一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用

摘要

本发明公开了一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用，提供了黄花酢浆草的新用途，即黄花酢浆草在体外抗氧化性、抗结石中的应用；以黄花酢浆草为原料，用超声提取法提取，抽滤，旋转蒸发除去提取剂乙醇溶液，萃取分相后，减压蒸干萃取剂，分析比较黄花酢浆草各个萃取相的多糖、黄酮含量，从DPPH·清除率、·OH清除率和总还原能力三个方面比较黄花酢浆草各个萃取相的体外抗氧化性；通过火焰原子分光光度计测定钙离子的浓度，计算各萃取相对一水合籽晶的生长体外抑制指数，比较分析黄花酢浆草各萃取相的体外抗结石作用；以其为黄花酢浆草进一步的开发与利用提供理论依据，尤其是黄花酢浆草体外抗结石的应用。

说明书

技术领域

本发明属于天然植物有效成分提取及应用技术领域，具体设计一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用。

背景技术

黄花酢浆草属双子叶植物纲、酢浆草科植物，多生长在背阴、暖和和润湿的环境，在我国分布广泛。酢浆草属植物中的有效成分有良好的抗菌作用。其中黄花酢浆草中含有活性成分，可消除氧自由基、抗炎、抗氧化等生理功能，具有消毒消肿、清热祛湿、跌打瘀肿之症等功效。

酢浆草被列为苗药的顶级产品，目前对黄花酢浆草的药物成分、化学成分和活性的研究已陆续报道，国内李胜华[14]经过研究于2013年分离得到黄花酢浆草中的12个化合物，并鉴定了其中十个化合物。祁伟亮等于2018年选取两种酢浆草，通过微波辅助热提取和正交实验设计，探索多糖、黄酮和多酚的提取工艺，并测定生物活性成分的含量，获得最佳提取条件。吴杰等于2012年采用正交试验设计探讨了微波辅助法提取黄花酢浆草叶片中总黄酮的提取工艺条件，并研究了提取液的抗氧化性，得出提取黄酮的最佳工艺条件，每克叶中总黄酮含量为16.3900mg。对提取液的抗氧化性研究结果表明，酢浆草叶中总黄酮的清除率高于茎中总黄酮的清除率。Fonseca Diogo A等于2019年研究了黄花酢浆草提取物抑制去甲肾上腺素的血管升压作用。结果证实提取物中存在的类黄酮成分能抑制去甲肾上腺素引起的收缩，并且这种作用对浓度是有依赖性的。Gaspar Marisa C等于2018年对黄花酢浆草叶提取物的多酚含量进行表征，并对其生物活性进行评估，还进行了抗氧化和神经保护研究。

最终几种木犀草素和芹菜素衍生物被确定为提取物的主要成分，它对肾上腺素系统表现出拮抗作用，抑制了去甲肾上腺素的收缩(最大收缩减少58.44％)。主要集中在过氧化物酶、色素等化合物的提取及体外抑菌作用的研究，但有关其生物活性成分及药理作用的研究报道较少，还没有关于各萃取相中体外抗结石能力研究的报道。

所以对黄花酢浆草抗氧化性和抑菌性的研究与运用，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明以黄花酢浆草为原料，用超声提取法提取，抽滤，旋转蒸发除去提取剂乙醇溶液，萃取分相后，减压蒸干萃取剂，分析比较黄花酢浆草各个萃取相的多糖、黄酮含量，从DPPH·清除率、·OH清除率和总还原能力三个方面比较黄花酢浆草各个萃取相的体外抗氧化性；通过火焰原子分光光度计测定钙离子的浓度，计算各萃取相对一水合籽晶的生长体外抑制指数，比较分析黄花酢浆草各萃取相的体外抗结石作用；以其为黄花酢浆草进一步的开发与利用提供理论依据，尤其是黄花酢浆草体外抗结石的应用。

为了达到上述目的，本发明提供了黄花酢浆草的新用途，即黄花酢浆草在体外抗氧化性、抗结石中的应用；

本发明提供了一种黄花酢浆草有效成分提取方法，其特征在于，包括：

S1原料：清除泥土枯枝，清洗，自然晒干，粉碎过100目筛，密封保存备用；

S2准确称量定量黄花酢浆草粉末；

S3于定量黄花酢浆草粉末中加入乙醇；

S4于75℃超声提取1h，抽滤，将滤液减压浓缩至无醇味；

S5依次用V提取液；

S6萃取液于旋转蒸发仪蒸干；

进一步的，所述V萃取剂为1:1的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇；

本发明的有益效果是：

本发明以黄花酢浆草为原料，用超声提取法提取，抽滤，旋转蒸发除去提取剂乙醇溶液，萃取分相后，减压蒸干萃取剂，分析比较黄花酢浆草各个萃取相的多糖、黄酮含量，从DPPH·清除率、·OH清除率和总还原能力三个方面比较黄花酢浆草各个萃取相的体外抗氧化性；通过火焰原子分光光度计测定钙离子的浓度，计算各萃取相对一水合籽晶的生长体外抑制指数，比较分析黄花酢浆草各萃取相的体外抗结石作用；黄花酢浆草现有物质新用途，应用于抗氧化、体外抗结石，进一步提升了黄花酢浆草的使用价值，对后期黄花酢浆草的深入开发研究提供有力的理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用的葡萄糖标准曲线图；

图2是一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用的芦丁标准曲线图；

图3是一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用的黄花酢浆草提取液各萃取相对DPPH·的清除作用统计曲线图；

图4是一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用的黄花酢浆草提取液各萃取相对·OH清除作用统计曲线图；

图5是一种黄花酢浆草有效成分提取方法及其应用的黄花酢浆草提取液各萃取相总还原力作用统计曲线图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

原料：黄花酢浆草，采自云南省保山市施甸县，清除泥土枯枝，清洗，自然晒干，粉碎过100目筛，密封保存备用。

仪器：UV-2600紫外分光光度计：岛津有限公司；AA-7000火焰原子分光光度计：日本岛津；FA3204B电子天平：上海精科天美天平仪器公司；WJX-200高速多功能粉碎机：上海缘沃工贸有限公司；DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；AC220V数控超声波清洗仪：上海精密科学仪器有限公司；EPED-20TJ实验室超纯水：普易达；Hei-AdbantageML/G3旋转蒸发仪：德国海道夫。

试剂：硫酸亚铁、无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇(分析纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司；抗坏血酸(分析纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司；水杨酸；(分析纯)：上海化学试剂有限公司有限公司；葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸(分析纯)：天津市大茂化学试剂厂；三氯化铁(分析纯)：上海星云化工有限公司；Tris试剂(分析纯)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；芦丁(标准品)：安徽酷尔生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(标准品)：合肥巴斯夫生物科技有限公司。

实施例1

本实施例为一种黄花酢浆草有效成分提取方法，其特征在于，包括：

S1原料：清除泥土枯枝，清洗，自然晒干，粉碎过100目筛，密封保存备用；

S2准确称量定量黄花酢浆草粉末；

S3于定量黄花酢浆草粉末中加入乙醇；

S4于75℃超声提取1h，抽滤，将滤液减压浓缩至无醇味；

S5依次用V提取液；

S6萃取液于旋转蒸发仪蒸干；

所述V萃取剂为1:1的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇；

其中，1、黄花酢浆草有效成分多糖的提取与含量测定

(1)供试液的制备

准确称量2g(精确至0.001g)黄花酢浆草，加180mL 90％乙醇，75℃超声提取1h，抽滤，将滤液减压浓缩至无醇味，依次用V提取液：V萃取剂为1:1的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。萃取液于旋转蒸发仪蒸干，备用。

(2)葡萄糖标准曲线的绘制

参照孔庆龙等人[19]的方法配制葡糖糖标准溶液。准确吸取对照品溶液0.00，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50mL的葡萄糖标准溶液于试管中。依次对应加入2.00，1.70，1.40，1.10，0.80，0.50mL蒸馏水后，参照孔庆龙等人的实验方法进行显色，以第一管为空白，于490nm处测定吸光度，并绘制葡萄糖标准曲线。以第一管为空白，于490nm处测定吸光度，并绘制葡萄糖标准曲线。

(3)样品中多糖的测定

各萃取相提取液分别取1.00mL，参照现有葡萄糖标准曲线绘制方法，在490nm处测定吸光度，代入葡萄糖标准曲线方程，求出黄花酢浆草各萃取相中多糖的浓度，根据公式计算出黄花酢浆草中各萃取相多糖的含量。

多糖的含量＝C×V/m

式中：C为多糖的浓度(ug/mL)；V为提取液稀释后的体积(mL)；m为黄花酢浆草样品的质量(g)。

2、黄花酢浆草有效成分多糖的提取与含量测定

(1)供试液的制备

准确称量2g(精确至0.001g)黄花酢浆草，加180mL 90％乙醇，超声提取1h，抽滤，将滤液旋转蒸发至无醇味，用V提取液：V萃取剂为1:1的萃取剂萃取，本实验选取的萃取剂是正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚，按照极性从低到高依次萃取。萃取液于旋转蒸发仪除去萃取剂，备用。

(2)芦丁标准曲线的绘制

参照罗永会等人[20]的方法配制芦丁标准试液，则芦丁标准液的浓度为0.50mg/mL。准确吸取对照品溶液0.00,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.20mL于试管中，分别加60％乙醇溶液2.00,1.80,1.60,1.40,1.20,1.00,0.80mL，摇匀，加入5％亚硝酸钠溶液0.30mL，摇匀，室温下静置6min，加10％硝酸铝0.30mL，摇匀，室温下放置6min后，加5％氢氧化钠2.00mL，摇匀，室温下放置15min后，加10.00mL 60％乙醇溶液，于510nm处测吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[21,22]。

(3)样品中黄酮含量的测定

各萃取相提取液分别取1.00mL，参照芦丁标准曲线绘制方法方法在510nm处测定吸光度，代入芦丁标准曲线方程，求出黄花酢浆草各萃取相中黄酮的浓度，根据公式计算出黄花酢浆草中各萃取相黄酮的含量。

黄酮的含量＝C×V/m

式中：C为样品中黄酮的浓度(mg/mL)，根据标准曲线算出；V为样品稀释后的体积(mL)；m为样品的质量(g)。

3、结果与分析

(1)葡萄糖标准曲线绘制与黄花酢浆草提取液各萃取相多糖含量测定结果

以葡萄糖浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线图1。

由图1得Y＝0.05979X+0.01423,R2＝0.99501,线性关系良好。

利用苯酚硫酸法经平行测定得吸光度A，代入葡萄糖标准曲线方程求得各萃取相多糖的含量如下表1所示。

表1各萃取相中多糖的含量

(2)芦丁标准曲线的绘制与黄花酢浆草提取液各萃取相黄酮含量测定结果

以芦丁浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线图2。

由图2得Y＝12.04071X+0.00348，R2＝0.9984，线性关系良好。

利用亚硝酸-硝酸铝-氢氧化钠比色法经平行测定得吸光度A，代入芦丁标准曲线方程求得各萃取相黄酮的含量如下表2所示。

表2各萃取相中黄酮含量

实施例2

本实施例为黄花酢浆草体外抗氧化性研究

1、供试液的制备

称取90g(精确至0.001g)黄花酢浆草粉末，加入900mL90％乙醇溶解，于75℃超声提取提取1h，抽滤，边抽滤边用90％乙醇100mL淋洗滤渣3次，将滤液置于旋转蒸发仪旋转除去乙醇，用V提取液：V萃取剂为1:1的萃取剂萃取，本实验选取正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚作为萃取剂，按照极性从低到高依次萃取。萃取液于旋转蒸发仪除去萃取剂至无萃取剂味。用无水乙醇将黄花酢浆草各萃取相提取物配置成相应浓度的待测样品。

2、黄花酢浆草对DPPH·的清除率

分别取质量浓度样品(0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70mg/mL)4.00mL置于试管中，各加入4.00mL0.2mmoL/L DPPH溶液，摇匀，避光反应30min，517nm处测定吸光度值Ar，以4.00mL无水乙醇替代2.00mLDPPH，测定吸光度值As，以4.00mL蒸馏水作为空白对照组，测定吸光度At，配置同浓度的Vc溶液按照上述操作步骤进行Vc对DPPH·清除率的测定，并与每个萃取相对DPPH·清除率进行对比。重复三次实验。根据公式计算出各萃取相对DPPH·的清除率。

清除率(％)＝[At-(Ar-As)/At]×100％

3、黄花酢浆草对·OH的清除率

用无水乙醇将黄花酢浆草各萃取相提取物配置成相应浓度的待测样品，分别取质量浓度样品(0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70mg/mL)2.00mL置于试管中，分别加入2.00mL 9mmoL/L FeSO4溶液，2.00mL9mmoL/L水杨酸乙醇溶液以及2.00mL9mmoL/L H2O2溶液，摇匀。置于恒温水浴锅(温度控制在37℃)反应30min后，在510nm处测定光度值Ar，以超纯水代替样品，测定吸光度值At，以蒸馏水代替H2O2，测定吸光度值As。配置同浓度的Vc溶液按照上述操作步骤进行Vc对·OH清除率的测定，并与每个萃取相对·OH清除率进行对比。重复三次实验。根据公式计算出各萃取相对·OH的清除率。

清除率(％)＝[1-(Ar-As)/At]×100％

4、黄花酢浆草总还原能力分析

用无水乙醇将黄花酢浆草各萃取相提取物配置成相应浓度的待测样品，分别取质量浓度样品(0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70mg/mL)1.00mL置于试管中，参照李加兴等的方法测定黄花酢浆草各萃取相的总还原能力，重复三次实验。用吸光度表示总还原能力。

5、结果于分析

(1)黄花酢浆草提取液各萃取相对DPPH·的清除效果

以DPPH·清除率为纵坐标，提取液各萃取相中样品浓度为横坐标，绘制得图3。

由图3可知，在提取液各萃取相浓度范围为0.10～0.70mg/mL时，黄花酢浆草提取液各萃取相对DPPH·清除效果强弱为：正丁醇相>乙酸乙酯相>二氯甲烷相>石油醚相。

(2)黄花酢浆草提取液各萃取相对·OH的清除效果

以羟基自由基清除率为纵坐标，黄花酢浆草中各萃取相中样品浓度为横坐标，绘制图得图4。

由图4可知，在提取液各萃取相浓度范围为0.10～0.70mg/mL时，黄花酢浆草提取液各萃取相对·OH清除效果强弱为：正丁醇相>乙酸乙酯相>二氯甲烷相>石油醚相。

(3)黄花酢浆草提取液各萃取相的总还原力作用

以吸光度为纵坐标，黄花酢浆草中各萃取相中样品浓度为横坐标，绘制图得图5。吸光度越大，还原能力越强。提取液各萃取相的总还原能力如图5所示。

由图5可知，在提取液各萃取相浓度范围为0.10～0.70mg/mL时，黄花酢浆草提取液各萃取相总还原能力强弱为：正丁醇相>乙酸乙酯相>二氯甲烷相>石油醚相。

实施例3

本发明的又一实施例为黄花酢浆草体外抗结石作用研究

分别称取各萃取相提取物1g(精确至0.001g)，其中石油醚相和二氯甲烷相提取物先加入适量无水乙醇，使样品溶解，再加入蒸馏水配置成浓度为0.1g/mL的待测样品；乙酸乙酯相和正丁醇相加入蒸馏水配置成浓度为0.1g/mL的待测样品。取48mLTris(PH＝6.5)，先后加入0.03moL/L的CaCl2及Na2C2O4溶液各1.00mL，混匀，得浓度为0.6moL/L的草酸钙亚稳过饱和溶液50.00mL[31]。再加入2.50mL0.1g/mL的样品溶液，恒温振荡10min，用针筒取样10.00mL，0.22um过滤头过滤于试管中。火焰原子分光光度计测定钙离子吸光度。加入一水合籽晶0.50mL(5mg/mL)，混匀，孵化2h[32]，针筒取样10.00mL，0.22um过滤头过滤。于火焰原子分光光度计测定钙离子吸光度。每组平行操作三次。按公式(3-5)计算样品对一水合籽晶的生长体外抑制指数：

生长抑制指数(I)＝[1-(C0-Ct)/C0]×100％

C0:籽晶加入前钙离子浓度；Ct：籽晶加入后钙离子浓度；

结果与分析

表3各萃取相对草酸钙结晶生长体外抑制指数

黄花酢浆草各萃取相对草酸钙结晶生长体外抑制指数的结果如表3。实验结果显示，各萃取相的体外抗结石能力差异较大，其中石油醚萃取相的体外抗结石能力最差，对草酸钙结晶生长体外抑制指数仅为3.85％，正丁醇萃取相的体外抗结石能力最好，对草酸钙结晶的生长体外抑制指数已经达到了46.53％，乙酸乙酯萃取相的体外抗结石能力也相对较好，对草酸钙结晶生长体外抑制指数为27.32％，而二氯甲烷萃取相的体外抗结石能力相对较差，对草酸钙结晶生长体外抑制指数为7.01％。

综上所述，利用超声波辅助提取法提取黄花酢浆草中的有效成分，并用有机萃取剂(正丁醇萃取剂、乙酸乙酯萃取剂、二氯甲烷萃取剂、石油醚萃取剂)按极性由低到高依次萃取提取液，旋转蒸发挥干提取剂。利用苯酚-硫酸法测定各个萃取相的多糖含量，实验结果为正丁醇萃取相的多糖含量最高为5.9990mg/g，乙酸乙酯萃取相的多糖含量最低。而对于黄花酢浆草中黄酮的含量，正丁醇萃取相的黄酮含量最高为2.3250mg/g，石油醚萃取相的黄酮含量最低。多糖和黄酮是天然产物中主要的抗氧化成分之一，具有丰富的药理活性。通过测定DPPH·清除率和·OH清除率研究体外抗氧化活性，其结果为体外抗氧化性均为正丁醇相的最强，推测该萃取相较强的抗氧化性可能与其丰富的多糖和黄酮含量有关。对DPPH·的清除率在提取液浓度为0.10～0.70mg/mL范围内最高清除率达87.60％，对·OH的清除率在提取液浓度0.10～0.70mg/mL范围内最高清除率达71.89％。而总还原能力也是正丁醇相的最强，且随着提取液浓度的升高，吸光度逐渐增大，说明随着浓度的增加，总还原能力逐渐增强。根据以上可得出黄花酢浆草提取液的各相萃取液中，正丁醇萃取相的抗氧化能力最强。通过火焰原子分光光度法测定钙离子的浓度，计算得出石油醚相的体外抗结石能力最弱，对草酸钙结晶生长体外抑制指数仅为3.85％，而正丁醇相的体外抗结石能力最强，对草酸钙结晶生长体外抑制指数为46.53％，推测该萃取相较强的抗氧化性可能与其丰富的多糖和黄酮含量有关。

本发明以黄花酢浆草为原料，用超声提取法提取，抽滤，旋转蒸发除去提取剂乙醇溶液，萃取分相后，减压蒸干萃取剂，分析比较黄花酢浆草各个萃取相的多糖、黄酮含量，从DPPH·清除率、·OH清除率和总还原能力三个方面比较黄花酢浆草各个萃取相的体外抗氧化性；通过火焰原子分光光度计测定钙离子的浓度，计算各萃取相对一水合籽晶的生长体外抑制指数，比较分析黄花酢浆草各萃取相的体外抗结石作用；黄花酢浆草现有物质新用途，应用于抗氧化、体外抗结石，进一步提升了黄花酢浆草的使用价值，对后期黄花酢浆草的深入开发研究提供有力的理论依据。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。