一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法

摘要

本发明提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法，属于动物分子遗传学领域。试剂盒利用1对线粒体COI序列特异性引物对鱼类样本进行PCR扩增反应，反应后发现PCR扩增条带在圆口铜鱼和铜鱼之间存在具有较大差异，通过凝胶电泳显示可以直接鉴定出圆口铜鱼和铜鱼。本发明在鲤科铜鱼属的两种鱼类中设计1对引物进行PCR扩增、凝胶电泳显示直接进行分析鉴定，具有实验准确，鉴定可靠快捷，操作简便等优点。利用本方法可以快速鉴别圆口铜鱼和铜鱼两个物种，对圆口铜鱼规模化放流的种质鉴定提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法，属于动物分子遗传学领域。

背景技术

圆口铜鱼(Coreiμs guichenoti)隶属鲤形目(Cypriniformes)、鮈亚科(Gobioninae)、铜鱼属(Coreius)，主要分布在长江上游水域，是当地重要的经济鱼类和主要捕捞对象，也是长江上游珍稀特有鱼类保护区的指标性物种。近年来，随着长江上游水电站的大力开发和过度捕捞对生态环境的影响，圆口铜鱼产卵场遭到破坏、洄游通道被阻断，其种群资源量急剧下降，物种生存面临巨大威胁，2016年被列入极危(CR)等级。因此，加强圆口铜鱼种群资源保护和恢复工作已极为迫切。目前，增殖放流被认为是圆口铜鱼资源保护和生态修复的主要途径之一。

为了保证放流的生态安全性，必须严格控制放流种类和来源。放流苗种原则上要以本地原种和子一代苗种为主，不得向天然水域中投放杂交种、转基因种及种质不纯等不符合生态安全要求的物种。为保证放流圆口铜鱼的种质纯正性和遗传质量，有必要对放流苗种进行鉴定。鲤科铜鱼属共三种鱼类，分别为圆口铜鱼(Coreius guichenoti)、铜鱼(Coreius heterodon)和北方铜鱼(Coreius septentrionalis),其中北方铜鱼为黄河流域特有鱼类，仅分布于黄河水系，故长江流域圆口铜鱼放流主要干扰种类为铜鱼，圆口铜鱼和铜鱼在早期发育阶段形态特征相似，仅从形态上难以进行鉴别，因此需要一种从基因组的特异性出发的快速鉴定方法。

细胞色素C氧化酶亚基I(COI)位于线粒体基因组上，是线粒体基因组的13个编码蛋白质的基因中分子量最大，功能结构域最为保守的基因。同时COI基因由于其氨基酸的演化速率较慢可以区分分异时间较远的种类，同属物种的COI基因序列又存在有足够的变异，能够区分亲缘关系很近的种类，所以COI基因被广泛用于不同分类阶元层次上的分子系统学研究。不仅如此，COI基因在保证足够变异的同时很容易被通用引物扩增，能够获得绝大多数动物的5’端序列，其序列又很少有插入或缺失发生，因而COI基因被选为DNA分类的标记基因；同时在利用PCR技术进行物种鉴定中应用前景十分广阔。因此COI基因可以用来鉴定圆口铜鱼和铜鱼。

发明内容

鉴于上述问题，本发明提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法，该引物对、试剂盒及鉴定方法可以快速从分子层面鉴定圆口铜鱼和铜鱼，且方法简单易操作，准确度高。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，该COI引物对由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成。

本发明还提供了该COI引物对在制备鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒，包括上述的COI引物对，TaqDNA聚合酶，10×PCR Buffer，dNTP，MgCl

本发明还提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的试剂盒对DNA模板进行扩增。

(3)根据步骤(2)中的扩增结果进行判定：若扩增出两个条带，则DNA模板来源于圆口铜鱼；若扩增出一个明亮条带，则DNA模板来源于铜鱼。

优选地，扩增体系如下：

优选地，DNA模板的浓度为100-500ng/μL。

优选地，前引物或后引物在扩增体系中的浓度为100-1000pmol/μL。

优选地，扩增程序为：93-95℃预变性3-5min；93-95℃变性25-35s，55-60℃退火30-50s，72℃延伸30-60s，30-40个循环；72℃延伸5-10min；4℃保存。

优选地，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度58℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

有益效果

1.以线粒体COI基因为模板进行引物的设计，可以鉴定亲缘关系很近的圆口铜鱼和铜鱼，且准确率达到了100％。

2.本发明的试剂盒可以快速简单的完成鉴定工作，不需要测序即可简单的鉴定圆口铜鱼和铜鱼，具有快速使用、操作简单等优点；适用于放流等种质鉴定和与渔政执法以及非法贸易等市场监管。

附图说明

图1为圆口铜鱼和铜鱼线粒体COI序列比对图。

图2为线粒体COI的6对引物在圆口铜鱼和铜鱼DNA中的扩增片段的凝胶电泳图。其中M：DL1000 Marker；NC：阴性对照，编号1-6为圆口铜鱼样本，编号7-12为铜鱼样本。

图3为引物Cg1-F，Cg1-R在圆口铜鱼和铜鱼中的扩增片段的凝胶电泳图。其中编号1-10为圆口铜鱼样本，编号11-20为铜鱼样本，其余标注同图2。

图4为引物Cg1-F，Cg1-R在圆口铜鱼和铜鱼随机混合样本中的扩增片段的凝胶电泳图。其中编号1-16为随机的圆口铜鱼和铜鱼样本，其余标注同图2。

具体实施例方式

下面结合附图与实施例对本发明进行详细阐述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明。

实施例1 DNA样本提取

圆口铜鱼和铜鱼的基因组DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒(DP304)，具体操作步骤如下：

(1)分别取圆口铜鱼和铜鱼鳍条组织0.5g，置于碾钵中，，放入2mL的灭菌离心管中，加入1×TE无菌缓冲液，4℃浸泡12h；

(2)取出鳍条组织，放入含有352μL的无菌抽提缓冲液中，轻轻混匀，加入40μL20％SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶K(终浓度为400μg/mL)，混匀；

(3)56℃孵育4h，每隔半小时轻轻摇晃离心管以利于消化。若组织不易消化，可延长孵育时间至8h，或37℃消化过夜；

(4)待组织消化完全，取出离心管，加入300μL 6M NaCI溶液，立刻剧烈震动30s；

(5)12000rpm离心10min；弃沉淀，将上清液倒入新的离心管中，再以同等条件离心一次，取上清液，加入等体积的预冷异丙醇，20℃放置1h以上；

(6)4℃，12000rpm离心15min；

(7)弃上清液，沉淀用70％乙醇溶液洗涤一次，37℃烘干或自然晾干；加入50μL灭菌的ddH

实施例2引物对的筛选

(1)序列分析：在NCBI网站上下载圆口铜鱼和铜鱼的线粒体COI基因序列，圆口铜鱼的COI序列为SEQ ID NO:13，铜鱼的COI序列为SEQ ID NO:14，并将序列提交至MegAlign软件进行序列比对，分析序列差异并找出差异位点，分析结果(图1)显示，圆口铜鱼和铜鱼COI序列相似性约为90％，多个位点存在碱基差异，理论上能够设计各自的特异性引物进行区分鉴定。

(2)引物设计：针对步骤(1)分析出来的差异位点，将序列提交至Primer6软件上设计引物，引物序列见表1。然后将引物序列提供至苏州金唯智生物科技有限公司进行引物的合成。

表1 基于圆口铜鱼和铜鱼的线粒体COI基因序列的特异性引物

(3)PCR扩增：分别用步骤(2)中的6对引物对实施例1得到的圆口铜鱼和铜鱼的DNA样本进行PCR扩增，其中扩增所使用的酶为Taq DNA聚合酶。

PCR扩增体系见表2，扩增程序见表3。

表2 PCR扩增体系

表3 PCR扩增程序

(4)凝胶电泳：将步骤(3)得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V电泳15min，结果见图2。

如图2所示，利用上述6对引物进行扩增，电泳条带有显著有无差异，其中第一对引物Cg1-F，Cg1-R扩增在圆口铜鱼中有两个条带，在铜鱼中有一个明亮的条带，且条带约为700bp，说明这对引物可以对圆口铜鱼和铜鱼进行鉴定；第2、3、4、5、6对引物扩增中圆口铜鱼和铜鱼条带大小虽然与设计的大小一致，但是在两个鱼类样本中的条带无明显差异，说明其不能对圆口铜鱼和铜鱼进行鉴定。因此可以通过Cg1-F，Cg1-R引物对扩增条带可以区分圆口铜鱼和铜鱼。

实施例3 Cg1-F，Cg1-R功能的鉴定

对实施例2筛选出来的Cg1-F，Cg1-R引物对进行进一步验证，引物的序列为SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2。

分别随机提取10尾圆口铜鱼和铜鱼基因组DNA，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系及程序同表2和表3。

如图3所示，Cg1-F，Cg1-R引物对在圆口铜鱼DNA模板上扩增出两个条带，在铜鱼DNA模板上扩增出一个明亮条带，且条带大小约为700bp，其结果和实施例2结果一致，说明Cg1-F，Cg1-R引物对能够用于鉴定圆口铜鱼和铜鱼。

实施例4鱼苗的鉴定

随机选取圆口铜鱼和铜鱼混合幼苗共16尾，利用Cg1-F，Cg1-R引物进行扩增鉴定。

对16尾待检鱼苗进行基因组DNA的提取，DNA提取的方法、步骤同实施例1，然后利用实施例3和实施例4确定的引物对Cg1-F，Cg1-R进行PCR扩增，鉴定鱼苗的种类，PCR扩增的体系及程序同表2和表3，分别设置圆口铜鱼和铜鱼的标准样作为阳性对照，以ddH

结果分析，如图4所示，编号3，4，7，9，10，12，13，15的随机个体的电泳条带显示为亮度较暗的两条带，与圆口铜鱼标准样的条带一致，表明其为圆口铜鱼。而编号1，2，5，6，8，11，14，16的随机个体样本为明亮的单条带，与铜鱼阳性对照一致，表明其为铜鱼。

序 列 表

<110> 中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所

<120> 一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法

<130> 2022

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtttaccca ccacttgc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaatccgagg gctcatag 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aatgccacga cgatactctg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgaatgctgg tcctcaaa 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctagcaggtg tctcatcaa 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attccgacgg taaacata 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttgtatttgg tgcctgag 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gattacctgc aagtggtg 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgaacagtta tccaccac 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atacaaatac ggcaccat 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatgaacagt tatccaccac 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccagaagcgt agcaagtc 18

<210> 13

<211> 1548

<212> DNA

<213> Coreius guichenoti

<400> 13

gtggcaatta cgcgctgatt cttttctaca aaccacaaag acattggtac cctctatctt 60

gtatttggtg cctgagccgg tatagtaggg actgctttaa gcctccttat tcgagctgag 120

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<210> 14

<211> 1556

<212> DNA

<213> Coreius heterodon

<400> 14

gtggcaatta cgcgctgatt cttttcacga accacaaaga cattggtacc ctttatcttg 60

tatttggtgc ctgagccggc atagtaggga ctgctttaag cctcctcatt cgagctgaac 120

taagccagcc cggatcacta ctaggtgatg atcaaaattt ataatgttat cgttactgcc 180

cacgccttcg taataatttt ctttatagta ataccaatcc ttattgggcg gatttggaaa 240

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catcccgaag tctatattct tattttaccc ggatttggca tcatttcaca cgttgtagcc 780

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taactcatca cttgacattg tcctccacga cacgtactat gtagttgcac acttccacta 1140

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aacgagaagt atcctcagta gaactaacta caacaaacgt agaatgactt cacggctgcc 1500

cccccaccat atcaccattt gaggaaccag cattcgttca agttcaatca aactaa 1556