基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及应用

摘要

本发明公开了基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及其应用。Bcl6‑SE敲除的动物模型的构建方法包括如下步骤：1)靶向小鼠Bcl6‑SE序列的gRNA设计：2)将步骤1)中的一对gRNA进行纯化并和cas9质粒共同注射小鼠胚胎，获得F0代小鼠；3)鉴定Bcl6‑SE基因型，筛选出阳性F0代小鼠；4)阳性F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠自交获得纯合后代，从而构建得到Bcl6‑SE基因敲除的动物模型。本发明基于CRISPR/Cas9技术实现对Bcl6‑SE调控序列的定点敲除，具有操作简单，敲除效率高的优势。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程的实验动物模型技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及应用。

背景技术

Bcl6(B cell lymphoma 6)基因编码一个含有保守锌指结构的转录抑制因子，属于BTB/POZ转录因子家族。Bcl6通过募集特异性染色质修饰辅抑制复合体来抑制许多靶基因表达。Bcl6最初作为原癌基因被鉴定，在体液免疫和淋巴瘤发生中发挥关键作用。Bcl6可以介导弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞异常增殖、基因组不稳定和分化阻滞。生发中心(Germinal Center)是B细胞产生高亲和力抗体的地方，而Bcl6是生发中心的关键调节因子。Bcl6在B细胞早期发育中也发挥作用，可以对抗免疫球蛋白轻链V(D)J重组中诱发的凋亡。

超级增强子(super enhancers，SEs)是一种由连续排列的调控元件串联形成的超长增强子，可以强力驱动细胞相关基因的表达，细胞中的数百个SEs控制着关键基因，决定细胞命运走向。在肿瘤发生、老年痴呆、糖尿病及许多自身免疫疾病中，均发现致病基因的表达与部分超级增强子的异常活化高度相关。研究表明Bcl6附近存在超级增强子(Bcl6-super enhancer，Bcl6-SE)，并且该增强子对Bcl6具有一定的调剂作用，从而参与T细胞的发育调控。然而，Bcl6-SE究竟是如何调控Bcl6基因的表达，从而影响T细胞发育的过程仍不是很清楚，因此构建超级增强子Bcl6-SE敲出小鼠显得尤为重要。

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其相关Cas9蛋白介导的新一代基因编辑技术具有操作容易、成本低廉的优势，可实现精确高效的基因编辑功能，包括定点插入、定点敲除及定点突变等，已广泛用于多种动植物的基因编辑。介于CRISPR/Cas9进行基因编辑的优势，本专利采用该技术对Bcl6-SE进行基因编辑，构建超级增强子敲出小鼠模型。

发明内容

本发明旨在提供一种基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法及其应用。

针对上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6基因超级增强子敲除动物模型的方法，包括如下步骤：

1)靶向C57小鼠Bcl6-SE序列的gRNA设计：

根据Bcl6-SE序列设计一对相应的gRNA，其中，gRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；

2)mRNA制备并显微注射获得F0小鼠：

将步骤1)中的一对gRNA进行纯化并和cas9质粒共同注射小鼠胚胎，获得F0代小鼠；

3)鉴定Bcl6-SE基因型，筛选出阳性F0代小鼠；

4)阳性F0代小鼠与野生型小鼠杂交得到F1代小鼠，F1代杂合小鼠自交获得纯合后代，从而构建得到Bcl6-SE敲除的动物模型。

进一步地，步骤3)中用于Bcl6-SE基因鉴定的引物包括公用上游引物和两条下游引物，其中，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4和EQ ID NO.5所示。

第二方面，本发明提供一种由上述方法构建得到的Bcl6-SE敲除的动物模型。

第三方面，本发明构建的Bcl6-SE敲除的动物模型可应用于研究T细胞发育过程中，超级增强子对Bcl6基因表达的调控。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明基于CRISPR/Cas9技术实现对Bcl6-SE的定点敲除，具有敲除效率高的优势，所构建的Bcl6-SE敲除的动物模型可拥有T细胞发育过程中超级增强子功能研究，有助于阐述T细胞发育的机制及为免疫系统疾病的治疗提供基础。

附图说明

图1为小鼠Bcl6-SE结构示意图；

图2为用于Bcl6-SE基因型鉴定引物的设计方案图；

图3为F0代小鼠基因型鉴定琼脂糖电泳图；

图4为F0代小鼠测序鉴定结果图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种基于CRISPR/Cas9技术构建Bcl6-SE敲除动物模型的方法，包括如下步骤：

1.靶向小鼠Bcl6-SE调控序列的gRNA设计

在Bcl6-SE区域两侧相应位置设计一对用于Bcl6-SE基因敲除的gRNA(gRNA1和gRNA2)，其中，gRNA1和gRNA2的位置如图1所示，其序列如表1所示。其中，靶向Bcl6-SE核苷酸序列位于Bcl6基因与Lpp基因之间，gRNA1与gRNA2分别位于该区间的上游与下游。

表1用于小鼠Bcl6-SE序列敲除的gRNA序列

2.mRNA制备并显微注射获得F0小鼠

将步骤1)中的gRNA1和gRNA2进行纯化，将纯化后的产物和cas9质粒(Cas9质粒由发明人所在实验室改造得到)共同注射C57小鼠胚胎，注射后将胚胎移植到代孕受体小鼠的输卵管内，原核注射共获得284枚胚胎。

3.F0代小鼠的出生及鉴定

出生小崽数量为38只，F0代小鼠出生1周后进行剪尾鉴定，得到6只阳性(2只雌性，4只雄性)F0代小鼠，毛色为黑色，如表2所示。

表2阳性F0代小鼠信息列表

用于Bcl6-SE基因型鉴定的特异性引物设计方案如图2所示，野生型(WT)与Bcl6-SE基因敲除型(KO)采用共同的上游引物，野生型采用Bcl6-SE-seqF作为上游引物，Bcl6-SE-seqR1作为下游引物；Bcl6-SE基因敲除型采用Bcl6-SE-seqF作为上游引物，Bcl6-SE-seqR2作为下游引物。Bcl6-SE-seqF、Bcl6-SE-seqR1和Bcl6-SE-seqR2的序列分别如表3中的SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

表3用于SEts2基因型鉴定的特异性引物

对F0代小鼠出生1周后进行剪尾鉴定的PCR反应体系和反应程序如表4和表5所示，PCR反应后野生型与Bcl6-SE基因敲除型中针对Bcl6-SE基因的PCR产物大小分别为446bp和503bp，其中对F0代小鼠进行基因型判断的标准如表6所示，由Bcl6-SE-seqF和Bcl6-SE-seqR1进行PCR扩增后获得446bp的产物，而由Bcl6-SE-seqF和Bcl6-SE-seqR2进行PCR扩增后未获得任何产物，则认定该小鼠为野生型小鼠；当由Bcl6-SE-seqF和Bcl6-SE-seqR1进行PCR扩增后未获得任何产物，而由Bcl6-SE-seqF和Bcl6-SE-seqR2进行PCR扩增获得503bp的产物，则认定该小鼠为SEts2基因敲除型；当由Bcl6-SE-seqF和Bcl6-SE-seqR1进行PCR扩增后获得446bp的产物，而由Bcl6-SE-seqF和Bcl6-SE-seqR2进行PCR扩增获得503bp的产物，则为杂合型，即阳性F0代小鼠。

表4 PCR反应体系

表5 PCR反应程序

表6小鼠基因型判定标准

对F0代小鼠Bcl6-SE基因型鉴定的琼脂糖电泳图如图3所示，对出生的38只小鼠进行PCR及琼脂糖电泳检测，得到编号为1257、1260、1482、1499、1489、1491六只只小鼠为基因编辑小鼠。对获得的六只基因编辑小鼠进行直接测序测序，对F0代小鼠进行Bcl6-SE敲除鉴定，测序结果如图4所示，1257、1260、1482、1489四只小鼠基因型相同，敲除长度为～119.2kb；1491小鼠敲除长度为～119.2kb；1499小鼠敲除长度为～119.2kb，表明由本发明构建的gRNA1和gRNA2介导的Cas9基因敲除能够有效敲除Bcl6-SE片段。

4.F0代阳性小鼠采用1257号进行扩繁，在8周龄性成熟后与野生型C57小鼠进行配繁，出生F1代小鼠在1周龄进行剪尾鉴定。共出生F1小鼠5只，经基因型鉴定，共有4只阳性F1鼠。F1代小鼠信息如表7。

表7 F0代与C57小鼠繁殖信息

表8 F1代阳性小鼠信息

上述构建Bcl6-SE敲除动物模型的方法具有操作简单、敲除效率高的优势；由上述方法构建得到的Bcl6-SE敲除的动物模型，有助于对超级增强子参与的Bcl6-SE基因调控机制进行研究。