通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞的方法

摘要

癌症对人类健康有着巨大的威胁，目前没有特别好的治疗方法。最主要的原因是尚未找到非常好的特异杀伤癌细胞而对正常细胞影响较小的方法。DNA的断裂如果得不到修复会导致细胞死亡，这是放疗的基本原理，但放疗也会导致正常细胞中的DNA损伤。本发明提出一种特异杀伤癌细胞的方法，利用基因编辑技术造成癌细胞特有的DNA断裂(正常细胞中没有这些DNA切点)，同时联合DNA损伤修复抑制剂，抑制癌细胞中的DNA修复，导致癌细胞特异性死亡。本发明为癌症的精准治疗提供了新思路。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及癌症治疗领域，具体涉及一种特异性强，能有效应对癌细胞演进性和异质性问题的癌细胞特异性杀伤方法，以及相应的产品和应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类生命的疾病,目前肿瘤的主要依靠包括手术，化疗和放射等治疗方式治疗，目前极少癌症患者能被完全治愈。手术的方式不能把所有的癌细胞都去除，而放疗和化疗等其它肿瘤治疗方法都不能特异的只杀伤癌细胞，因此找到不杀伤正常细胞只杀伤癌细胞的方法可能对于肿瘤的治疗有重要意义。

最近出现的基因编辑技术使得人们可以对细胞内的DNA的精准位点进行切割，突变，修改，插入，替换等编辑，有广阔的应用前景。现有的基因编辑技术包括：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子(TALEN)和规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)等。

例如CRISPR基因编辑技术，发现于细菌的免疫机制。CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)是存在于细菌基因组中的DNA序列，即成簇规律间隔短回文重复。有多种类型的CRISPR相关基因(CRISPR associated，Cas)，Cas9是其中一种类型，其表达产物是Cas9核酸内切酶。以Cas9作为切割元件的CRISPR基因编辑为例，人们通过在细胞中导入Cas9和一条经过特殊设计的向导RNA(gRNA)实现快速精准的对目标DNA的切割。具体机制是gRNA通过碱基互补原理与目的DNA位点结合，指导Cas9蛋白定位于目的DNA位点，并造成结合位置DNA在精准位点的断裂，再利用细胞中本来存在的DNA的损伤修复机制，实现对DNA在断裂位点及附近进行突变，插入，替换等等修改，实现基因编辑的目的。发明人也一直在研究CRISPR-Cas9基因编辑技术，并在安全性方面对改技术进行了优化，并成功地在特定位点诱导染色体易位(参见专利文献：刘厚奇、蒋俊锋等，一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体，专利号CN 201510092144.9，授权公告号CN104805099B；CRISPR-Cas9技术构建染色体易位干细胞及动物模型的方法专利号CN201510075127.4，授权公告号CN104726494B),我们还发明了一种新的CRISPR方法，通过非同源DNA末端连接(NHEJ)插入终止子，从而有效地敲除前列腺癌细胞中重要的LncRNA(参见专利文献：蒋俊锋等，一种利用基因编辑技术敲入终止子实现可转录元件敲除的方法，专利申请号CN201811415619.3，公开号CN111218479A)。由于CRISPR系统对基因进行编辑的最关键环节就是对目的DNA位点精准的切割，因此CRISPR系统常被比作一把可定点切割DNA的“魔剪”(参见文献:Mali,P.,Yang,L.,Esvelt,K.M.,Aach,J.,Guell,M.,DiCarlo,J.E.,Norville,J.E.,and Church,G.M.(2013).RNA-guided human genome engineering viaCas9.Science 339,823-826)。

我们知道癌症的放疗的基本原理是通过射线将DNA打断，这些断裂的DNA不能被修复时会激活包括凋亡等多种死亡信号通路，导致细胞死亡。但由于放疗难以避免的也会造成正常细胞的DNA损伤，因此剂量和范围都受到严格控制，不能完全清除癌细胞，且副作用也比较大。

癌症的精准治疗一直是本领域致力攻克的研究方向。目前尚无文献报道通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞的方法。

发明内容

本发明提供了一种通过基因编辑技术诱导癌细胞的特有DNA位点断裂，并联合DNA损伤修复抑制剂来阻止DNA的修复，诱导细胞死亡，实现特异杀伤癌细胞的方法。

发明人设想，如果能只让癌细胞的DNA断裂，而且断裂的DNA不能被修复，就有可能实现癌细胞的特异性杀伤。于是，在DNA测序技术不断普及和基因编辑技术不断发展的背景下，发明人提出一种全新的癌症个性化精准治疗方法，即通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞的方法，如图1所示：

S1.确定癌细胞中特有的不同于正常细胞的至少一条DNA序列；

可以通过测序完成，如癌症患者先进行DNA测序，经过序列分析确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；也可以通过现有技术有关癌症已报道的特有序列获知；

特有序列包括但不限于点突变，插入突变，缺失突变，染色体易位等；

S2.设计合成针对S1步骤确定的特有序列的基因编辑系统，导入癌细胞使特有序列断裂或损伤；

基因编辑系统可以是锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活因子样效应子(TALEN)系统，也可以是CRISPR基因编辑系统等能导致特异位点DNA损伤的基因编辑系统；

在本发明的优选实施例中，我们使用的是CRISPR系统：设计合成针对癌细胞特有的序列的gRNA&Cas9系统，这些gRNA不能识别任何正常细胞中的DNA；

锌指核酸酶(ZFN)系统，一样可以达到CRISPR系统的效果，(参见文献:赵国华,浦佳丽,唐北沙.ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9基因编辑技术在疾病研究及基因治疗中的应用[J].中华医学遗传学杂志,2016,33(6):6.以及Rui Y,Wilson DR,Green JJ.Non-ViralDelivery To Enable Genome Editing.Trends Biotechnol.2019Mar；37(3):281-293.PMID:30278987)

转录激活因子样效应子(TALEN)系统，一样可以达到CRISPR系统的效果(参见文献:赵国华,浦佳丽,唐北沙.ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9基因编辑技术在疾病研究及基因治疗中的应用[J].中华医学遗传学杂志,2016,33(6):6.以及Rui Y,Wilson DR,GreenJJ.Non-Viral Delivery To Enable Genome Editing.Trends Biotechnol.2019Mar；37(3):281-293.PMID:30278987)。

所述的基因编辑系统可以是直接合成的，也可以是导入细胞后能被细胞生成有效编辑系统的载体，例如质粒，RNA，病毒(腺病毒、慢病毒)等。

S3.将抑制DNA损伤修复的药物，导入癌细胞；

抑制DNA损伤修复的药物，包括现在已知或将来开发的可以抑制DNA损伤修复的抑制剂，例如，非同源末端连接(Non-homologous endjoining，NHEJ)途径的抑制剂，如DNA-PKcs的抑制剂NU7441；或者同源重组(Homologous recombination，HR)途径的抑制剂，如ATM抑制剂KU55933；或者既可以抑制NHEJ又可以抑制HR的抑制剂，如wortmannin；既包括联合运用，也包括单独应用。

在S2和S3步骤中，导入癌细胞可以是同步，也可以是分别导入；同步导入可以各自同步导入，也可以形成复合物(例如应用纳米技术形成纳米复合物)一起导入；导入方法可以相同或不同，可以是注射，口服，外涂，吸入等。可以是普通导入，也可以靶向癌细胞的靶向导入。

由于这种由基因编辑技术介导癌细胞中特有的DNA突变位点的精准断裂的肿瘤个体化治疗策略杀死细胞的基本原理和放疗一样，都是通过造成细胞中DNA的双链断裂(DNAdouble strandbreaks,DSBs)杀死细胞，区别在于我们的策略只造成癌细胞中DNA断裂，而正常细胞中没有所设计的基因编辑系统能结合的DNA序列，就算这个系统进入到正常细胞，也不会产生杀伤效应，因此本发明有望实现不杀伤正常细胞只杀伤癌细胞的目的。而且断裂的DNA不能被修复，本发明真正实现癌细胞的特异性杀伤以及病人回复健康的目的。

进一步地，本发明通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞的方法，包括如下步骤：

S11.癌症患者先进行测序以确定DNA序列；

所述的癌症既包括实体的恶性肿瘤如肝癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、乳腺肿瘤、头颈肿瘤、胶质母细胞瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、皮肤肿瘤、骨肉瘤，纤维肉瘤等，也包括白血病、淋巴瘤等。

所述的测序技术，泛指能直接或者间接明确患者癌细胞中全部或者部分DNA序列的一切方法，例如全基因组测序，全外显子测序，一代测序，二代测序，三代测序，RNA测序，单细胞测序，空间转录组测序等。

在我们的一个具体实施例中(实施例1)，我们通过全基因组测序检测了肝细胞癌HepG2的DNA序列。

在另一个具体实施例(实施例5)中，我们通过全外显子测序检测了前列腺癌PDX中的序列。

S12.经过序列分析能确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；

各种能明确癌细胞中特有的DNA序列的方法都可用于该步骤的具体实施。癌细胞中特有DNA序列可以是癌细胞中DNA序列和参考基因组进行对比确定，也可以和患者自身正常细胞中DNA序列进行对比确定，特有的序列包括点突变，插入突变，缺失突变，染色体易位等。

在我们的一个具体实施例中(实施例1)，我们通过将测得的肝细胞癌HepG2的DNA序列与正常人参考基因组(Feb.2009(GRCh37/h19)对比，发现了3,985,698个单核苷酸突变(SNV)和817723个插入或缺失突变(indels)。这些突变位点和正常细胞的DNA不同，是HepG2这个癌细胞特有的DNA位点。

S21.设计合成针对癌细胞中特有序列的基因编辑系统；

能够特异位点DNA损伤的技术都可用于该方法的具体实施，例如：锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活因子样效应子(TALEN)系统，也可以是CRISPR基因编辑系统。

在我们的一个具体实施例(实施例1)中，我们在肝细胞癌HepG2中选择了8个突变位点，突变后的序列和正常细胞中的DNA序列明显不同，针对这些位点我们设计了8个gRNA-Cas9表达系统。

S22.将针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统，导入癌细胞；以及抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

相关的基因编辑系统可以是直接合成的，也可以是导入细胞后能被细胞生成有效编辑系统的载体，例如质粒，RNA，病毒(腺病毒、慢病毒)，RNA蛋白质复合物等。

导入细胞的载体可以是病毒，纳米药物包载表达载体，纳米药物包载RNA蛋白质复合物等。

给药的方法可以是注射，口服，外涂，吸入等。

在我们的一个具体实施例中(实施例1)，我们选择了用CRISPR基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂治疗肝细胞癌。我们的CRISPR基因编辑系统通过腺病毒表达(一个病毒载体上既表达gRNA，又表达Cas9)。

在另一个具体实施例中(实施例2)，我们选择了用CRISPR基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂治疗前列腺癌。我们的CRISPR基因编辑系统通过慢病毒表达(一个病毒载体上表达gRNA，另一个慢病毒载体表达Cas9)。

S3.将抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

在我们的一个具体实施例中(实施例1)，DNA损伤抑制剂采用NU7441+KU55933，给药方法是直接加入。

在另一个具体实施例中(实施例2)，DNA损伤抑制剂采用了wortmannin，给药方法是直接加入。

在我们的又一个具体实施例中(实施例4)，DNA损伤抑制剂采用NU7441+KU55933，给药方法是注射。

经过上述步骤，癌细胞中的被设计切割的DNA位点遭到基因编辑系统的精准切割，且由于DNA损伤抑制剂的存在，DNA损伤不能得到修复，触发细胞死亡相关通路，导致癌细胞的死亡。由于正常细胞中没有所设计的基因编辑系统能结合的DNA序列，就算这个系统进入到正常细胞，也不会产生杀伤效应，因此有望实现不杀伤正常细胞只杀伤癌细胞的目的。

本发明的另一方面，提供了一种基因编辑系统和DNA损伤修复抑制剂联用在制备治疗肿瘤药物中的应用。

所述的基因编辑系统，是针对癌细胞中特有的不同于正常细胞的DNA序列设计合成，用以使癌细胞中的特有DNA序列断裂或损伤。

所述的特有DNA序列包括但不限于点突变，插入突变，缺失突变，染色体易位等。

所述的基因编辑系统包括但不限于锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活因子样效应子(TALEN)系统，也可以是CRISPR基因编辑系统等能导致特异位点DNA损伤的基因编辑系统。

所述的基因编辑系统可以是直接合成的，也可以是导入细胞后能被细胞生成有效编辑系统的载体，例如质粒，RNA，病毒(腺病毒、慢病毒)等。

所述的DNA损伤修复抑制剂，包括现在已知或将来开发的可以抑制DNA损伤修复的抑制剂，例如，非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)途径的抑制剂，如DNA-PKcs的抑制剂NU7441；或者同源重组(Homologous recombination，HR)途径的抑制剂，如ATM抑制剂KU55933；或者既可以抑制NHEJ又可以抑制HR的抑制剂，如wortmannin；既包括联合运用，也包括单独应用。

所述的治疗肿瘤药物，其给药方式可以是注射，口服，外涂，吸入等。优选地，直接注射、腹膜内注射、瘤周注射或其他合适的给药途径。

本发明的方法和应用至少有如下4项优势：

1.真正的癌细胞特异性杀伤。

正如上文所述，只有癌细胞才会被该策略杀伤，正常细胞不存在被切割的位点，受到的影响低。

2.有望有效应对癌细胞的持续突变和演进

癌症治疗所面临的一个非常棘手的问题就是癌细胞的持续突变和演进，使得即使是目前最好的靶向药物或者免疫治疗都存在一定时间后的耐药性问题。

我们的策略靶向特定的已存在的突变，因此决定治疗持续有效性的关键就是这些突变是否持续存在。DNA的突变具有随机性，但由于基因组太宏大，已经发生突变的位点再次出现突变的几率很低。在我们一个实施例中，我们对实验室中单独培养了很长时间的前列腺癌细胞DU145的单细胞克隆和普通DU145细胞进行了全基因组测序，发现经过持续长时间的培养后，大多数突变保留，且我们设计的7个切割位点在几个单克隆中完全保留,提示所有“剪刀”将全部有效。而且如果我们选择打造10把“剪刀”，这10把“剪刀”对应的位点随着肿瘤演进都失效的概率就相当低了。

就算这批切割位点真的大多数都突变了，这批“剪刀”都失效了，要克服这个问题也非常容易，再重新设计合成并导入新的“剪刀”就行。

3.有望应对肿瘤的异质性问题。

肿瘤异质性同样来源于癌细胞各自演进，肿瘤异质性所导致的癌细胞中只有部分细胞对药物敏感，也是目前治疗方案难以克服的问题。而随着未来测序技术的发展，例如单细胞测序的发展，以及例如克隆进化分析等生物信息学技术的发展，获得一个患者所有癌细胞中共有的突变序列是可能的。利用我们的策略特异性的切割这些共有的DNA序列就可能克服肿瘤异质性所导致的问题。

4.我们的策略具有较好的个体化治疗时效性

由于只需要知道DNA序列就能设计基因编辑系统(“剪刀”)，并且这个定制的基因编辑系统和DNA损伤修复抑制剂的药物混合物可以在知道DNA序列后几周就能准备好，可以说有较好的癌症个体化治疗时效性。

而且未来可以针对肿瘤中高频突变的位点预制基因编辑系统试剂，这样只需要测序患者来源样本的DNA序列就可以根据我们的策略选取针对性的基因编辑系统试剂，甚至都不需要利用PDX模型测试药物的敏感性，有望极大缩短治疗响应时间，为患者争取到更大的受益。

本发明为癌症的精准治疗提供了新思路。

附图说明

图1本发明用于个性化治疗癌症的策略示意图；

图2实施例1本发明的方法对肝癌细胞HepG2的杀伤效果图，其中图2A是流式细胞术检测细胞凋亡结果，图2B是图2A的统计结果；

图3实施例2本发明的方法对前列腺癌细胞DU145的杀伤效果图，其中图3A是流式细胞术检测细胞凋亡结果，图3B是图3A的统计结果；

图4实施例3本发明的方法对肝癌HepG2细胞的杀伤效果图；

图5实施例4本发明的方法对肝癌PDX进行杀伤效果图；

图6实施例5本发明的方法对前列腺癌PDX进行杀伤效果图；

图7实施例6本发明的方法对肝癌类器官进行杀伤效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：利用本发明的方法，对HepG2肝癌细胞进行特异性杀伤

步骤一：先进行DNA测序；

我们通过全基因组测序检测了肝细胞癌HepG2的DNA序列。

步骤二：经过序列分析能确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；

我们通过将测得的肝细胞癌HepG2的DNA序列与正常人参考基因组(Feb.2009(GRCh37/h19)对比，发现了3,985,698个单核苷酸突变(SNV)和817723个插入或缺失突变(indels)。这些突变位点和正常细胞的DNA不同，是HepG2这个癌细胞特有的DNA位点。

步骤三：然后设计合成针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统；

我们使用的是CRISPR系统，我们初步评估约有1000个位点适合进行gRNA的设计。

我们选择如下8个位点进行gRNA设计和合成，并构建了这些gRNA的腺病毒表达载体，载体上同时可以表达Cas9核酸内切酶。

HepG2肝癌细胞中特有的DNA突变以及gRNA设计序列如下：

这些gRNA不能识别任何正常细胞中的DNA，但却能识别HepG2癌细胞中的DNA序列。

步骤四：将针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统，以及抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

我们通过将表达Cas9和上述八个gRNA的腺病毒混合物(构建方法为常规技术，参见文献Chen ZH,Yu YP,Zuo ZH,et al.Targeting genomic rearrangements in tumorcells through Cas9-mediated insertion of a suicide gene.Nat Biotechnol.2017；35(6):543-550.doi:10.1038/nbt.3843)，以及DNA损伤修复抑制剂(本实施例中，我们加入的是抑制NHEJ通路的DNA-PKcs的抑制剂NU7441--购自Selleck公司，和HR通路的ATM抑制剂KU55933--购自Selleck公司)，加入HepG2细胞培养基，然后检测细胞死亡情况。

实验结果发现我们的策略可以显著杀伤HepG2细胞，如图2所示：

本实验是流式细胞术检测细胞凋亡结果，T4-set1和T4-set2是8个靶点gRNA表达载体中各自4个的组合，T8-set1+2是8个靶点gRNA表达载体全部处理HepG2的结果，图2B是图2A中结果的统计。可见将针对HepG2细胞中特有的DNA的CRISPR系统和两个DNA损伤修复抑制剂(NU7441和KU55933)，一起加入HepG2中对该细胞有明显的杀伤作用。

实施例2：利用本发明的方法，对DU145前列腺癌细胞进行特异性杀伤

步骤一：先进行DNA测序；

我们通过全基因组测序检测了DU145前列腺癌细胞的DNA序列。

步骤二：经过序列分析能确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；

我们通过将测得的DU145前列腺癌细胞的DNA序列与正常人参考基因组(Feb.2009(GRCh37/h19)对比，明确DU145前列腺癌细胞中特有的DNA序列位点。

步骤三：然后设计合成针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统；

我们使用的是CRISPR系统，我们初步评估DU145细胞中的突变位点，我们选择如下7个位点进行gRNA设计和合成，并构建了这些gRNA的慢病毒表达载体。

DU145前列腺癌细胞中特有的DNA突变以及gRNA设计序列如下：

这些gRNA不能识别任何正常细胞中的DNA，但却能识别DU145前列腺癌细胞中的DNA序列。

步骤四：将针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统，以及抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

我们通过将表达Cas9和上述7个gRNA的慢病毒混合物(构建方法为常规技术，参见文献Platt RJ,Chen S,Zhou Y,et al.CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editingand cancer modeling.Cell.2014；159(2):440-455.doi:10.1016/j.cell.2014.09.014)，以及DNA损伤修复抑制剂(本实施例中，我们分别利用了既可以抑制NHEJ通路又可以抑制HR通路的抑制剂wortmannin--购自Selleck公司，或者联合应用NU7441&KU55933)加入DU145细胞培养基，然后检测细胞死亡情况。

实验结果发现我们的策略可以显著杀伤DU145细胞，见图3所示：

本实验是流式细胞术检测经过本发明方法处理的前列腺癌细胞DU145细胞(含有gRNA和Cas9识别的特有DNA突变)和人胚肾上皮细胞HEK293T(不含有导入的gRNA和Cas9识别的特有DNA突变)的细胞凋亡结果。图3B是图3A中结果的统计。可见将针对DU145细胞中特有的DNA的CRISPR系统不管是和两个DNA损伤修复抑制剂(NU7441和KU55933)一起，还是和一个DNA损伤修复抑制剂(wortmannin)一起，加入DU145后，对该细胞有明显的特异性杀伤作用，而对正常细胞人胚肾上皮细胞HEK293T没有明显杀伤作用。

实施例3：利用本发明的方法，对Hep3B肝癌细胞进行特异性杀伤

步骤一：先进行DNA测序；

我们通过分析CCLE网站,(https://depmap.org/portal/cell_line/ACH-000979？tab＝mutation)，这是一个肿瘤数据库网站，获取Hep3B肝癌细胞中的DNA突变信息。

步骤二：经过序列分析能确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；

我们通过将下载的Hep3B肝癌细胞的DNA序列信息与正常人参考基因组(Feb.2009(GRCh37/h19)对比，明确Hep3B肝癌细胞中特有的DNA序列位点。

步骤三：然后设计合成针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统；

我们使用的是CRISPR系统，我们选择如下4个位点进行gRNA设计和合成，并构建了这些gRNA的慢病毒表达载体，Cas9核酸内切酶由另一个慢病毒表达。

Hep3B肝癌细胞中特有的DNA突变以及gRNA设计序列如下：

这些gRNA不能识别任何正常细胞中的DNA，但却能识别Hep3B癌细胞中的DNA序列。

步骤四：将针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统，以及抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

我们通过将表达Cas9和上述4个gRNA的慢病毒混合物，以及DNA损伤修复抑制剂(本实施例中，我们加入的是抑制NHEJ通路的DNA-PKcs的抑制剂NU7441，和HR通路的ATM抑制剂KU55933)加入Hep3B细胞的培养基，然后检测细胞死亡情况。

实验结果发现我们的策略可以显著杀伤Hep3B细胞，见图4所示：

CCK-8实验检测经过本发明方法处理后的肝癌Hep3B细胞的存活情况。可见将针对Hep3B细胞中特有的DNA的CRISPR系统和两个DNA损伤修复抑制剂(NU7441和KU55933)一起导入肝癌细胞Hep3B后，对该细胞有明显的特异性杀伤作用，其它各组是各单一成分对照或其他组合对照。

实施例4：利用本发明的方法，对肝癌PDX进行特异性杀伤

步骤一：先进行DNA测序；

我们通过二代测序明确来源于临床上肝癌病人新鲜样本的，人源性组织异种移植(patient-derivedxenografts,PDX)模型中癌细胞中的DNA序列。

步骤二：经过序列分析能确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；

我们通过将测得的肝癌PDX中癌细胞的DNA序列信息与正常人参考基因组(Feb.2009(GRCh37/h19)对比，明确肝癌PDX中癌细胞中特有的DNA序列位点。

步骤三：然后设计合成针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统；

我们使用的是CRISPR系统，我们选择如下7个位点进行gRNA设计和合成，并构建了这些gRNA的慢病毒表达载体，该载体同时表达Cas9核酸内切酶。

肝癌PDX中癌细胞中特有的DNA突变以及gRNA设计序列如下：

这些gRNA不能识别任何正常细胞中的DNA，但却能识别肝癌PDX中癌细胞中的DNA序列。

步骤四：将针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统，以及抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

我们通过将表达Cas9和上述7个gRNA的慢病毒混合物，以及DNA损伤修复抑制剂(本实施例中，我们加入的是抑制NHEJ通路的DNA-PKcs的抑制剂NU7441，和HR通路的ATM抑制剂KU55933)，通过瘤内注射的方式，尝试治疗PDX模型小鼠身上的肝癌，发现我们的策略可以显著抑制肿瘤的生长，实验结果如图5所示：

在肝癌PDX中验在本发明方法的有效性。将针对该肝癌PDX癌细胞中特有的DNA的CRISPR系统和两个DNA损伤修复抑制剂(NU7441和KU55933)通过瘤内注射处理PDX小鼠，注射后每隔3天测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。可见和对照(只有Cas9没有gRNA的慢病毒+DNA抑制剂)相比，实验组肿瘤生长速度显著减慢。

实施例5：利用本发明的方法，对前列腺癌PDX进行特异性杀伤

步骤一：先进行DNA测序；

我们通过全外显子测序来明确来源于临床上前列腺癌病人新鲜样本的，人源性组织异种移植(patient-derivedxenografts,PDX)模型中癌细胞中的DNA序列。

步骤二：经过序列分析能确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；

我们通过将测得的前列腺癌PDX中癌细胞的DNA序列信息与正常人参考基因组(Feb.2009(GRCh37/h19)对比，明确前列腺癌PDX中癌细胞中特有的DNA序列位点。

步骤三：然后设计合成针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统；

我们使用的是CRISPR系统，我们选择如下5个位点进行gRNA设计和合成，并构建了这些gRNA的慢病毒表达载体，该载体同时表达Cas9核酸内切酶。

前列腺癌PDX中癌细胞中特有的DNA突变以及gRNA设计序列如下：

这些gRNA不能识别任何正常细胞中的DNA，但却能识别所测得前列腺癌PDX中癌细胞中的DNA序列。

步骤四：将针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统，以及抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

我们通过将表达Cas9和上述5个gRNA的慢病毒混合物，以及DNA损伤修复抑制剂(本实施例中，我们加入的是抑制NHEJ通路的DNA-PKcs的抑制剂NU7441，和HR通路的ATM抑制剂KU55933)，通过瘤内注射的方式，尝试治疗PDX模型小鼠身上的前列腺癌，发现我们的策略可以显著抑制肿瘤的生长，见图6所示：

在前列腺癌PDX中验在本发明方法的有效性。将针对该前列腺癌PDX癌细胞中特有的DNA的CRISPR系统和两个DNA损伤修复抑制剂(NU7441和KU55933)通过瘤内注射处理PDX小鼠，注射后每隔3天左右测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。可见和对照(只有Cas9没有gRNA的慢病毒+DNA抑制剂)相比，实验组肿瘤生长速度显著减慢。

实施例6：利用本发明的方法，对肝癌类器官进行特异性杀伤

步骤一：先进行DNA测序；

我们通过二代测序明确来源于临床上肝癌病人新鲜样本的，肝癌类器官中癌细胞中的DNA序列。

步骤二：经过序列分析能确定其癌细胞中特有的，不同于正常细胞的若干条DNA序列；

我们通过将测得的肝癌类器官中癌细胞的DNA序列信息与正常人参考基因组(Feb.2009(GRCh37/h19)对比，明确肝癌类器官中癌细胞中特有的DNA序列位点。

步骤三：然后设计合成针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统；

我们使用的是CRISPR系统，我们选择如下3个位点进行gRNA设计和合成，并构建了这些gRNA的慢病毒表达载体，该载体同时表达Cas9核酸内切酶。

肝癌类器官中癌细胞中特有的DNA突变以及gRNA设计序列如下：

这些gRNA不能识别任何正常细胞中的DNA，但却能识别肝癌类器官中癌细胞中的DNA序列。

步骤四：将针对癌细胞中特有的这些序列的基因编辑系统，以及抑制DNA损伤修复的药物导入细胞。

我们通过将表达Cas9和上述3个gRNA的慢病毒混合物，以及DNA损伤修复抑制剂(本实施例中，我们加入的是抑制NHEJ通路的DNA-PKcs的抑制剂NU7441，和HR通路的ATM抑制剂KU55933)，加入培养肝癌类器官的培养基，发现我们的策略可以显著抑制该肝癌类器官的生长，见图7所示：

将针对该肝癌类器官中癌细胞特有的DNA的CRISPR系统和两个DNA损伤修复抑制剂(NU7441和KU55933)加入培养的肝癌类器官培养基后，观察类器官的生长情况。可见该策略显著抑制该肝癌类器官的生长。在肝癌类器官中验证本发明方法的有效性。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军海军军医大学

<120> 通过基因编辑技术联合DNA损伤修复抑制剂特异杀伤癌细胞的方法

<130> 说明书

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

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ggcgggctca tggaaggtgt 20

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