一种苏崎茄同源四倍体植株花药培养方法

摘要

本发明公开了一种苏崎茄同源四倍体植株花药培养方法，它包括适宜发育阶段的花蕾采集、花药培养前的花蕾预处理、花药预培养、胚状体诱导、胚状体萌发、壮苗和炼苗移栽等操作。与现有报道的二倍体茄子花药培养技术相比，本发明从苏崎茄同源四倍体植株的花药培养获得3个二倍单倍体，由于每个二倍单倍体植株来源于不同的独立胚状体，因此可以根据不同二倍单倍体植株之间的差异，或其自交后代分离情况，判断该四倍体植株基因型的纯合度，克服了在四倍体水平上自交鉴别该同源四倍体植株基因型纯合度时的困难，实现了二倍体苏崎茄品种花药培养的成功。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种苏崎茄同源四倍体植株花药培养方法及应用。

背景技术

茄子(Solarium melongena L)，原产亚洲热带，我国各省均有栽培。草本或亚灌木状，果可供蔬食，根、茎、叶、种子皆可入药。自然界中以二倍体为主，单倍体和多倍体植株主要由花药培养或二倍体加倍处理获得。花药培养获得的同源四倍体茄子植株，相比二倍体植株其减数分裂过程不正常，很难筛选到商品性好、产量高的四倍体品系，且由于其基因型纯合与否的测试方法也较二倍体植株困难，因此目前利用花药培养得到的商用四倍体常规种品系或杂交种品系都未见报道。

虽然70年代初，Riana等就成功地通过二倍体茄子花药培养经愈伤组织途径成苗，此后不论是茄子花药还是花粉(小孢子)培养，都已有许多成功的报道，同源四倍体植株花药培养技术方法及其在实践中的应用均未见报道。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有二倍体花药培养部分品种受到基因型的影响很难诱导出植株，或者诱导出的四倍体等多倍体植株，存在繁殖系数低、经济性状差、倍性不易稳定、获得纯合二倍体自交系困难等问题，提供一种茄子同源四倍体植株花药培养的方法，一方面可以间接鉴定同源四倍体植株的基因型纯合度，另一方面，通过花药培养降低植株的倍性，获得纯合二倍体茄子植株和自交系，以提高茄子单倍体育种技术的效率。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种苏崎茄同源四倍体植株花药培养方法，包括如下步骤：

(1)采集四倍体茄子植株上的花蕾，将其放入塑料自封口袋中包好，并立即放入装有冰块的保温盒，将封口袋连同里面的花蕾放入4℃冰箱中低温处理2d至5d；

(2)将步骤(1)中低温处理后的花蕾取出，剥去萼裂片，带入无菌室进行表面消毒；

(3)取步骤(2)中的花蕾，在无菌条件下剥出完整的花药，接种到培养皿的预备培养基中，封口后放入35℃培养箱中黑暗条件下培养1-3d，然后取出放到25℃培养箱中光暗交替条件下继续培养15-30d；

(4)将步骤(3)预备培养基中的花药转入胚状体诱导培养基中，同样的光暗交替条件下培养10-30d，直至出现胚状体；然后将胚状体及花药转入萌发培养基中，同样的条件下继续培养，待胚状体发育出完整的根和芽后，再转入壮苗培养基中，叶片无水渍化状态，株高达到2cm以上时，炼苗移栽；

(5)将步骤(4)的生根壮苗用镊子轻轻夹出，洗掉根部所沾染的培养基，在多菌灵溶液中浸泡10-30min，取出后将根系用IBA或NAA溶液蘸一下，然后栽入未使用过的育苗基质中，浇透而不积水，用塑料薄膜覆盖苗盘，将苗盘放入以上光暗交替的培养箱中，7-15d逐步揭除薄膜，保持苗叶片不萎蔫并逐渐生长。

进一步地，步骤(1)中，采集茄子四倍体植株上花蕾，形态特征为柄端粗度大于花瓣端、花瓣筒与花萼筒基本齐平、花萼裂片稍分开的花蕾，此时花粉处于小孢子阶段，选取其中发育健壮、无病虫、花瓣包裹紧密的花蕾。

进一步地，步骤(2)中，消毒采用二步法，先将整理好的花蕾放入无菌三角瓶中，倒入70％-75％的酒精，深度没过花蕾，手摇或振荡1-5min，倒掉酒精；三角瓶中加入1-2滴吐温-80，再倒入6.5％的次氯酸钠溶液，手摇或振荡5-15min，然后倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3-5次，用灭菌的吸水纸或滤纸吸干花蕾表面的液体，瓶口盖封口膜备用。

进一步地，步骤(3)中，所述的预备培养基为MS固体培养基添加0.1-2mg/L的生长素和分裂素。

进一步地，步骤(4)中，所述的胚状体诱导培养基为NLN或B5固体培养基添加0.1-1mg/L的生长素(IAA/NAA/IBA)、细胞分裂素(BA/KT)。。

进一步地，步骤(4)中，所述的萌发培养基为NLN或B5固体培养基添加0.1-1mg/L的生长素、分裂素和赤霉素，每20d左右更换1次新鲜培养基，最多更换2次，未产生胚状体的花药全部丢弃；所述的壮苗培养基为B5固体培养基，根据苗的生长状态，添加或不添加0.1-0.2mg/L的生长素。胚状体发育出完整的根和芽后，再转入壮苗培养基中，直至发育出3片及以上正常叶片(无水渍化现象)，株高达到2cm以上，及时炼苗移栽。整个培养过程不使用2,4-D，有利于胚状体萌发成苗。

进一步地，步骤(5)中，所述的多菌灵溶液由有效成分含量为50wt％的多菌灵可湿性粉剂与水按照1:500～800的质量比稀释得到；将根部浸入多菌灵溶液，浸泡时间为10～20min。有效防止炼苗过程中出现病菌侵染而降低苗的成活率。

进一步地，步骤(5)中，所述的IBA或NAA溶液的浓度为200～1000ppm，苗根部在溶液中的浸泡时间为1s～20min；所述的育苗基质为常见的蔬菜播种用的育苗基质，或者蛭石，厚度不小于8cm，浇透但不积水；根部插入基质而叶片露出基质，株行距为不低于5cm。

进一步地，步骤(3)～(5)中，所述的光暗交替培养条件为：温度为25℃，光周期为12～16h，暗周期为8～12h，光照强度为1000～1500lx。

进一步地，步骤(5)中，塑料薄膜密封后1周内不打开薄膜，1周后可打开薄膜，拔除萎蔫死亡的植株，浇水或喷水后重新盖好薄膜，并逐渐留缝隙通风散湿，15天后全部揭掉薄膜，期间叶片出现萎蔫则向叶面喷施少量清水。

进一步地，取成活植株下部嫩叶(不影响苗的继续生长)，采用流式细胞法测定其DNA含量，以二倍体种子实生苗为对照。

测定细胞中DNA含量采用流式细胞法进行鉴定。样本峰值的荧光强度X-Mean(横坐标)与细胞DNA含量成正比，所以由各样本X-Mean之间的比例关系判断倍性。例如，将对照的二倍体峰调整在横坐标100位置，则单倍体会出现在50，峰值在200位置的为四倍体。图形的纵坐标代表细胞数量，峰的高低反映了细胞比例的不同。

有益效果：

应用本发明方法，从2022年3月份获得的苏崎茄四倍体植株上采集的花蕾，2023年3月进行花药培养，2023年6月得到3株移栽成活的再生植株，全部为二倍体。二倍体杂种“苏崎茄”品种的花药培养容易获得胚状体，但很难成苗，在2022年获得了移栽成活的1株四倍体植株(本试验中的供体植株)之前，从未得到移栽成活的单倍体、二倍体和多倍体植株，该技术能够间接实现二倍体苏崎茄品种花药培养的成功。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1二倍体对照的叶片DNA含量。

图2适宜培养的花蕾形态。

图3同源四倍体茄子自交植株倍性以及花药培养再生植株的过程；

A：2022年二倍体茄子“苏崎茄”花药培养产生的四倍体植株，也是本试验中四倍体花蕾的供体植株，能够正常开花结果；

B：图3-A植株叶片DNA含量，四倍体；

C：接种的1枚花药产生胚状体，出胚花药率5.6％(1/18)；

D：图3-C中出胚的花药及胚状体转入胚状体成苗培养基；

E：图3-D中的胚状体转入玻璃瓶后3个胚状体发育成适宜移栽的植株；

F：图3-E中的植株叶片DNA含量，二倍体。

图4同源四倍体茄子花药培养产生的植株倍性鉴定结果；

A和A’：图3-E中的苗1移栽成活植株及其叶片DNA含量，二倍体；

B和B’：图3-E中的苗2移栽成活植株及其叶片DNA含量，二倍体；

C和C’：图3-E中的苗3移栽成活植株及其叶片DNA含量，二倍体。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

试验在2023年1月-2023年8月，于金陵科技学院遗传育种实验室中进行。茄子四倍体植株来源于2022年3月由二倍体杂种“苏崎茄”花药培养得到的四倍体植株。50％wp多菌灵粉剂为上海悦联化工有限公司生产，其有效成分含量为50wt％，每升自来水中含有1.25克粉剂，配置成为稀释800倍的混悬液；吲哚-3-丁酸(IBA,分子量为203.24)或萘乙酸(NAA)，由中国医药集团上海化学试剂公司生产，粉剂先用少量100％酒精溶解，再用超纯水稀释到1000ppm。

(1)采集四倍体植株上的花蕾：于晴好天气采集同源四倍体植株(图3-A,B)上的花蕾，花蕾中花粉处于小孢子发育阶段(花蕾形态见图2)。采摘下来的花蕾放入塑料袋中封口或扎严，立即放入保温盒中(防止花蕾水分散失)，带回实验室备用。

(2)花蕾预处理：表面消毒之前的花蕾，4℃低温预处理2-5d，然后将萼裂片剥去，这样有利于提高消毒效果。

(3)花药表面消毒和培养：采用二步法消毒，用灭菌的吸水纸或滤纸吸干消毒后的花蕾表面的液体，在无菌条件下剥出完整的花药，接种到直径为5cm的培养皿中的预备培养基中，封口后放入35℃培养箱中黑暗条件下培养1-3d，然后取出放到25℃、12h/12h光暗交替、光照强度1500lx条件下，继续培养7-20d；将花药转入胚状体诱导培养基中培养10-30d，直至出现胚状体(图3-C)；然后将胚状体及花药转入萌发培养基中(图3-D)，同样的条件下继续培养，每20d左右更换1次新鲜培养基，最多更换2次，未产生胚状体的花药全部丢弃。胚状体发育出完整的根和芽后，再转入三角瓶或罐头瓶中的壮苗培养基中，待长出3片叶以上且叶片无水渍化状态、株高达到2cm以上(图3-E)，及时炼苗移栽。预备培养基为MS固体培养基添加0.1-2mg/L的NAA和6-BA；胚状体诱导培养基为NLN或B5固体培养基添加0.1-1mg/L的生长素和分裂素；胚状体萌发培养基为NLN或B5固体培养基添加0.1-1mg/L的生长素、分裂素和赤霉素，壮苗培养基为B5固体培养基，根据苗的生长状态，添加或不添加0.1mg/L的生长素。

(4)炼苗移栽：适宜移栽的生根壮苗用镊子从培养瓶中轻轻夹出，不伤根的情况下小心洗掉根部所沾染的培养基，在800倍的多菌灵溶液中浸泡10-30min，取出后将根系用1000ppm的IBA或NAA蘸一下，然后栽入未使用过的育苗基质中，浇透而不积水，用塑料袋或塑料薄膜覆盖苗盘，将苗盘放入以上25℃光照培养箱中，7-15d逐步揭除薄膜，保持苗叶片不萎蔫，植株成活，叶片逐渐长大即可。

(5)植株倍性检测：当再生苗生长至3-4片真叶时用流式细胞法鉴定植株的倍性(图3-F，图4)。流式细胞法鉴定倍性的方法为采集新鲜幼嫩叶片，叶片编号同植株编号一一对应，试验提供的二倍体对照为二倍体植株87-4的实生苗(图1)，每一个测试需要的叶片大约小拇指甲盖大小。准备测试的叶片应为此量的4倍以上，以备重复实验用。

测试机构：北京金迪未来生物科技有限公司。

检测仪器：Partec CyFlow Space。

试剂盒：Partec CyStain UV Precise P。

结果判定方法：样本峰值的荧光强度X-Mean(横坐标)与细胞DNA含量成正比，所以由各样本X-Mean之间的比例关系判断倍性。例如，将对照的二倍体峰值调整在横坐标100位置(图1)，则单倍体会出现在50，峰值在200位置的为四倍体。图形的纵坐标代表细胞数量，峰的高低反应了细胞比例的不同。

采用这种方法进行预处理的花蕾，3月5日接种，3月23出现胚状体，4月19日胚状体成苗，6月16日移栽成活并测试倍性，期间仅需要3个多月。

与现有报道的二倍体茄子花药培养技术相比，本发明的优点一是同源四倍体花药培养获得多个二倍单倍体，由于每个二倍单倍体植株来源于不同的独立胚状体，因此可以根据不同二倍单倍体植株之间的差异，或其自交后代分离情况，判断该四倍体植株基因型的纯合度，克服了在四倍体水平上自交鉴别四倍体植株基因型纯合度时的困难；二是获得的二倍单倍体植株再次进行花药培养可获得一倍单倍体植株，一倍单倍体花药培养进而获得加倍单倍体自交系(DH系)，该方法是保证从杂合的植株获得纯合的二倍体茄子自交系的最可靠的方法。该方法对于基因型杂合、进行花药培养未得到二倍体和单倍体再生植株而仅得到四倍体的二倍体茄子品种，也是间接获得加倍单倍体自交系的一条途径。试验对二倍体茄子品种“苏崎茄”花药培养产生的1个四倍体植株进行了花药培养，从接种的16个花药诱导出3个植株(来自3个花蕾中的1个出胚花药)均移栽成活，经流式细胞法鉴定全部为二倍体植株，如附图3和附图4所示。

本发明提供了一种苏崎茄同源四倍体植株花药培养方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。