一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法

摘要

本发明公开了一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法，包括以下步骤：以地方优质白羽鸡为母本，罗曼白羽蛋鸡为父本杂交，在F1代中选留白羽自交，提取F2代基因组DNA，PCR扩增，测序，选留SNP位点基因型为TT型的个体进行横交和扩繁，经过3个世代以上的选育，得到遗传性状稳定的地方优质白羽鸡高产蛋品系。通过位于鸡5号染色体的ESRβ基因的与产蛋性状相连锁的SNP标记位点(E5：g.53215082)，并将该标记应用于鸡产蛋性状的选育，快速判断出该位点基因型，提高地方优质白羽鸡的产蛋性状，进而加快该品种遗传改良进度，该育种方法可以有效快速推进贵州地方鸡高产量等新品系的育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于家禽分子育种技术领域，尤其涉及一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法。

背景技术

家禽不同品种间杂交主要是利用基因的非加性效应，产生杂种优势。随着我国畜禽改良工作的深入，杂种优势已经在畜禽生产上有了大规模应用。在地方鸡的杂交改良中，借助外来鸡生长快、产蛋量高等特点，开展杂种优势利用，可有效提高地方鸡资源利用价值，杂交后代在43周龄产蛋量、开产蛋重等传统杂交优势指标均有不同程度的提高。

鸡5号染色体上的ESRβ基因，属于甾体激素核酸受体，具有促进生殖器官发育成熟，促进雌性副性征的出现，维持性行为等功能。通过有效挖掘ESRβ基因上与产蛋等性状相关的单核苷酸多态性(SNP)标记，并将相关标记用于杂交后代选择来实现产蛋量等繁殖性状的早期选择。该方法可使目标性状基因纯合进展加快，在避免商品代出现性状分离的同时，更快更高效的选育出目标性状优良的鸡品种新品系。专利申请公开了CN201510756381.0公开了一个鸡翻毛性状相关的分子标记及其应用，在E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群(genbank序列号AADN03009152.1)第56648位碱基处有一个A56648-G56648的碱基替换，该替换引起SNP多态性，通过采用检测引物在该位点碱基替换情况来作鸡标记辅助选择关联分析，判断鸡翻毛性状。但是该方案并不能用于培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法。

兴义矮脚鸡白羽系为代表的贵州地方鸡白羽系是从以兴义矮脚鸡为代表的贵州地方鸡选育出的一种节粮型蛋肉兼用型鸡，一般作为地方鸡配套系母本使用，其典型特征为隐性白羽，体型适中，遗传性能稳定，但产蛋性能不突出，导致制种成本较高。关于地方优质白羽鸡高产蛋品系培育公开的文献有一些，但是，现有技术中还没有利用SNP标记辅助选育的相关技术公开，且选育方法比较繁琐，选育所需时间比较长，大大提高了选育成本。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法。本发明通过实验鉴定了与以兴义矮脚鸡白羽系为代表的贵州地方鸡白羽系产蛋性状连锁相关的1个SNP标记，并将该标记应用于相关地方鸡产蛋性状的选育，具有良好育种效果。本发明首次得到与优质地方白羽鸡产蛋性状相关的SNP位点，具体是鸡5号染色体的ESRβ基因上的E5：g.53215082位点C/T突变，包括检测该突变位点的引物，利用引物检测该位点的基因型，即可在生长早期选留该位点的优势表型基因型TT的个体，加快产蛋性能优秀的新品系选育进度，为地方鸡选育提供了一种新途径。该方法可以有效快速推进贵州地方鸡高产蛋等新品系的育种进程。

为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：

用于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的引物对，其特征在于：所述引物对是用于鸡5号染色体的ESRβ基因与产蛋性状相关的SNP标记位点的PCR扩增，该引物对的核苷酸序列为：P-F 5’-ACTTTTCCCCTTCTCCCC-3’，P-R 5’-ACTGCACATTTACAGTGCTATGT-3’。

进一步地，一种含有权利要求1引物对(即P-F 5’-ACTTTTCCCCTTCTCCCC-3’，P-R5’-ACTGCACATTTACAGTGCTATGT-3)的试剂盒也属于本发明的保护范围之内。

进一步地，一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法，包括以下步骤：

(1)以地方优质鸡白羽系为育种素材，组建基础育种群；

(2)以步骤(1)育种群的地方优质白羽鸡为母本，以罗曼白羽蛋鸡为父本进行杂交，在F1代中选留白羽后代；

(3)选用步骤(2)选留的白羽F1代自交，得到F2代；

(4)提取步骤(3)的F2代鸡基因组DNA，借助权利要求1的引物对或权利要求2的试剂盒对DNA进行PCR扩增反应，采用直接测序法对扩增得到的PCR产物进行测序获得F2代5号染色体的ESRβ基因与产蛋性状相关的SNP标记位点，然后对SNP位点进行基因分型分析，选留基因型为TT型的个体，剔除CC、CT基因型个体；

(5)按照家系选择法对步骤(4)得到的TT型个体进行横交和扩繁，经过3个世代以上的选育，得到遗传性状稳定的地方优质白羽鸡高产蛋品系。

进一步地，在步骤(1)，所述地方优质白羽鸡为兴义矮脚鸡白羽系、黔东南小香鸡白羽系及以上两种白羽鸡为父本或母本培育的白羽鸡品种品系。

进一步地，在步骤(4)，基因组DNA提取是通过翅静脉采血方式对所有试验鸡采血，使用蛋白酶K法提取血液DNA，-20℃保存备用。

进一步地，在步骤(4)，每10μL的PCR扩增体系含有：Primer Mix 5μL，SterilizedddH

进一步地，在步骤(4)，所述PCR反应体系为：94℃预变性10min，30个循环(94℃变性45s，54℃退火40s，72℃延伸50s)，72℃延伸8min，4℃保存。

进一步地，在步骤(4)，所述SNP标记位点是鸡5号染色体的ESRβ基因上的E5：g.53215082。用于检测SNP标记位点的引物对的核苷酸序列如权利要求1所示。

进一步地，在步骤(4)，SNP标记位点基因分型有TT型、CC型、CT型，通过检测分析，确定F2代ESRβ基因E5：g.53215082位点的TT基因型个体产蛋量较高，因此选留SNP标记位点基因型为TT型的个体，剔除CC、CT基因型个体。

进一步地，在步骤(4)，直接测序法是利用DNAstar软件中的MegAlign和Editseq程序结合测序峰图进行序列比对并拼接得到F2代鸡ESRβ基因CDS区的序列，与GenBank已上传的鸡ESRβ基因序列比对鉴定单核苷酸突变位点，然后用Excel和Word软件对数据进行统计、归类，运用SPSS软件进行方差分析，运用SeqMan分析测序峰图，利用MWSnap.3软件中的标尺测量各SNPs等位基因的相应峰高，按照崔建勋(2005)的方法估算等位基因频率，再运用DNAstar软件对ESRβ基因SNP位点(E5：g.53215082)与产蛋性状的关联性分析。

进一步地，一种鸡5号染色体上ESRβ基因SNP位点(E5：g.53215082)在鸡辅助育种中的应用，其特征在于：利用鸡5号染色体上ESRβ基因SNP位点(E5：g.53215082)辅助选育地方优质白羽鸡高产蛋品系。

由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种通过分子鉴定与产蛋性状相关的SNP标记，获得提升兴义矮脚鸡白羽系等优质地方白羽鸡产蛋性状的改良方法。

(2)本发明通过连锁不平衡分析等方法获得鸡ESRβ基因第5外显子上与产蛋量相关的SNP标记(E5：g.53215082)，应用于兴义矮脚鸡白羽系等优质地方白羽鸡后代的改良选育。当该位点表现为TT基因型，表明经选育后的后代个体产蛋性能具有显著提高。

(3)本发明首次得到与优质地方白羽鸡产蛋性状相关的SNP位点，具体是鸡5号染色体的ESRβ基因上的E5：g.53215082位点C/T突变，包括检测该突变位点的引物，利用引物检测该位点的基因型，即可在生长早期选留该位点的优势表型基因型TT的个体，加快产蛋性能优秀的新品系选育进度，为地方鸡选育提供了一种新途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1为本申请基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的技术路线图；

图2为本申请SNP标记位点(E5：g.53215082)基因分型CC型图；

图3为本申请SNP标记位点(E5：g.53215082)基因分型CT型图；

图4为本申请SNP标记位点(E5：g.53215082)基因分型有TT型图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

如图1所示，一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法，以兴义矮脚鸡白羽系地方优质鸡为例，包括以下步骤：

(1)以兴义优质矮脚鸡白羽系为育种素材，组建基础育种群；

(2)以步骤(1)育种群的地方优质白羽鸡为母本，以罗曼白羽蛋鸡为父本进行杂交，在F1代中选留白羽后代；

(3)选用步骤(2)选留的白羽F1代自交，选留F2代公母鸡；选取同批次孵化的兴义矮脚鸡白羽系、F2代各500只，进行生长性能及产蛋性状观察，该过程中自由采食饮水，日粮水平参考NY/T 5043蛋鸡饲养管理准则；

(4)通过翅静脉采血方式对上述F2代公母鸡采血，使用蛋白酶K法提取血液DNA，-20℃保存备用；

对备用的DNA样品进行PCR扩增：SNP标记(E5：g.53215082)的引物对核苷酸序列为：P-F 5’-ACTTTTCCCCTTCTCCCC-3’，P-R 5’-ACTGCACATTTACAGTGCTATGT-3’；PCR扩增体系(10μL)为：Primer Mix5μL，Sterilized ddH2O 3.4μL，P-F 0.3μL，P-R 0.3μL，DNA模板1μL；反应体系为：94℃预变性10min，30个循环(94℃变性45s，54℃退火40s，72℃延伸50s)，72℃延伸8min，4℃保存；

(5)对所有扩增得到的PCR产物送往上海生工生物有限公司进行测序，然后利用DNAstar软件中的MegAlign和Editseq程序结合测序峰图进行序列比对并拼接得到待测鸡ESRβ基因CDS区的序列，与GenBank已上传的鸡ESRβ基因序列比对鉴定单核苷酸突变位点；

然后采用Excel对F2代、兴义矮脚鸡白羽系的记录试验数据进行显著性检验，并运用SPSS软件进行方差分析，结果统计如下表1和表2所示；用Excel和Word软件对数据进行归类，统计ESRβ基因型个数，用SPSS多因素分析不同基因型与开产性状和43周龄产蛋性状之间的关联性，运用SeqMan分析测序峰图，利用MWSnap.3软件中的标尺测量各SNPs等位基因的相应峰高，按照崔建勋(2005)的方法估算等位基因频率；根据fi＝hi/(h1+h2)(i＝1，2)(式中，fi表示SNP位点某等位基因频率，h1与h2分别表示测序峰图上该等位基因1、2峰的高度)估算等位基因频率；运用DNAstar等软件分析结果显示在ESRβ基因第5外显子只筛查到1个SNP位点：g.53215082C>T，实验群体遗传参数分析和ESRβ基因SNP位点与产蛋性状的关联性分析分别如表3、表4所示；

(6)按照上述方法，确定F2代ESRβ基因E5：g.53215082位点的TT基因型个体产蛋量显著高于其他基因型及对照组兴义矮脚鸡白羽系，说明TT基因型对鸡产蛋性状为优势基因型，有利于提高地方优质白羽鸡的产蛋性状，同时加快新品系的育种进度，因此选留SNP位点基因型为TT型的个体，剔除CC、CT基因型个体；

(7)按照家系选择法对上述得到的TT型个体进行横交和扩繁，经过3个世代以上的选育，得到遗传性状稳定的地方优质白羽鸡高产蛋品系。

表1兴义矮脚鸡白羽系、F2代母鸡产蛋性能分析

注：同列数据肩标大写字母不同为差异极显著(P<0.01)，小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

由表1实验数据显示，F2代在开产日龄、开产蛋重和43周龄产蛋个数均显著大于兴义矮脚鸡白羽品系，F2代哈氏单位与兴义矮脚鸡白羽品系差异极显著，蛋重和产蛋数符合产蛋期蛋重的变化规律。

表2 F2代、兴义矮脚鸡白羽品系蛋品质对比分析

注：同列数据肩标大写字母不同为差异极显著(P<0.01)，小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

由表2显示，兴义矮脚鸡白羽品系、F2代鸡蛋重适宜，分别为49.71±3.76、51.24±4.81，蛋壳强度分别为41.94±7.93、50.60±8.73，说明F2代相比兴义矮脚鸡白羽系具有较高的强度，有利于规模化、工业化、集约化的生产模式。

表3实验群体遗传参数分析

由表3可知，ESRβ基因在F2代筛查出的g.53215082C>T SNP位点检测到了野生纯合型、杂合型和突变纯合型三种基因型，优势等位基因为C，优势等位基因频率0.73，纯合度0.61，属于中度多态，可提供一定遗传信息，X2检验及P值显示该突变位点基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡。

表4ESRβ基因SNP位点与产蛋性状的关联性分析

注：同列数据肩标小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

由表4可知，ESRβ基因在F2代筛查出的g.53215082C>T SNP位点，各基因型与开产天数、开产体重、开产蛋重及43周龄产蛋量的关联性为：g.53215082C>T位点只有43周龄产蛋量一个产蛋性状差异显著(P<0.05)，TT基因型个体43周龄产蛋量与CT型个体和CC型个体差异均显著(P<0.05)，CT型个体和CC型个体差异不显著，TT型最高，CT型最低。且TT基因型个体43周龄产蛋量显著高于对照组兴义矮脚鸡白羽系。

实施例2

如图1所示，一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法，以黔东南小香鸡白羽系地方优质鸡为例，包括以下步骤：

(1)以黔东南小香鸡白羽系为育种素材，组建基础育种群；

(2)以步骤(1)育种群的地方优质白羽鸡为母本，以罗曼白羽蛋鸡为父本进行杂交，在F1代中选留白羽后代；

(3)选用步骤(2)选留的白羽F1代自交，选留F2代公母鸡；选取同批次孵化的黔东南小香鸡白羽系、F2代各500只，进行生长性能及产蛋性状观察，该过程中自由采食饮水，日粮水平参考NY/T 5043蛋鸡饲养管理准则；

(4)通过翅静脉采血方式对上述F2代公母鸡采血，使用蛋白酶K法提取血液DNA，-20℃保存备用；

对备用的DNA样品进行PCR扩增：SNP标记(E5：g.53215082)的引物对核苷酸序列为：P-F 5’-ACTTTTCCCCTTCTCCCC-3’，P-R 5’-ACTGCACATTTACAGTGCTATGT-3’；PCR扩增体系(10μL)为：Primer Mix5μL，Sterilized ddH2O 3.4μL，P-F 0.3μL，P-R 0.3μL，DNA模板1μL；反应体系为：94℃预变性10min，30个循环(94℃变性45s，54℃退火40s，72℃延伸50s)，72℃延伸8min，4℃保存；

(5)对所有扩增得到的PCR产物对ESRβ基因第5外显子进行SNP位点筛查，结果显示只筛查到1个SNP位点：g.53215082C>T；ESRβ基因SNP位点与产蛋性状的关联性分析分别如表5所示。

(6)按照上述方法，确定F2代ESRβ基因E5：g.53215082位点的TT基因型个体产蛋量显著高于其他基因型及对照组黔东南小香鸡白羽系，说明TT基因型对鸡产蛋性状为优势基因型，有利于提高地方优质白羽鸡的产蛋性状，同时加快新品系的育种进度，因此选留SNP位点基因型为TT型的个体，剔除CC、CT基因型个体；

(7)按照开产体重(g)家系选择法对上述得到的TT型个体进行横交和扩繁，经过3个世代以上的选育，得到遗传性状稳定的地方优质白羽鸡高产蛋品系。

表5 ESRβ基因SNP位点与产蛋性状的关联性分析

注：同列数据肩标小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

由表5实验数据显示可知，ESRβ基因在F2代筛查出的g.53215082C>T的SNP位点，各基因型与开产天数、开产体重、开产蛋重及43周龄产蛋量的关联性为：g.53215082C>T位点只有43周龄产蛋量一个产蛋性状差异显著(P<0.05)，TT基因型个体的开产天数、开产体重、开产蛋重等指标均有不同程度的提高，但与其他基因型差异不显著。同时，TT基因型个体43周龄产蛋量与CT型个体和CC型个体差异均显著(P<0.05)，CT型个体和CC型个体差异不显著，TT型最高，CT型最低，TT基因型个体43周龄产蛋量显著高于对照组黔东南小香鸡白羽系。

综上所述，本发明首次得到与优质地方白羽鸡产蛋性状相关的SNP位点，具体是鸡5号染色体的ESRβ基因上的E5：g.53215082位点C/T突变，包括检测该突变位点的引物，利用引物检测该位点的基因型，即可在生长早期选留该位点的优势表型基因型TT的个体，加快产蛋性能优秀的新品系选育进度，为地方鸡选育提供了一种新途径。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种基于SNP位点辅助培育地方优质白羽鸡高产蛋品系的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

acttttcccc ttctcccc 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

actgcacatt tacagtgcta tgt 23