检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法

摘要

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。本发明提供了利用重组毕赤酵母高效地发酵生产β2‑微球蛋白的方法。与重组大肠杆菌表达系统相比，本发明克服了易形成包涵体、复性困难且易丧失免疫学活性等问题。甲醇作为诱导碳源促使AOX1基因的表达，从而提高了目的蛋白的表达量。增加发酵液氮源含量，采用恒流加补充尿素和分批补充蛋白胨，并用氨水控制最适pH的方法，维持适宜的碳氮比，为目的产物的合成提供所需的物质。本发明诱导时长缩短、补料速率提升，使得外源蛋白降解情况好转，相同诱导时间表达量提高。并且结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化，且操作简单、临床应用广泛。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。

背景技术

β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11.8KDa，由99个氨基酸组成的单链球蛋白。广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。Wibell发现血中β2-微球蛋白与肌酐有明显的正相关，揭示了血、尿中β2-微球蛋白是检测肾功能的灵敏指标。相较于其他传统的肾脏功能检测指标，β2-微球蛋白在肾病初期就能被检测出来，更适合作为早期肾脏疾病的临床诊断标志物。人体内肾近曲小管对β2-微球蛋白的重吸收率达到99％以上，正常情况下β2-微球蛋白从体内的排出水平极低，一般临床检测尿样中β2-微球蛋白的参考范围是0mg/L～0.3mg/L，在血液或血浆样本中最高含量为2.4mg/L。

该β2-微球蛋白可与包被在胶乳颗粒上的羊抗人β2-微球蛋白IgG结合产生浊度，在546nm处检测反应吸光度，吸光度值与β2-微球蛋白的浓度成正相关。通过乳胶免疫比浊法对血液和尿液中β2-微球蛋白进行测定最大优点是结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化。此外，这种方法操作简单、临床应用广泛。

β2-微球蛋白的检测分为血液和尿液检测。检测血液中β2-微球蛋白的含量可以提前发现肾小球的病变、高血压患者的肾功能前期受损情况，观察肾脏移植的排斥反应，它也是反映长期血透患者淀粉样变性的指标。检测尿液中β2-微球蛋白含量来评定肾脏功能时，首先要检测血液中β2-微球蛋白的含量，排除引起血液中β2-微球蛋白含量增高的疾病。当血液中β2-微球蛋白含量正常，但尿液中β2-微球蛋白含量增高时，可进一步判断肾小管、肾小球功能是否正常、以及进行尿路感染定位等肾功能相关疾病的诊断。推进β2-微球蛋白标准化，研制β2-微球蛋白标准物质，对肾脏疾病早期诊断、病情预判以及后期治疗均有重要意义。

现存的制备方法的缺点表现在：诱导时间较长、补料速率的低、细胞表达量低、导致产量低并且表达出的蛋白准确度较低，不能够准确地表征抗原浓度变化，易形成包涵体、而且复性困难且易丧失免疫学活性，同时操作难度大，因此临床应用范围小。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。

本发明提供了编码β2-微球蛋白的核酸，其具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明还提供了包括所述的核酸的质粒载体。

本发明提供了表达β2-微球蛋白的酵母，其表达如SEQ ID NO.1所示的核酸。

本发明提供的重组毕赤酵母，通过多次发酵试验，结果表明构建好的工程菌株抗原产量较高、稳定性较强。

本发明还提供了重组毕赤酵母菌株的构建方法：将质粒载体转化到酵母，所述方法具体包括扩增结束后，通过SDS-PAGE电泳筛选出我们所需要的目的条带进行回收，对获得的核酸序列进行测序分析后，对获得的正确的基因序列进行重组构建，并后期通过对获得的诸多重组工程菌进行小样测试诱导蛋白的表达，对表达量较高的工程菌继续上罐验证，最终获得重组毕赤酵母。

本发明还提供了β2-微球蛋白的制备方法，所述方法包括培养所述酵母，诱导蛋白表达。

本发明所述的方法，其中：所述起始生长阶段：温度为26℃～32℃，所述起始生长阶段包括：通过三区划线挑取单菌落于YNB培养基中，得到一级种子液；然后，取一级种子液接入BMGY培养基中，得到二级种子液。

所述起始生长阶段以MD固体培养基划线培养所述的酵母，以YNB培养基进行一级种子制备，以BMGY培养基进行二级种子制备。

一些具体实施例中，所述起始生长阶段：温度为28℃。

本发明所述的方法，其中：所述富集培养阶段，控制pH值为6.0±0.2，所述流加补料I维持发酵液溶氧为30％±5％；所述富集培养阶段以补料III控制pH值，然后流加补料I，所述补料I包括甘油和PTM1微量元素溶液，所述补料III为25vol％的氨水。本发明所述富集培养阶段中使用的含PTM1微量元素溶液的甘油，其中PTM1微量元素溶液的添加量为每1L的50％甘油中加入5ml。

一些实施例中，所述富集培养阶段：温度为30℃±1℃，初始搅拌转速为300rpm，通气量为1.0vvm，通过调节搅拌转速，维持发酵液溶氧为30％以上，搅拌转速不超过750rpm，发酵液的pH值为6.0。

另一些实施例中，所述富集培养阶段：温度为30℃±1℃，初始搅拌转速为300rpm，通气量为0.8vvm～1.5vvm，通过调节搅拌转速，维持发酵液溶氧维持在30％±5％，搅拌转速不超过750rpm，发酵液的pH值为6.0±2。

一些具体实施例中，所述富集培养阶段包括将本发明制得的种子液接种至用氨水调pH为6.0±0.2的BSM2发酵培养基中，溶氧下降又升高至50％，流加含PTM1的甘油，调节流加速率使发酵液溶氧维持在30％±5％，当酵母湿重达到诱导条件，停止流加含PTM1的甘油，最后，确保培养基中甘油全部耗尽，开始诱导重组毕赤酵母表达。

一些具体实施例中，所述富集培养阶段，搅拌转速达到750rpm～850rpm，溶氧下降又升高至50％以上，流加补料I以维持溶氧为30％±5％，直至酵母湿重达到150g/L～250g/L，停止流加补料Ⅰ，饥饿培养耗尽甘油，结束富集培养阶段。

另一些具体实施例中，所述富集培养阶段，搅拌转速达到750rpm，溶氧下降又升高至50％以上，流加补料I以维持溶氧为30％±5％，直至酵母湿重达到150g/L～200g/L，停止流加补料Ⅰ，饥饿培养耗尽甘油，结束富集培养阶段。

一些实施例中，所述诱导培养阶段：温度为28℃±1℃，pH为5.8～6.2，通气量为0.8vvm～1.5vvm。一些具体实施例中，所述诱导培养阶段：温度为26℃，pH为5.8～6.2，通气量为0.8vvm～1.5vvm。

本发明所述诱导培养阶段，补料V的加入量为发酵体积的3.5％，所述流加补料II维持发酵液溶氧为30％±5％，所述补料IV的流速为2ml/h/L，所述补料VI的流速为2.4ml/h/L，诱导48h后，再次加入发酵体积的3.5％的补料V。

所述诱导培养阶段加入补料V后，流加补料II、补料Ⅳ和补料VI，所述补料II包括100％甲醇和PTM1微量元素溶液；所述补料Ⅳ为15wt％的尿素溶液；所述补料V为200g/L蛋白胨溶液；所述补料VI为150g/L的硫酸镁溶液。一些具体实施例中，所述补料II中PTM1微量元素溶液的添加量为每1L甲醇溶液中加入12ml。

一些具体实施例中，所述诱导培养阶段包括：将发酵温度降温至28℃，补加一次蛋白胨，开始同时流加含PTM1的甲醇、尿素；待诱导至48h时，再次补加蛋白胨，整个诱导过程通过调节含PTM1的甲醇流加速率使发酵液溶氧维持在30％±5％，整个诱导周期为96h。

本发明中溶氧条件包括：

一些实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％±5％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％±5％。

一些具体实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％±3％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％±3％。

一些具体实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％±1％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％±1％。

一个具体实施例中，所述富集培养阶段发酵液溶氧为30％；所述诱导培养阶段发酵液溶氧为30％。

本发明所述的方法，还包括收集上清、浓缩、疏水层析和离子交换层析的步骤，

所述浓缩采用分子量为3kDa的中空纤维柱；

所述疏水层析的柱填料为Phenyl；

所述离子交换层析的柱填料为DEAE。

本发明所述浓缩洗滤提纯及样品后处理过程包括浓缩洗滤、疏水层析、离子交换层析、样品后处理四个阶段；

所述浓缩洗滤包括采用中空纤维柱浓缩酵母上清，然后用NaCl粗纯处理，离心过滤后，用20mMTris-HClpH7.5缓冲液进行洗滤。

所述疏水层析包括用过滤纯化水冲洗填料后，使用NaCl平衡层析柱，调节上样速率将样品在低流速下缓慢上样，后用平衡缓冲液HCl和NaCl冲洗平衡层析柱，最后用HCl进行目的蛋白的解离，并收集。

所述离子交换层析包括用过滤纯化水冲洗填料后，使用HCl平衡层析柱，调节上样速率将获得的解离目的蛋白样品在低流速下缓慢上样，后用平衡缓冲液HCl冲洗平衡层析柱，用HCl和NaCl进行目的蛋白的解离，并收集。

所述样品后处理包括将离子交换层析后的样品用微量紫外分光光度计进行蛋白浓度测定和调节，调节好浓度的样品根据样品体积添加P300，搅拌混匀后，-20℃分装存放。

一些具体实施例中，所述β2-微球蛋白的分离纯化包括：

步骤1：浓缩洗滤

采用中空纤维柱将过滤后的酵母上清进行浓缩，浓缩后的样品用NaCl进一步粗纯处理，离心过滤后，使用20mM Tris-HCl pH7.5缓冲液进行洗滤。

步骤2：疏水层析

用过滤纯化水冲洗填料后，使用20mM Tris-HCl+1M NaCl pH7.5平衡层析柱，调节上样速率将洗滤后的样品在低流速下缓慢上样，待样品上样完毕后用平衡缓冲液20mMTris-HCl+1M NaCl pH7.5冲洗平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡，用20mM Tris-HClpH7.5进行目的蛋白的解离，并收集。

步骤3：离子交换层析

用过滤纯化水冲洗填料后，使用20mM Tris-HCl pH8.5平衡层析柱，调节上样速率将获得的解离目的蛋白样品在低流速下缓慢上样，待样品上样完毕后用平衡缓冲液20mMTris-HCl pH8.5冲洗平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡，用20mM Tris-HCl+1M NaClpH8.5进行目的蛋白的解离，并收集。

步骤4：样品后处理

将离子交换层析后的样品用微量紫外分光光度计进行蛋白浓度测定和调节，调节好浓度的样品根据样品体积添加P300，搅拌混匀后，-20℃分装存放。

本发明提供了使用甲醇作为碳源诱导表达的方法，所述方法具体为将发酵温度降温至28℃，补加一次蛋白胨，开始同时流加含PTM1的甲醇，尿素；待诱导至48h时，再次补加蛋白胨，整个诱导过程通过调节含PTM1的甲醇流加速率使发酵液溶氧维持在30％±5％，整个诱导周期为96h。

本发明还提供了一种预防和/或治疗慢性间质性肾炎的重组抗原疫苗，所述重组抗原疫苗包含有效剂量的本发明所述的β2-微球蛋白重组抗原和药学上可接受的载体。

本发明还提供了所述的重组蛋白疫苗在制备预防和/或治疗慢性间质性肾炎疫苗中的应用。

本发明所述补料培养基包括：补料Ⅰ(50％甘油630.5g/L、PTMI 5ml/L)、补料II(100％甲醇、PTM1 12ml/L)、补料Ⅲ(25％氨水)、补料Ⅳ(15％尿素)、补料Ⅴ(蛋白胨200g/L)和补料VI(硫酸镁150g/L)。

本发明还提供了预防和/或治疗慢性间质性肾炎的方法，其包括给予本发明所述的疫苗。

本发明在传统的重组毕赤酵母发酵条件的基础上，对发酵培养基成分和培养条件进行了优化改进。本发明提供的利用重组毕赤酵母高效地发酵生产β2-微球蛋白方法，其优点包括：①与重组大肠杆菌表达系统相比，克服了易形成包涵体、复性困难且易丧失免疫学活性的问题。②诱导阶段甲醇作为诱导碳源促使AOX1基因的表达，提高目的蛋白的表达量。③增加发酵液氮源含量，采用恒流加补充尿素和分批补充蛋白胨，并用氨水控制最适pH的方法，维持适宜的碳氮比，为目的产物的合成提供所需的调节物和前体物质。④诱导时长的缩短、补料速率的提升，使得外源蛋白降解情况较为好转，相同诱导时间表达量有所提高。通过乳胶免疫比浊法对血液和尿液中β2-微球蛋白进行测定最大优点是结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化。此外，这种方法操作简单、临床应用广泛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：

图1示分批补料发酵每隔12h湿重变化趋势和上清蛋白浓度变化趋势；

图2示不同诱导阶段蛋白表达电泳图；图注：1～8泳道分别为诱导12h,24h,36h,48h,50h,72h,84h,96h后的电泳结果；

图3示疏水纯化后的蛋白电泳结果；图注：1～4泳道为前处理样品分别为上清原液、浓缩液、洗滤液、洗滤流穿液；5～7泳道为疏水纯化后样品分别为上样液、流穿液、解离液；

图4示离子交换纯化后的蛋白电泳结果；图注：1泳道为上样液、2泳道为流穿液、3～5泳道分别为10％、20％、100％目的蛋白解离液；

图5示菌体生长曲线；

图6示上清液中蛋白浓度变化曲线；

图7示不同组间、批次上清蛋白表达量；

图8示不同组间、批次β2微球蛋白表达量。

具体实施方式

本发明提供了检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了优化后的编码β2-MG蛋白的核酸序列：atgtccagatccgttgctttggctgttttggccttgttgtctttgtctggtttggaggctatccagagaaccccaaagattcaggtctactccagacatccagctgagaacggaaagtccaacttcctgaactgttacgtgtccggttttcacccatccgacattgaggttgacttgctgaagaacggtgagagaatcgagaaggttgaacactccgacctgtccttctcaaaggactggtctttctacctgctgtactacactgagttcaccccaactgaaaaggacgagtacgcctgtagagttaaccacgttactttgtcccagccaaagatcgtcaagtgggacagagatatg(SEQ ID NO:1)

本发明所述的方法包括起始生长阶段、富集培养阶段和诱导培养阶段：

所述起始生长阶段的培养基包括MD培养基、YNB培养基和BMGY培养基培养；

所述富集培养阶段和所述诱导阶段的培养基包括BSM2培养基、PTM1、Biotin和YNB培养基。

本发明所述的方法，其中：

所述MD平板培养基组分包括：C

一些实施例中，所述MD平板培养基组分包括：C

另一些实施例中，所述MD平板培养基组分包括：C

一些具体实施例中，所述MD平板培养基组分包括：C

所述YNB培养基组分包括：无氨基酵母氮源134.0g/L；

所述BMGY培养基组分包括：蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、KH

一些实施例中，所述BMGY培养基组分包括：蛋白胨10.0g/L～30.0g/L、酵母提取物0～20.0g/L、KH

另一些实施例中，所述BMGY培养基组分包括：蛋白胨15.0g/L～25.0g/L、酵母提取物5.0～15.0g/L、KH

所述BSM2培养基组分包括：85％H

一些实施例中，所述BSM2培养基组分包括：85％H

另一些实施例中，所述BSM2培养基组分包括：85％H

本发明所述PMT1组分包括：CuSO

本发明发酵培养提供了一种发酵培养重组毕赤酵母的方法，所述方法包括以下两个步骤。

步骤一：

1、采用20L发酵罐，按照5％的接种量将400ml种子液接种于8L BSM2发酵初始培养基中，初始搅拌转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.05MPa，30℃，pH6.0培养至溶氧突升，培养过程中，当溶氧下降至30％以下时，逐级提升转速至750rpm。

2、流加补料Ⅰ，控制流加速率使溶氧维持在30％左右，完成后取样测定湿重约180.0g/L，整个过程约24h。

3、饥饿2h后，降温至28℃，添加补料Ⅴ315ml，接着补料Ⅳ以2ml/h/L的速率流加，同时，流加补料II控制流加速率，使溶氧维持在30％±5％，持续进行至72h。

4、再次添加补料Ⅴ420ml，接着补料Ⅳ以2ml/h/L的速率流加，补料VI以2.4ml/h/L的速率流加，流加补料液II控制速率使溶氧维持在30％±5％，维持进行至120h。

5、从发酵培养基接种开始，每隔12h对发酵液取样，进行湿重、上清蛋白浓度、电泳分析。从发酵罐中取发酵液30ml，用已知重量的离心管10000rpm离心10分钟。

湿重测定：弃上清后称重，总重量减去离心管重量即为湿重。

上清蛋白浓度测定：取上清采用G250法测定蛋白浓度。

电泳：采用15％SDS-PAGE变性还原胶分析。

步骤二：

1、取重组酵母发酵液1000ml，使用3KD中空纤维柱浓缩至原体积的1/10，得到100ml浓缩液，经粗纯离心过滤和洗滤后，得到蛋白浓度为16.5mg/ml的样品。

2、取70ml洗滤后的蛋白样品进行疏水层析，并用100％的20mM Tris-HCl pH7.5解离缓冲液进行目的蛋白的解离，疏水层析过程中收集流穿液和解离液。最后各取20μl上样样品，流穿液和解离液，进行15％SDS-PAGE变性还原胶分析。

3、取45ml疏水层析后的样品进行离子交换层析，并分别用10％、20％、100％的20mM Tris-HCl+1M NaCl pH8.5解离缓冲液进行目的蛋白的解离，离子交换层析过程中收集流穿液和解离液。最后各取20μl上样样品，流穿液和解离液，进行15％SDS-PAGE变性还原胶分析。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1重组酵母的构建方法

1、序列优化

在NCBI中进行信息检索，获得β2-微球蛋白的基因序列，根据毕赤酵母密码子偏好性对该段基因序列进行优化。

2、引物设计

在β2-微球蛋白的基因序列5’端插入含SnaB I限制性内切酶酶切位点引物序列，在3’端插入含EcoR I和Sac I限制性内切酶酶切位点引物序列，经PCR扩增后与pPIC9K质粒相连，并保存于大肠杆菌中。

3、重组毕赤酵母制备

向150ml LB培养基中加入150μl卡那霉素和150μl保存的大肠杆菌菌液，37℃，230rpm培养约4h～5h，当菌液OD

实施例2菌株培养方法

1、平板划线

MD平板培养基组分：C

按无菌操作要求，用接种环蘸取BMG酵母甘油菌在MD平板培养基上进行划线，将平板置于恒温培养箱中28℃培养24h，获得BMG酵母单菌落。

2、一级种子制备

YNB培养基组分：蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、C

按无菌操作要求，挑取单菌落置于YNB培养基中，在180rpm，28℃的环境中培养24h，OD

3、二级种子制备

BMGY培养基组分：蛋白胨20.0g/L、酵母提取物10.0g/L、KH

按无菌操作要求，以10％的接种量取一级种子液接入BMGY培养基中，在180rpm，28℃的环境中培养15h～24h，2.0＜OD

4、富集培养

BSM2培养基组分：85％H

PMT1组分：CuSO

补料培养基：补料Ⅰ(50％甘油 630.5g/L、PTMI 5ml/L)、补料II(100％甲醇、PTM112ml/L)、补料Ⅲ(25vol％氨水)、补料Ⅳ(15％尿素)、补料Ⅴ(蛋白胨200g/L)、补料VI(硫酸镁150g/L)

将BSM2培养基加入到发酵罐内，121℃，30min灭菌，待发酵罐内的培养基冷却到室温时，每升培养基添加PTM1 1.5ml，500×Biotin(生物素200mg/L)2ml以及10×YNB(无氨基酵母氮源134g/L)20ml，使用25％的氨水维持培养基的pH为6.0。按照5％的接种量将步骤3所制的种子液接种到发酵罐中，开始发酵培养。发酵罐参数设置为初始搅拌转速300rpm，通气量为1vvm，温度控制在30℃±1℃，通过调节搅拌转速和通气量将溶氧维持在30％以上，转速最高达到750rpm。每隔12h进行一次取样测定OD

5、诱导培养

将温度从30℃±1℃降28℃±1℃，加入3.5％发酵体积的补料V，自动流加补料液II，流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％为标准，同时以2ml/h/L的速率流加补料Ⅳ，以2.4ml/h/L的速率流加补料VI。每隔12h进行一次取样测定OD

6、收集上清

将发酵液转移至1000ml离心杯中，4℃、8000rpm条件下离心20min后，在将上清液用400目的尼龙网过滤后收集，4℃暂存。

实施例3浓缩洗滤提纯及样品后处理

本发明分离纯化提供了一种浓缩洗滤，疏水层析，离子交换层析获取目的蛋白的方法。

1、浓缩洗滤

用过滤纯化水将保存完好的3KD中空纤维柱冲洗至pH接近中性，再用20mM Tris-HCl pH7.5缓冲液平衡中空纤维柱，然后将收集到的酵母上清使用该中空纤维柱浓缩至原体积的1/10，浓缩后的样品用NaCl进一步粗纯处理，接着将离心过滤后的样品使用20mMTris-HCl pH7.5的缓冲液洗滤5次。

2、疏水层析

将浓缩洗滤后的蛋白进行Phenyl层析纯化。设置压力0.5MPa，流速30ml/min，用过滤纯化水将层析柱填料冲洗3CV～5CV柱床体积。用20mM Tris-HCl+1M NaCl pH7.5平衡缓冲液以30ml/min流速平衡层析柱3CV～5CV柱床体积。调节上样速率至10ml/min，将过滤后的样品在低流速下缓慢上样，使目的蛋白充分结合。待样品上样完毕后，用平衡缓冲液20mMTris-HCl+1M NaCl pH7.5，以30ml/min流速再次平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡。最后，以30ml/min流速用20mM Tris-HCl pH7.5进行目的蛋白的解离，并收集。

3、离子交换层析

将疏水解离的目的蛋白进行DEAE层析纯化。设置压力0.5MPa，流速15ml/min，用过滤纯化水将层析柱填料冲洗3CV～5CV柱床体积。用平衡缓冲液20mM Tris-HCl pH8.5，以15ml/min流速平衡层析柱3CV～5CV柱床体积。调节上样流速至5ml/min将样品在低流速下缓慢上样，使其充分结合。待样品上样完毕后用平衡缓冲液20mM Tris-HCl pH8.5，以15ml/min流速再次平衡层析柱，平衡至电导和紫外峰平衡。最后，以15ml/min流速用20mM Tris-HCl+1M NaCl pH8.5进行目的蛋白的解离，并收集。

4、样品后处理

将DEAE解离样品用微量紫外分光光度计1Abs进行蛋白浓度测定和调节，将样品浓度调节至2.0mg/ml。处理好的样品根据样品体积添加1‰P300，搅拌混匀后，-20℃分装保存。

实施例4不同发酵培养方案验证报告

一、不同发酵培养方案对提高β2微球蛋白重组毕赤酵母菌体湿重和蛋白表达量的影响

1、发酵方案：

优化前发酵培养方案A：

1)将BSM培养基加入到发酵罐中，经高温高压灭菌后，当发酵培养基温度降至30℃，用氨水将发酵液pH值调至5.0，然后加入PTM1微量元素溶液，最后接入种子液。

2)初始培养过程中，通过调节搅拌转速和通气量将溶氧维持在30％以上，转速最高达到750rpm。

3)当基础培养基中的碳源消耗完毕后，溶氧会跳升至50％以上，此时开始添加含PTM1微量元素溶液的50％甘油，并维持流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％。

4)当甘油补加完毕后，溶氧会再次跳升至50％以上，此时开始添加含PTM1微量元素溶液的甲醇，进行诱导表达，并维持流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％，诱导过程持续96h。

优化后发酵培养方案B(实施例2)：

1)将BSM2培养基加入到发酵罐中，经高温高压灭菌后，当发酵培养基温度降至30℃，用氨水将发酵液pH值调至6.0，然后加入PTM1微量元素溶液，500×Biotin以及10×YNB，最后接入种子液。

2)初始培养过程中，通过调节搅拌转速和通气量将溶氧维持在30％以上，转速最高达到750rpm。

3)当基础培养基中的碳源消耗完毕后，溶氧会跳升至50％以上，此时开始添加含PTM1微量元素溶液的50％甘油，并维持流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％。

4)当酵母湿重达到150g/L～200g/L时，停止补加甘油，饥饿培养2小时后，将温度从30℃±1℃降28℃±1℃。开始进行目的蛋白诱导，此时加入3.5％发酵体积的蛋白胨，自动流加含PTM1微量元素溶液的甲醇，流加速度以控制发酵液溶氧维持在30％±5％为标准，同时以2ml/h/L的速率流加15％尿素，以2.4ml/h/L的速率流加150g/L的硫酸镁。诱导48h后，再次加入3.5％发酵体积的蛋白胨，诱导过程持续96h。

2、菌体湿重结果：表格中第1批、第2批和第3批是优化后发酵培养方案B的三次重复验证结果对比。

总结：优化后的发酵培养方案B相较于优化前的发酵方案A在菌体湿重上综合提升效果约为22.90％(如图5所示)。

3、上清蛋白表达量结果：

总结：优化后的发酵培养方案B相较于优化前的发酵方案A在上清蛋白浓度上综合提升效果约为42.78％(如图6所示)。

4、单位菌株单位时间内蛋白量：

总结：优化后的发酵培养方案B相较于优化前的发酵方案A在单位菌体单位时间内上清蛋白量综合提升效果约为17.92％(如图7所示)。

5、纯化结果：

总结：优化前发酵培养方案A的β2微球蛋白总体平均浓度μ为4.3mg/ml,优化后发酵培养方案B，通过3批次纯化后，测得的β2微球蛋白平均浓度为6.8mg/ml,标准差s为0.265，进行单样本t检验(单侧)，以显著性水平α＝0.05，查t值表可知t

经三次重复性验证，重现性结果较好。优化后发酵培养方案B在菌体湿重、上清蛋白表达量以及β2微球蛋白纯化结果上均优于优化前发酵培养方案A。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 郑州伊美诺生物技术有限公司

<120> 检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法

<130> MP22000195

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtccagat ccgttgcttt ggctgttttg gccttgttgt ctttgtctgg tttggaggct 60

atccagagaa ccccaaagat tcaggtctac tccagacatc cagctgagaa cggaaagtcc 120

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