检测胃癌外泌体中lncRNA-NEAT1的试剂盒及其在胃癌诊断中的应用

摘要

本发明公开了lncRNA‑NEAT1在制备胃癌诊断标志物中的应用，同时还公开了一种检测胃癌外泌体中lncRNA‑NEAT1的试剂盒及其在诊断学中的应用。通过使用实时荧光定量PCR技术，对捕获的外泌体中lncRNA NEAT1表达量进行检测，胃癌细胞系外泌体的捕获方法能够高效捕获胃癌外泌体；早期辅助性诊断的体外方法，能够为胃癌患者早诊断早治疗提供技术支持，对体外诊断试剂盒的开发等有深远意义。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞生物学及分子生物学，具体涉及检测胃癌外泌体中lncRNA-NEAT1的试剂盒及其在胃癌血清学诊断中的应用。

背景技术

胃癌是全球范围内的第四大癌症，但是其发病具有很明显的地理差异，亚洲地区，尤其东亚的发病率要明显高于其他地区。我国是胃癌发病的大国，每年新发胃癌68万例，约占世界范围内胃癌患者的40%~50%。由于胃癌早期没有明显的临床症状，况且早期胃癌的筛查工作开展较少，现阶段胃癌患者在确诊时多数已经是进展期胃癌。早期胃癌的治疗主要以手术切除为主，视病情配合放疗和化疗，部分患者可以治愈，但是仍然有50% 的复发率。进展期胃癌的治疗主要是以放化疗为主。传统的放化疗带来了一定的生存获益，但目前胃癌总体生存率仍不理想，5年生存率在30%左。早期缺乏典型症状会导致确诊延迟和转移。提高早期诊断率可显著增加治疗成功的机会。但是目前关于胃癌发生的分子机制知之甚少，为寻找早期有效的诊断指标带来了一定的困难。识别肿瘤相关基因改变可以为胃癌的诊断和治疗提供一定的思路。高通量筛选技术使得识别基因表达谱成为可能，2007年，Hutchinson等通过芯片技术筛选得到的一种维持亚核体完成性所必须的长链非编码RNA，命名为NEAT1。大约40%的长链非编码RNA是以反义方式转录到其他基因上的，它们通过顺式作用机制调节相邻蛋白质编码基因的表达，通过反式作用机制调节位于其他染色体上的基因的表达。越来越多的研究表明，长链非编码RNA在多种肿瘤生物学过程中发挥着重要作用，包括肿瘤发生、细胞凋亡、分化、增殖、血管生成和转移。

外泌体是由动态内吞形成的30-100nm细胞外微泡。研宄表明,几乎所有细胞均可产生外泌体,并释放于胞外体液中,包括血浆、尿液、唾液、羊水、腹水、脑脊液等。从细胞表面释放后,外泌体具有与受体细胞的质膜融合以将其内容物递送到细胞质中的能力。外泌体的含量是复杂的,包含多种生物活性蛋白、脂质、DNA和miRNA等并通过运输这些功能物质在细胞通讯中充当介质。外泌体中含有高度富集的特异性蛋白,如肿瘤易感基因101蛋白、CD63、热休克蛋白70、热休克蛋白90、CD9和CD81等,这 些通常被用作鉴定外泌体的标志物。文献报道外泌体是介导肿瘤细胞和微环境细胞通讯的关键因子,它们在促进肿瘤生长、肿瘤发生、肿瘤血管生成、肿瘤免疫逃逸、耐药和转移等方面发挥重要作用。外周血中的外泌体既可能来源于肿瘤细胞，也可由非肿瘤细胞释放，导致肿瘤外泌体所携带的DNA信息被大量非肿瘤细胞外泌体DNA所稀释，无法准确反映肿瘤的分子特征。这是外泌体应用于临床的一大难题。外泌体是活细胞分泌的人体细胞和癌症活细胞产生分泌到细胞外介导信号转导和物质运输双层纳米囊泡。囊泡主要包含膜系蛋白、microRNAs和exoDNA等，不易被降解，能够实时反映患者的健康状况信息。虽然CD63、CD9、CD81和TSG101等常用于检测外泌体，但却并不具有肿瘤特异性，因而造成肿瘤基因诊断的敏感性和特异性低。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种长链非编码lncRNA-NEAT1 的新用途，具体是lncRNA-NEAT1 作为胃癌细胞系外泌体诊断标志物的应用，以及在制备肝癌血清学诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种检测血清或胃癌细胞系外泌体中ncRNA-NEAT1的试剂盒，及其该试剂盒在诊断中的应用。

所述的lncRNA-NEAT1 在制备诊断胃癌的检测试剂或检测试剂盒中的应用，所述的生物样品选自：获自对象的胃癌外泌体、新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。

在现有技术中，多用检测血清来作为检测的对象，本发明还提供一种可以利用癌细胞外泌体作为检测对象。

相应的，本发明提供一种胃癌外泌体的捕获方法，其中胃癌细胞系MKN-45外泌体的捕获方法能够高效捕获胃癌外泌体；能够为胃癌诊断技术的开发与拓宽提供技术支持。

所采用的技术方案为包括如下步骤： S1 .从MKN-45胃癌细胞系培养体系中，筛选特异性外泌体表面蛋白质；S2 .以分子标志物CXCR4、CEA、Claudin 18.2为基础组合，以抗原抗体相互结合原理，生产CXCR4、CEA、Claudin 18.2分子的单克隆抗体，特异性结合来自胃癌细胞的外泌体；S3设计耦合上述分子组合标志物的外泌体免疫捕获系统，高效富集胃癌细胞来源的外泌体。

进一步地，还包括S4 将抗体结合在磁珠上，使磁珠成为抗体的载体。

进一步地，还包括S5用洗脱步骤收集游离的外泌体。

具体的癌外泌体的捕获方法还包括S6 对获取的胃癌细胞系外泌体，实时荧光定量PCR技术获得数据，随后使用软件进行分析，通过对比正常人和患者的外泌体的PCR数据，对胃癌的诊断和疾病进展进行评估。

本发明所述的lncRNA-NEAT1 在制备诊断胃癌的检测试剂或检测试剂盒中的应用，核心是用于检测生物样品中lncRNA-NEAT1 的表达量。

所述的检测试剂或试剂盒包括：对lncRNA-NEAT1 具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。

进一步的，本发明提供一组lncRNA-NEAT1 具有检测特异性的PCR 引物，具体序列如下：

lncRNA NEAT1上游引物： 5’-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3’，

下游引物：5’-CCTCATCCCTCCCAGTACC -3’；

内参 GAPDH上游引物： 5’- GCAACTAGGATGGTGTGGCT -3’，

下游引物：5’-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA -3’。

本发明提供的试剂盒包括：

A、逆转录系统，由逆转录体系缓冲液、引物、dNTPs、逆转录酶和RNA 酶抑制剂组成；

B、引物系统，

lncRNA NEAT1上游引物： 5’-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3’，

下游引物：5’-CCTCATCCCTCCCAGTACC -3’；

内参 GAPDH上游引物： 5’- GCAACTAGGATGGTGTGGCT -3’，

下游引物：5’-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA -3’

C、扩增系统，由SYBR Green Mix试剂盒的试剂组成。

本发明还提供一种利用试剂盒的检测方法，具体步骤如下：

采用Trizol试剂（美国 Invitrogen公司）从组织样本中提取总 RNA，采用NanoDrop2000光度计测定RNA 浓度和纯度，采用试剂盒进行逆转录反应，获得 cDNA，在2720型热循环 PCR系统中使用SYBR Green Mix试剂盒对cDNA产物进行扩增，

lncRNA NEAT1上游引物： 5’-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3’，

下游引物：5’-CCTCATCCCTCCCAGTACC -3’；

内参 GAPDH上游引物： 5’- GCAACTAGGATGGTGTGGCT -3’，

下游引物：5’-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA -3’。

PCR 扩增条件包括以下三个步骤：第一步 95.0 ℃ 2min；第二步 95.0 ℃ 15s，58℃ 40s（共 40个循环）；第三步（分离阶段），95.0 ℃ 15s， 60.0 ℃ 15s， 95.0 ℃ 15s自动记录NEAT1 和 GAPDH，用２－ΔΔCt表示lncRNA NEAT1 的相对表达量。

有益效果：

胃癌细胞系外泌体的捕获方法能够高效捕获胃癌外泌体；早期辅助性诊断的体外方法，能够为胃癌患者早诊断早治疗提供技术支持，对体外诊断试剂盒的开发等有深远意义。

附图说明

图1是实验组（MKN-45胃癌细胞外泌体）和对照组（正常人外周血外泌体）的Ct值。

图2是实验组（MKN-45胃癌细胞外泌体）和对照组（正常人外周血外泌体）的lncRNANEAT1的相对表达量数值。

图3是实验组（MKN-45胃癌细胞外泌体）和对照组（正常人外周血外泌体）lncRNANEAT1的相对表达量对比图。

具体实施方式

实施例1

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明优选的实施例，而不是全部的实施例。这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

一 .正常人的外周血采集，周血采集使用肝素抗凝管或者使用不抗凝的采血管静置5-10分钟后，3000转/ 分低速离心15分钟后，取上清液备用转移至新的无RNA酶的EP管中备用，如需长期保存，-80 ℃液氮保存。

二.MKN-45人胃癌细胞培养操作：（1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。（2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。首先弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；其次加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化；按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀；最后将细胞悬液按1：2比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

三.正常人外周血外泌体的分离和纯化步骤：以300×g离心10分钟，取上清。以2000×g离心10分钟，取上清。10 ,000×g离心30分钟，取上清。100 ,000×g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀PBS重悬后，再次以100 ,000×g离心90分钟。图1为外泌体差速超速离心分离图。差速超离心法是分离外泌体的“金标准”，是利用离心力从300×g到100 ,000×g的多个离心循环来实现的。每离心一步后，除去细胞、细胞碎片、凋亡小体等微丸，收集上清进行离心。在最后离心后,即除去上清，收集外泌体含球团和污染蛋白，离心在4℃下进行。

四 .胃癌细胞系MKN-45来源的外泌体的特异性富集，虽然CD63、CD9、CD81和TSG101等常用于检测外泌体，但却并不具有肿瘤特异性，因而造成肿瘤基因诊断的敏感性和特异性低。除了高速离心分离外泌体外，免疫磁珠筛选也是外泌体分离的主要方法，肿瘤来源和非肿瘤来源的外泌体可以通过肿瘤外泌体表面的特异性分子标志物来区分。胃癌细胞系来源的外泌体进行免疫捕获主要依赖于外泌体表面特异的分子标志物，目的是保证胃癌来源的外泌体不被外周血来源外泌体所稀释，提高胃癌早筛和诊断的敏感性和特异性。分子标志物组合CXCR4、CEA、Claudin 18.2为基础组合pannel，以抗原抗体相互结合原理，生产CXCR4、CEA、Claudin 18.2分子的单克隆抗体，以特异性结来自胰腺癌的外泌体。在此基础上设计耦合上述分子组合标志物的外泌体免疫捕获系统，富集胃癌来源的外泌体。经过一定处理可将抗体结合在磁珠上，使磁珠成为抗体的载体。磁珠上的抗体和特异性抗原物质结合后形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁场作用下发生移动，从而使复合物从复杂的，达到分离特异性抗原的目的，这是分离胃癌来源的外泌体的关键技术。

如图2所示，首先将识别外泌体特异性标志物的抗体固定在固体基质上，用抗体偶联的固体基质孵育含外泌体的液体后，可将外泌体富集到此类固体基质上。可以通过额外的洗脱步骤收集游离的外泌体。

五．实时荧光定量PCR技术分析胃癌细胞系外泌体中lncRNA NEAT1的表达。

使用上述方法获得到的外泌体，采用Trizol试剂（美国 Invitrogen公司）从组织样本中提取总RNA。采用NanoDrop2000光度计测定RNA浓度和纯度。采用试剂盒进行逆转录反应，获得cDNA。在2720型热循环PCR系统中使用SYBR GREEN MIX试剂盒对CDNA产物进行扩增。LNCRNA NEAT1上游引物：5’-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3’，下游引物：5’-CCTCATCCCTCCCAGTACC-3’；内参GAPDH上游引物：5’- GCAACTAGGATGGTGTGGCT -3’，下游引物：5’-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA -3’。PCR扩增条件包括以下三个步骤：第一步95.0℃2min；第二步 95.0 ℃15s，58℃40s（共40个循环）；第三步（分离阶段），95.0 ℃ 15s，60.0 ℃15s，95.0 ℃ 15s自动记录NEAT1和GAPDH。用２－ΔΔCt表示lncRNA NEAT1的相对表达量。实验重复3次。

Q-PCR实验原始数据见图1和图2。图3是 实验组（MKN-45胃癌细胞外泌体）和对照组（正常人外周血外泌体）lncRNA NEAT1的相对表达量

本发明以分子标志物CXCR4、CEA、Claudin 18.2为基础组合，设计耦合上述分子组合标志物的外泌体免疫捕获系统，能够高效得富集胃癌来源的外泌体。并利用实时荧光定量PCR检测lncRNA NEAT1，通过分析该基因的表达量来对早期胃癌患者进行辅助性诊断及病情进展预报，为后续胃癌的治疗有重大意义。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所做的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。