理盐水配制)低(200mg/kg.bw)、中(400mg/kg.bw)、高(800mg/kg.bw)剂量组对小鼠进行灌胃处理，阳性对照组灌胃吡拉西坦(美国Sigma公司)溶液(400mg/kg.bw)，空白对照组和记忆功能障碍模型组灌胃9％生理盐水，连续灌胃30天。第31天，除空白对照组外，各组小鼠按体重计算，腹腔注射东莨菪碱(美国Sigma公司)溶液(1mg/kg.bw)，30min后进行Morris水迷宫(MT-200，成都泰盟科技有限公司)行为学实验。

3、Morris水迷宫行为学实验

(1)定位航行实验

将直径为8cm，高为35cm的圆形平台置于水下1cm，并固定在NE象限。每日每只小鼠测试1次，并将小鼠面向池壁不同象限轻放入水中。第一天和第四天从目标象限对侧的象限(SW)入水，第二天和第三天随机从SE和NW象限入水。小鼠游泳的监测时间为120s，计算机采集系统自动记录小鼠从入水到找到隐藏平台的时间和路径。从小鼠入水到找到平台的时间记为潜伏期，小鼠找到平台后让其在平台上停留10s。寻台失败的小鼠也在平台上停留10s，潜伏期记为120s。每次训练完，用干毛巾将小鼠擦干，以防止低温造成的应激。实验共计6天。水迷宫实验中，动物的探索路径一般分“随机式、直线式、趋向式、边缘式”四种方式。小鼠定位航行路径图见图5，东莨菪碱诱导的记忆功能障碍模型组小鼠游走路径无任何规律，以边缘式为主，需要较长时间找到平台，这说明东莨菪碱腹腔注射造模成功，记忆功能障碍模型组小鼠学习能力显著下降。低剂量核桃活性肽组(＜3kDa)小鼠游走路径比空白和阳性对照组复杂，但高于记忆模型损伤组；而中、高剂量核桃活性肽组(＜3kDa)小鼠游走路径主要以趋向式为主，且明显高于阳性对照组。

(2)空间探索实验

定位航行实验结束后，将直径为8cm，高为35cm的圆形平台从水池中移除。将小鼠面向池壁轻放入水中，计算机采集系统自动记录小鼠在水中游泳60s内经过原平台次数以及游走路径。空间探索实验是通过移除隐藏在水下的平台，检测小鼠对原平台位置的空间记忆能力。由图6可看出，空白对照组小鼠探索策略为典型的直线型和趋向型，而记忆功能障碍模型组小鼠主要为边缘型和随机型，表明东莨菪碱致使小鼠对平台的记忆完全丧失；中、高剂量核桃活性肽组(＜3kDa)的小鼠探索策略主要为趋向型，从游走路径看出，核桃活性肽(＜3kDa)可以改善东莨菪碱诱导小鼠学习和记忆损伤。

三、本发明物对Aβ

1、受试细胞：PC12(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤)细胞，由上海中乔新舟生物科技有限公司提供。

2、PC12细胞培养和核桃肽对PC12细胞的保护作用

将PC12细胞在含有10％胎牛血清(美国Gibco公司)和1％青霉素-链霉素混合溶液(美国Gibco公司)的RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)中以37℃、5％CO

3、细胞内活性氧(ROS)含量的测定

根据试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)说明书进行细胞内ROS含量的测定。加入终浓度为100μM的3种活性肽和终浓度为50μM的Aβ

4、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定

根据试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)说明书对细胞内GSH-Px活性进行检测。将PC12细胞以4×10

5、利用流式细胞仪检测细胞凋亡水平

根据Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)说明书进行细胞凋亡水平检测。将PC12细胞以4×10

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本技术领域的人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进与润色，这些改进与润色也应视为本发明的保护范围。