一种利用活体成像技术实时监测纳米农药在植物体内运动情况的方法

摘要

本发明公开了一种利用活体成像技术实时监测纳米农药在植物体内运动情况的方法。将双向传导的荧光纳米杀菌剂喷洒到植株叶片上，并将其置于活体成像仪器中观察，根据荧光分子选定激发和发射波长，观察整株植株的荧光成像结果，实现实时监测纳米杀菌剂在植物体内的运动情况。本发明的制备的双向传导的荧光纳米杀菌剂可经植物叶面喷施后在植株体内双向传导，避免了土壤施药，进而减少了土壤施药导致药用成本高、药效低和严重的环境问题。并且，能够通过活体荧光成像技术，实时监测到所制备的纳米杀菌剂在植株内的运动情况，不必破坏植株完整性取样观察，更能反映纳米杀菌剂在植物活体内的真实运动情况。

说明书

技术领域：

本发明属于植物保护应用领域，具体涉及一种利用活体成像技术实时监测纳米农药在植物体内运动情况的方法。

背景技术：

为解决农药利用率低和浪费污染严重的问题，纳米农药应运而生。有些纳米农药主要是为了提高农药分子的稳定性、减少农药的扩散、实现农药的缓释功能等，对纳米农药是否能进入植物体内、在植物体内的运动行为并没有深入和系统的研究。而也有科研人员通过对纳米农药进行分子修饰，希望纳米农药可以进入植物体内，并实现农药在植物病患部位的靶向富集和释放，以此进一步提高纳米农药的利用率。但纳米农药在植物体内的传导行为并没有被直观监测到，只是通过对不同部位植物组织中农药含量的测定和分析，来判断纳米农药是否能够到达靶向位置。这对研究纳米农药的吸收和传导机制非常不利，进而影响了纳米农药的减量提效化率利用效果。

之前研究有利用荧光纳米载体负载药物，通过荧光成像观察纳米药物在动物体内的运动情况。但是2022年最新发表在权威期刊《Nature Nanotechnology》上的一篇文章明确指出，对于动物细胞膜与纳米材料相互作用的相关研究成果并不适用于有细胞壁的植物系统。

但是目前，尚没有通过植物活体成像的方法实现对纳米杀菌剂在植物体内运动情况的实时监测的报道。文献中介绍的对纳米农药进行成像观察的多采用细胞荧光成像，不能反映植物活体的真实情况。或者采用植物切片等方式进行荧光、电镜等方法成像，需要对植物进行破坏性取样，无法实时监测活体成像效果。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用活体成像技术实时监测纳米农药在植物体内运动情况的方法。

本发明利用荧光性能稳定、量子产率高的荧光分子制备荧光介孔二氧化硅纳米颗粒，并在其表面修饰上氨基酸、氨基葡萄糖等功能分子，用来负载杀菌剂分子得到小粒径的双向传导的荧光纳米杀菌剂；然后将上述双向传导的荧光纳米杀菌剂喷洒到植株叶片上，并将其置于活体成像仪器中，可实现对双向传导的荧光纳米杀菌剂在植物体内运动行为的实时荧光成像观察，从而实现了本发明的目的。

本发明的利用活体成像技术实时监测纳米农药在植物体内运动情况的方法，是将双向传导的荧光纳米杀菌剂喷洒到植株叶片上，并将其置于活体成像仪器中观察，根据荧光分子选定激发和发射波长，观察整株植株的荧光成像结果，实现实时监测纳米杀菌剂在植物体内的运动情况；

所述的双向传导的荧光纳米杀菌剂是通过以下方法制备的：

利用荧光性能稳定、量子产率高的荧光分子制备荧光介孔二氧化硅纳米颗粒，并在其表面修饰上氨基酸、氨基葡萄糖功能分子，再负载杀菌剂分子得到双向传导的荧光纳米杀菌剂。

优选，所述的杀菌剂分子为内吸性杀菌剂，包括噻菌灵、多菌灵或甲基托布津。

优选，所述的氨基酸包括谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸中的一种或几种。

优选，所述的双向传导的荧光纳米杀菌剂粒径范围在10-70nm之间。

优选，所述的利用荧光分子制备荧光介孔二氧化硅纳米颗粒是称取十六烷基三甲基溴化铵、泊洛沙姆F127和三乙醇胺溶于乙醇水溶液中，再加入AIE溶液，避光充分搅拌；然后加入正硅酸乙酯，剧烈搅拌后静置反应；反应后加入乙醇水溶液摇匀，离心倒出清液后再次加入乙醇溶液超声分散，离心，固体烘干，将干燥后固体溶于盐酸甲醇溶液中，水浴回流，离心去除清液，加入甲醇超声分散洗涤，分散液烘干得到荧光介孔二氧化硅纳米颗粒。

优选，所述的表面修饰上氨基酸、氨基葡萄糖功能分子是取荧光介孔二氧化硅纳米颗粒分散在甲醇中，加入(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，搅拌反应，得到巯基修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒；再取4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐溶于磷酸缓冲溶液中，加入氨基酸或氨基葡萄糖，搅拌反应，得到活化的氨基酸或氨基葡萄糖溶液；将巯基修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒与活化的氨基酸或氨基葡萄糖溶液混合，搅拌反应，离心清洗得到氨基酸或氨基葡萄糖修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒。

优选，所述的负载杀菌剂分子是将氨基酸或氨基葡萄糖修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒分散于甲醇中，加入杀菌剂分子混合搅拌反应，离心清洗，冷冻干燥得到双向传导的荧光纳米杀菌剂。

所述的荧光分子，激发波长和发射波长应避开植物体叶绿素的激发波长(450nm)和发射波长(676nm)，并具有很好的抗淬灭性能和较强的量子产率，可用于长时间的荧光成像观察。

优选，所述的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒，可高效负载杀菌剂分子，包括但不限于荧光介孔二氧化硅纳米颗粒。

将上述双向传导的荧光纳米杀菌剂喷洒到植株叶片上，并将其置于活体成像仪器中观察，根据荧光分子选定激发和发射波长，观察整株植株的荧光成像结果，实现实时监测纳米杀菌剂在植物体内的运动情况。

本发明制备的双向传导的荧光纳米杀菌剂可经植物叶面喷施后在植株体内双向传导，避免了土壤施药，进而减少了土壤施药导致药用成本高、药效低和严重的环境问题。并且，能够通过活体荧光成像技术，实时监测到所制备的纳米杀菌剂在植株内的运动情况，不必破坏植株完整性取样观察，更能反映纳米杀菌剂在植物活体内的真实运动情况。

附图说明

图1是双向传导的荧光纳米杀菌剂喷洒在黄瓜幼苗上第一天和第八天的活体荧光成像图。(A)纳米杀菌剂喷洒在黄瓜幼苗上第一天的荧光成像图，白色箭头所指为喷洒叶片；(B)纳米杀菌剂喷洒在黄瓜幼苗上第八天的荧光成像图；(C)纳米杀菌剂喷洒在黄瓜幼苗上第一天的荧光成像图与白光图片的叠加效果图，白色箭头所指为喷洒叶片；(D)纳米杀菌剂喷洒在黄瓜幼苗上第八天的荧光成像图与白光图片的叠加效果图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、荧光纳米杀菌剂的制备：

荧光介孔二氧化硅纳米颗粒的制备：称取221.1mg十六烷基三甲基溴化铵，0.89g泊洛沙姆F127，5.21g三乙醇胺，在250mL烧瓶中溶于19mL乙醇与41.6mL水中，再加入5mL密度为0.5mg/mL的四苯乙烯甲醇溶液，放入磁转子，以500rpm转速搅拌过夜，烧瓶包裹锡纸避光；待充分搅拌均匀后，于室温下用移液枪快速加入0.85mL正硅酸乙酯，调转速至1200rpm剧烈搅拌一分钟后静置24h；加入66.7ml 95％乙醇溶液摇匀，转入50ml离心管中以10000rpm离心5min，倒出清液后再次加入乙醇溶液超声分散，离心。置于65℃烘箱中烘干备用。将干燥后固体移入烧瓶，加入3mL浓盐酸与50mL甲醇，于80℃水浴回流2h，移入离心管中离心去除清液。加入甲醇超声分散洗涤两次并离心，得分散液，烘干得到荧光介孔二氧化硅纳米颗粒。

表面功能修饰：取100mg上述荧光介孔二氧化硅纳米颗粒分散在20mL甲醇溶液中，加入3mL(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)，室温下搅拌反应24h，得到巯基修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒；再取5mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶于磷酸缓冲溶液中，加入10mg氨基葡萄糖，4℃冰箱中搅拌24h，得到活化的氨基葡萄糖溶液；将上述巯基修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒与活化的氨基葡萄糖溶液混合，室温下搅拌反应过夜，然后离心清洗得到氨基葡萄糖修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒。

负载杀菌剂：将10mg上述氨基葡萄糖修饰的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒分散于50mL甲醇中，加入20mg内吸性杀菌剂噻菌灵溶液混合搅拌24h，离心清洗，冷冻干燥，得到双向传导的荧光纳米杀菌剂。

2.实时荧光监测：然后将上述双向传导的荧光纳米杀菌剂喷洒到黄瓜幼苗叶片上，并将植株整体置于活体成像仪器中，调节激发波长为365nm，荧光采集中心波长为450nm，进行成像效果观察，在不同时间点观察成像结果，调节成像参数，可实现实时监测双向传导的荧光纳米杀菌剂在植物体内的运动情况(如图1所示)。

以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，本发明的保护范围不仅如此，凡在本发明的技术原则之内，有明显地修改、同等替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。