丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157的联合定量检测方法

摘要

本发明公开了丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157的联合定量检测方法。本发明所要保护的免疫层析芯片包含结合垫和分析膜；所述结合垫上含有被生物标记物标记的抗A抗体1、抗B抗体1、抗C抗体1和质控物；所述分析膜上含有A检测点、B检测点、C检测点和质控检测点，所述A、B和C检测点上分别固定有抗A抗体2、抗B抗体2和抗C抗体2；所述A检测点、B检测点、C检测点和所述质控检测点这四个点的中心的连线是直线，该连线与待测样品前进的方向平行，即纵向分布。该芯片能够实现对丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157三种病原菌的同时定量检测，灵敏度高，在多重检测中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫技术诊断领域，具体涉及丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157的联合定量检测方法。

背景技术

大肠杆菌O157(Escherichia coli O157:H7)能引起的感染性腹泻，现被世界卫生组织确定为新发现的28种传染病病原体之一。乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphiB)和丙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi C)可引起肠热症，病原菌随污染的食物进入消化道，穿透肠黏膜上皮细胞继而被巨噬细胞吞噬并在其内生长繁殖，经肠系膜淋巴结和胸导管进入血流可引起菌血症，后经血流进入各脏器器官并再次入血造成第二次菌血症，全身中毒症状严重。病人粪便为重要的传染源。大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠埃希氏菌的典型菌株，对人的致病力较强，感染剂量较低，每克感染载体含菌10个以上即可引起感染，人类感染后有2％～10％的死亡率。三种病原菌均为食源性致病菌，可通过食品或饮水传播。由于感染剂量低和病程发展迅速，敏感特异的多重检测方法是确保饮水和食品安全、预防细菌感染发生和传染病防控的重要手段。

食品中不允许检出病原菌，而当食品中含有的病原菌较少时比较难以检测。常规食品检验中，都规定将食品样品置于培养基中进行培养实现增菌，然后进行检测。乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157在培养基中的增殖速度比较快，一般8个小时增殖后即可达到10

多重检测能够同时分析一个样本中的多种指标，从而判断是否存在多种感染，提高检测的准确性，并能够有效的节约样本量和时间成本从而减轻病人的痛苦。通过集成化的酶联免疫分析平台实现多重检测，成本较高且较耗时，主要应用于医院的检验科和疾病预防控制中心。现场快速检测依赖于即时检测技术(point-of-care testing,POCT)，目前POCT技术正朝着多重和智能方向发展。多重免疫POCT检测方法主要分别基于纸层析、芯片、磁珠、微流控和免疫层析等方法。其中免疫层析是目前最流行的检测技术，因此多重免疫层析方法将会是最实用的POCT方法。

目前免疫层析多重检测的主要形式包括单靶标试纸以平面或立体方式组合、分析膜上喷多条检测带等方式实现。单靶标试纸在同一平面上进行组合的为十通道UPT-POCT免疫层析试纸，其原理是将十个单靶标试纸的样品垫联合共用一个加样孔，样品加入后会分配给各个项目(发明专利：一种基于上转换发光十通道免疫层析的食源性致病菌检测试纸盘，申请号：201010257697.2)；单靶标试纸也能以多面体方式进行组合形成检测装置(发明专利：一种新型多面体多通道高通量层析装置的结构、制备及用途，专利申请号：201611238063.6)。简单将单靶标组合成多重检测方法，其缺点是因各个单靶标试纸成分不同带来阻力不同，使得样品很难被均匀分配。在分析膜上喷多个条带实现多重检测，通常会因为分析膜上的区域有限但每个条带所占体积较大，导致很难实现三个以上条带的排布；三条带的其中一条还要设置为质控带做质控，因此多条带模式的层析试纸一般只能检测2个项目(发明专利：一种霍乱弧菌的检测方法，申请号201010257686.4)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何联合定量检测丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了检测病原A、病原B和/或病原C的免疫层析芯片。所述免疫层析芯片可包含结合垫和分析膜。所述结合垫上可含有被生物标记物标记的抗A抗体1、抗B抗体1、抗C抗体1和质控物。所述分析膜上可含有A检测点、B检测点、C检测点和质控检测点。所述A检测点上可固定有抗A抗体2，所述B检测点上可固定有抗B抗体2，所述C检测点上可固定有抗C抗体2。所述质控检测点上可固定有抗所述质控物的抗体。所述抗A抗体1与所述抗A抗体2可为不同或相同的抗所述病原A的抗体。所述抗B抗体1与所述抗B抗体2可为不同或相同的抗所述病原B的抗体。，所述抗C抗体1与所述抗C抗体2可为不同或相同的抗所述病原C的抗体。所述A检测点、所述B检测点、所述C检测点和所述质控检测点这四个点的中心的连线是直线，该连线与待测样品前进的方向平行。所述病原A、所述病原B和所述病原C是三种不同的病原。

上文所述免疫层析芯片中，所述病原A可为乙型副伤寒沙门菌，所述病原B可为丙型副伤寒沙门菌，所述病原C可为大肠杆菌O157:H7。

上文所述免疫层析芯片中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

上文所述免疫层析芯片中，所述A检测点、B检测点、C检测点和质控检测点均可为圆形检测点。

上文所述免疫层析芯片中，所述生物标记物可为稀土纳米上转发光颗粒。

上文所述免疫层析芯片还可包含样品垫、吸水垫和粘性底衬。

上文所述免疫层析芯片中，所述质控物可为羊IgG。所述抗所述质控物的抗体可为兔抗羊IgG的抗体。

上文所述免疫层析芯片中，所述分析膜上的所述A检测点、所述B检测点、所述C检测点和所述质控检测点的制备过程可包括在所述A检测点点样所述抗A抗体2、在所述B检测点点样所述抗B抗体2、在所述C检测点点样所述抗C抗体2、在所述质控检测点点样所述抗质控物的抗体的过程。

上文所述免疫层析芯片的层析方向可为由所述样品垫到所述结合垫，由所述结合垫到所述分析膜，由所述分析膜到所述吸水垫。

所述样品垫和结合垫可部分重叠，所述重叠部分为样品垫在上方。所述分析膜与结合垫及吸水垫可有重叠，所述重叠部分为分析膜位于结合垫和吸水垫的下方。

所述粘性底衬可为单面涂有压力敏感胶的硬体材质。所述粘性底衬可为PVC板。

所述样品垫为添加液体样品的位置。所述样品垫可为具有较大床体积且微观结构均匀的物质。所述样品垫可为玻璃纤维或聚醋膜。

所述为分析膜可为检测所述生物标记物的信号的位置。所述分析膜可为微观结构均匀的物质。所述分析膜可为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

所述吸水垫可为具有较大床体积的物质。所述吸水垫可为吸水纸或纤维素膜。

上文所述免疫层析芯片中，所述样品垫可为玻璃纤维。所述分析膜可为硝酸纤维素膜。所述吸水垫可为吸水纸。

上文所述的免疫层析芯片中，可通过检测所述免疫层析芯片上的生物标记物的信号值，确定A和/或B和/或C浓度：包括检测所述分析膜上所述A检测点、B检测点、C检测点和质控检测点的生物标记物的信号值得到检测峰，通过计算所述A检测点与所述质控检测点的检测峰面积的比值确定A的浓度，通过计算所述B检测点与所述质控检测点的检测峰面积的比值确定B的浓度，通过计算所述C检测点与所述质控检测点的检测峰面积的比值确定C的浓度。所述A可为乙型副伤寒沙门菌，所述B可为丙型副伤寒沙门菌，所述C可为大肠杆菌O157:H7。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上文所述免疫层析芯片在制备检测乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌和/或大肠杆菌O157产品中的应用。

上文所述应用中，所述产品可为试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了使用上文所述的免疫层析芯片制备的检测乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌和/或大肠杆菌O157的产品。

所述产品可为试剂盒。

本免疫层析芯片选择了乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157作为芯片的靶标，提供一种基于上转发光免疫层析法的丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157联合定量检测的纵向免疫层析芯片。该芯片和单靶标试纸在尺寸和上样体积均相同的情况下，能够实现对三种病原菌的检测。由于乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157在培养基中的增殖速度比较快(一般8个小时增殖后即可达到10

本专利通过纵向点阵制备免疫层析芯片，其尺寸和上样量均和单靶标试纸相同，但是可以检测三个项目，而且可以减少前方检测项目对后面检测项目的干扰。本专利的纵向免疫层析芯片所用的生物标志物为稀土纳米上转发光颗粒(UCP颗粒)，因为颗粒独特的上转发光的特性，能够实现灵敏、特异和稳定的检测。

该芯片克服了传统多重免疫层析检测中只能分布3个条带检测2个靶标的缺点(即其中一个是质控带)，能够纵向排列4个点，并将检测靶标扩展到3个(即其中一个是质控点)；可对丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157进行快速、准确、定量检测。

附图说明

图1为芯片的结构组成及反应示意图。(A)芯片的结构组成。(B)阴性和阳性反应的结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中所用试剂来源如下：

表面修饰过的UCP颗粒为北京开景基因技术有限公司产品。

抗乙型副伤寒沙门菌抗体1和抗乙型副伤寒沙门菌抗体2的成分相同，均为单抗混合物(17C10+19A6)，包括抗乙型副伤寒沙门菌单抗17C10和19A6。

抗丙型副伤寒沙门菌抗体1为抗丙型副伤寒沙门菌单抗5E2；抗丙型副伤寒沙门菌抗体2为抗丙型副伤寒沙门菌单抗4G11。

抗大肠杆菌O157抗体1为抗大肠杆菌O157单抗6G10；抗大肠杆菌O157抗体2为单抗混合物，包括抗大肠杆菌O157单抗6G10和抗大肠杆菌O157单抗7D9。

以上六种抗体(包括17C10、19A6、5E2、4G11、6G10和7D9)由本实验室制备并保存(相关文献：Zhao Y,Wang H,Zhang P,Sun C,Wang X,Wang X,Yang R,Wang C,Zhou L:Rapid multiplex detection of 10foodborne pathogens with an up-convertingphosphor technology-based 10-channel lateral flow assay.Scientific reports2016,6:21342)。

乙型副伤寒沙门菌来源于中国食品药品检定研究院(货号CMCC(B)50094)，丙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157的由本实验室保存(经16S rDNA鉴定，相关文献：Zhao Y,WangH,Zhang P,Sun C,Wang X,Wang X,Yang R,Wang C,Zhou L:Rapid multiplex detectionof 10foodborne pathogens with an up-converting phosphor technology-based 10-channel lateral flow assay.Scientific reports 2016,6:21342)。

实施例1、应用于丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157的联合定量检测方法

1.上转发光免疫层析芯片制备的方法

1.1芯片的结构组成

1.1.1芯片整体结构：

芯片由样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫依次排布在粘性底衬上(图1)。样品垫和结合垫部分重叠，重叠部分样品垫在上方；分析膜与结合垫及吸水垫有重叠，分析膜位于结合垫和吸水垫的下方。

1.1.2结合垫：

结合垫中含有抗丙型副伤寒沙门菌抗体标记的UCP颗粒(UCP-抗丙型副伤寒抗体1，即UCP-5E2)、抗乙型副伤寒沙门菌抗体标记的UCP颗粒(UCP-抗乙型副伤寒沙门菌抗体1，即UCP-17C10+19A6)、抗大肠杆菌O157抗体标记的UCP颗粒(UCP-抗大肠杆菌O157抗体1，即UCP-6G10)羊IgG标记的UCP颗粒(UCP-羊IgG)。

1.1.3分析膜组成：分析膜上横向(待测样品前进的方向)依次排列有抗乙型副伤寒沙门菌抗体2(17C10+19A6)(固定于A检测点)、抗丙型副伤寒沙门菌抗体2(4G11)(固定于B检测点)、抗大肠杆菌O157抗体2(6G10+7D9)(固定于C检测点)、质控兔抗羊IgG(固定于质控检测点)。

1.2上转发光免疫层析芯片制备的方法

1.2.1结合垫的制备

将表面修饰过的UCP颗粒使用常规标记缓冲液(0.02M磷酸缓冲液)重悬至1mg/mL，放置于恒温振荡器上振荡，加入抗乙型副伤寒沙门菌抗体1(或抗丙型副伤寒沙门菌抗体1，或抗大肠杆菌O157抗体1，或羊IgG)，持续搅拌1h；加入BSA封闭10min，4℃、12000rpm、30min离心获得UCP-抗乙型副伤寒沙门菌抗体1(或UCP-抗丙型副伤寒沙门菌抗体1，或UCP-抗大肠杆菌O157抗体1，或UCP-羊IgG)复合物。将上述四种UCP单抗复合物分别用冻干液(溶液组成为：0.2M磷酸缓冲液，含2％BSA，3％蔗糖)重悬后混匀浇于玻璃纤维(德国默克公司默克密理博公司，货号GFCP203000)上，于-80℃冰箱预冻2h后再放置冻干机内冻干3h，制备成结合垫，置于干燥柜内保存。

1.2.2试纸组装与切割

将吸水纸剪裁为3cm×20cm，作为吸水垫。将玻璃纤维裁剪为宽度为1.5cm×20cm的细长条，并37℃烘干1h，作为样品垫。将样品垫、步骤1.2.1中制备的结合垫、硝酸纤维素膜(分析膜，简称NC膜，德国默克公司默克密理博公司，货号HF09002S25)、吸水垫依次粘贴在底衬(上海金标生物科技有限公司，SM31-40)上，用高速数控斩切机斩切为4mm宽的试纸条，并装配于塑料卡壳中制备为检测试纸条。

1.2.3分析膜上点样

将4mm试纸条置于点样仪上，在硝酸纤维素膜中间位置自样品垫向吸水垫方向(与层析方向平行)依次点样，点样方法为纵向排列成一条直线点喷四个相互分离的圆点，抗乙型副伤寒沙门菌抗体2、抗丙型副伤寒沙门菌抗体2、抗大肠杆菌O157抗体2和兔抗羊IgG依次各点样40nL，分别得到检测点A(T1)、检测点A(T2)和检测点A(T3)和质控检测点(C)。这四个点的中心的连线是一条直线，该连线与待测样品前进的方向(层析方向)平行，且位于分析膜中间位置(图1)。这四个点均为直径为1mm的圆形。

点样后将4mm宽的试纸条置于电热恒温鼓风干燥箱内37℃干燥1h即得到用于丙型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157的联合定量检测的上转发光免疫层析芯片。

采用双抗体夹心方式建立能够对乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、大肠杆菌O157进行快速联合定量检测的上转发光免疫层析方法的检测原理为：

(1)阳性样品：样品在加入后，在虹吸作用下向前涌动，阳性样品中的乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、大肠杆菌O157，首先与结合垫中的UCP-抗乙型副伤寒沙门菌抗体1、UCP-抗丙型副伤寒沙门菌抗体1、UCP-抗大肠杆菌O157抗体1相结合，形成UCP-抗乙型副伤寒沙门菌抗体1-乙型副伤寒沙门菌复合物和/或UCP-抗丙型副伤寒沙门菌抗体1-丙型副伤寒沙门菌复合物和/或UCP-抗大肠杆菌O157抗体1-大肠杆菌O157复合物。

该复合物和四种游离的UCP颗粒结合的抗体1(UCP-抗乙型副伤寒沙门菌抗体1、UCP-抗丙型副伤寒沙门菌抗体1、UCP-抗大肠杆菌O157抗体1、UCP-羊IgG)继续向前层析到达分析膜，在分析膜上的T1位置形成固相-抗乙型副伤寒沙门菌抗体2-乙型副伤寒沙门菌-抗乙型副伤寒沙门菌抗体1新复合物、T2位置形成固相-抗丙型副伤寒沙门菌抗体2-丙型副伤寒沙门菌-抗丙型副伤寒沙门菌抗体1新复合物、T3位置形成固相-抗大肠杆菌O157抗体2-大肠杆菌O157-抗大肠杆菌O157抗体1新复合物，质控位置C捕获游离UCP-羊IgG形成固相兔抗羊-羊IgG-UCP复合物。

(2)阴性样品：样品和UCP-抗乙型副伤寒沙门菌抗体1、UCP-抗丙型副伤寒沙门菌抗体1、UCP-抗大肠杆菌O157抗体1、UCP-羊IgG一起进入分析膜，只在质控点C上形成固相兔抗羊-羊IgG-UCP复合物。

因此，在此模式中，阳性样品在检测点(T1、T2和/或T3)与质控点(C)上都有特异性的信号峰出现，而阴性样品只在质控点(C)上有特异的信号峰。

2.利用芯片进行检测的方法和结果

2.1检测方法

将乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157，分别使用样品处理液(溶液组成为：0.2M磷酸缓冲液，含1％Tween20)进行10倍稀释，分别得到三种病原菌0、10

2.2乙型副伤寒沙门菌检测结果

根据经验或算法，设定检测T1/C的cutoff值为0.200，高于该cutoff值的第一个阳性浓度(10

本发明制备的检测芯片对乙型副伤寒沙门菌的检测灵敏度为10

表1.芯片对乙型副伤寒沙门菌的检测结果

2.3丙型副伤寒沙门菌检测结果

设定T2/C的cutoff值为0.100，因此芯片对丙型副伤寒沙门菌的检测灵敏度为10

表2.芯片对丙型副伤寒沙门菌的检测结果

2.3大肠杆菌O157检测结果

设定T3/C的cutoff值为0.060，因此芯片对大肠杆菌O157的检测灵敏度为10

表3.芯片对大肠杆菌O157的检测结果

实施例2、三种靶标中的双靶标联合检测尝试

在制备本发明是实例1中的乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌和大肠杆菌O157的三靶标联合定量检测芯片之前，首先进行了三种靶标中的两种靶标(乙型副伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌)联合检测试验。

1.单靶标的分析膜与合并结合垫配伍检测双靶标

上转发光免疫层析芯片的结构组成和芯片的制备方法同实施例1。其中，分析膜为使用两种靶标各自的单靶标分析膜，配伍了两种靶标合并后的结合垫(即UCP-17C10+19A6和UCP-5E2的混合物以及UCP-羊IgG制备结合垫)，观察混合标记物对检测的影响(表4)。这两种试纸检测靶标菌的灵敏度分别约为10

其中分析膜包括两种靶标各自的单靶标分析膜：乙型副伤寒沙门菌单靶标检测试纸的分析膜的C带和T带分别是羊抗鼠和4G11；丙型副伤寒沙门菌单靶标检测试纸的分析膜的C带和T带分别是羊抗鼠和17C10+19A6。

表4.芯片研制过程中各项目是否相互影响的测试

2.双靶标联合定量检测芯片构建初探

乙型副伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌双靶标联合检测上转发光免疫层析芯片的结构组成和芯片的制备方法同实施例1。其中，分析膜的T1、T2和质控点分别为17C10+19A6，4G11和兔抗羊IgG，结合垫为UCP-17C10+19A6，UCP-5E2和UCP-羊IgG的混合物(表5)。

结果表明，检测靶标菌的灵敏度分别约为10

表5.乙型副伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌双靶标检测试剂检测结果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。