两种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因在海域重金属污染监测中的应用

摘要

本发明提供了两种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因及其在监测海域重金属污染中的应用，属于功能基因技术领域。本发明鉴定得到厚壳贻贝金属硫蛋白基因McMT‑10和McMT‑20。以这两种基因序列为模板设计了两对高特异性荧光定量PCR引物用以检测其在重金属污染环境中的表达量变化。结果显示McMT‑10和McMT‑20对重金属污染高度敏感，根据其表达量的变化可以检测低剂量的重金属污染，同时可以反应污染的严重程度。

说明书

技术领域

本发明属于功能基因技术领域，具体涉及两种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因及其在监测海域重金属污染中的应用。

背景技术

世界工业化进程的加快不可避免导致重金属的排放，并通过地下水汇集入河流中，最终流入海洋。近岸海域重金属污染是当前全世界沿海国家所面临的普遍性环境问题。

目前，重金属污染检测的常用方法是采集水样，然后通过生化方法如原子吸收分光光度法对其中的重金属元素如铜、锌、镉等进行鉴定。此方法程序繁琐、工作量大且反应迟钝，往往只有污染程度较高时才能予以检测到，缺乏时效性。利用海洋指示生物中表达的蛋白作为生物标志物进行重金属污染的监控是近年来世界沿海国家普遍兴起的监控方法，能在一定程度反映出环境污染的综合生物学效应，是环境监测行之有效的手段之一。然而我国拥有绵长的海岸线，选择一种标准的海洋指示生物及其能够表达准确指示重金属污染的蛋白标志物是一种亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因，其表达水平对重金属污染高度敏感，能够用于准确监测海域重金属污染中。

本发明提供了一种厚壳贻贝金属硫蛋白，包括McMT-10和McMT-20；所述McMT-10的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述McMT-20的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种编码所述厚壳贻贝金属硫蛋白的基因，包括McMT-10和McMT-20；所述McMT-10的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述McMT-20的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

本发明提供了一种所述基因的扩增引物，包括McMT-10扩增引物和McMT-20扩增引物；

所述McMT-10扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；

所述McMT-20扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物。

本发明提供了一种监控海洋重金属污染的试剂盒，所述试剂盒包括所述扩增引物、内参引物和荧光定量PCR检测扩增试剂；

所述内参引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的GAPDH基因正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的GAPDH基因反向引物。

优选的，所述扩增试剂还包括反转录试剂。

本发明提供了所述厚壳贻贝金属硫蛋白、所述基因、所述引物或所述试剂盒在监测海域重金属污染中的应用。

优选的，所述重金属包括以下一种或几种：铜、锌和镉。

本发明提供了一种监控海洋重金属污染的方法，包括以下步骤：

1)采集海岸线厚壳贻贝，提取厚壳贻贝的RNA；

2)以步骤1)中所述RNA为模板进行反转录，得到cDNA；

3)以步骤2)中所述cDNA为模板，用所述引物进行荧光定量PCR扩增，分析McMT-10和/或McMT-20表达水平相对于对照组的变化趋势，McMT-20显著上调而McMT-10表达量无明显变化时，表示海域受到重金属污染，但污染程度较轻；所述McMT-20和McMT-10表达量均显著上调时表示重金属污染程度较重。

优选的，所述污染程度较轻是铜、铅和镉的浓度依次低于10.0、5.0和5.0μg/L。

优选的，所述重金属污染程度较重是铜、铅和镉浓度依次高于50.0、20.0和20.0μg/L。

优选的，所述重金属包括以下一种或几种：铜、锌和镉。

本发明提供了一种厚壳贻贝金属硫蛋白，包括McMT-10和McMT-20；所述McMT-10的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述McMT-20的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。厚壳贻贝是亚太地区的贻贝特有种，在我国分布广泛。利用厚壳贻贝进行近岸重金属污染监控有利于克服以往过程费时费力且滞后的缺点，应用前景广阔。利用厚壳贻贝监控重金属污染的前提是需要找到一种或几种对此种污染反应敏感的生物标志物。本发明实施例鉴定了两种厚壳贻贝金属硫蛋白基因McMT-10和McMT-20，McMT-10和McMT-20对重金属污染高度敏感，根据其表达量的变化可以检测低剂量的重金属污染，同时可以反应污染的严重程度。

附图说明

图1为在重金属污染海水中McMT-10和McMT-20的相对表达；其中A为铜(Cu)、铅(Pb)和镉(Cd)浓度分别是10.0、5.0和5.0μg/L的混合重金属溶液处理时McMT-10和McMT-20的相对表达结果，图1B为铜(Cu)、铅(Pb)和镉(Cd)浓度分别是50.0、20.0和20.0μg/L的混合重金属溶液处理时McMT-10和McMT-20的相对表达结果，不同字母表示显著性差异。

具体实施方式

本发明提供了一种厚壳贻贝金属硫蛋白，包括McMT-10和McMT-20；所述McMT-10的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述McMT-20的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种编码所述厚壳贻贝金属硫蛋白的基因，包括McMT-10和McMT-20；所述McMT-10的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述McMT-20的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

本发明提供了一种所述基因的扩增引物，包括McMT-10扩增引物和McMT-20扩增引物；所述McMT-10扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；所述McMT-20扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物。

本发明提供了一种监控海洋重金属污染的试剂盒，所述试剂盒包括所述扩增引物、内参引物和荧光定量PCR检测扩增试剂；所述内参引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的GAPDH基因正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示的GAPDH基因反向引物。

在本发明中，本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法获得即可。本发明对所述荧光定量PCR检测扩增试剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光定量PCR检测试剂即可。所述扩增试剂优选还包括反转录试剂。本发明对所述反转录试剂的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的反转录试剂即可。

本发明提供了所述厚壳贻贝金属硫蛋白、所述基因、所述引物或所述试剂盒在监测海域重金属污染中的应用。

在本发明中，厚壳贻贝来源的金属硫蛋白基因对重金属污染十分敏感，根据其表达量的变化可以检测低剂量的重金属污染，同时可以反应污染的严重程度。所述重金属优选包括以下一种或几种：铜、锌和镉。

本发明提供了一种监控海洋重金属污染的方法，包括以下步骤：

1)采集海岸线厚壳贻贝，提取厚壳贻贝的RNA；

2)以步骤1)中所述RNA为模板进行反转录，得到cDNA；

3)以步骤2)中所述cDNA为模板，用所述引物进行荧光定量PCR扩增，分析McMT-10和/或McMT-20表达水平相对于对照组的变化趋势，McMT-20显著上调而McMT-10表达量无明显变化时，表示海域受到重金属污染，但污染程度较轻；所述McMT-20和McMT-10表达量均显著上调时表示重金属污染程度较重。

本发明对提取厚壳贻贝的RNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的动物RNA提取试剂盒即可。

本发明提供的方法针对的重金属的种类同上，在此不做赘述。

在本发明中，运用最小二乘法2

可见，McMT-10和McMT-20对重金属污染高度敏感，根据其表达量的变化可以检测低剂量的重金属污染，同时可以反应污染的严重程度。

下面结合实施例对本发明提供的一种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因及其在监测海域重金属污染中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种监测海域重金属污染的方法

1)贻贝放置。市场购置4～5cm壳长厚壳贻贝，80只放入聚乙烯网兜中，移植到3个重点监控区域。对3个重点监控区域海水进行重金属浓度测定，其中第一重点监控区域海水中铜(Cu)、铅(Pb)和镉(Cd)浓度依次为2.0、0.5和0.4μg/L，视为未发生重金属污染，第二重点监控区域海水中铜(Cu)、铅(Pb)和镉(Cd)浓度依次为10.0、5和5μg/L，视为发生轻度重金属污染，而第三重点监控区域海水中铜(Cu)、铅(Pb)和镉(Cd)浓度依次为50.0、20.0和20.0μg/L，视为发生重度重金属污染。每网兜贻贝浸在2米深的海水中，用发泡塑料浮球悬浮，下方用锚固定。定期(根据实际情况选择，一般间隔30天左右)采集3只贻贝。

2)RNA提取及逆转录。贻贝采集后迅速解剖获取消化腺组织，利用TRIzol试剂提取总RNA，此后立即进行逆转录，逆转录步骤参考RevertAidTM First Strand cDNASynthesis Kit说明书。

3)McMT-10和McMT-20表达量分析。以厚壳贻贝GAPDH基因为内参，利用荧光定量PCR(qPCR)法检测McMT-10和McMT-20mRNA表达量。设计McMT-10，McMT-20及GAPDH高特异性引物qMcMT-10(SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6)，qMcMT-20(SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8)和qGAPDH(SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10)。

以稀释后的cDNA为qPCR的模板，检测McMT-10和McMT-20的表达变化，以实验室条件下养殖的厚壳贻贝作为对照。qPCR的反应程序为98℃90s，98℃30s，60℃30s，72℃，15s，35个循环；72℃10min，4℃保温。

数据处理及分析。运用最小二乘法2–

与对照组(未发生污染海水组)对比，McMT-20显著上调而McMT-10无明显变化时，表示虽然受到重金属污染，但污染程度较轻；McMT-20和McMT-10均显著上调时表示受重金属污染程度较重(见图1)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 两种厚壳贻贝金属硫蛋白及其编码基因及其在监测海域重金属污染中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 72

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Gly Pro Cys Asn Cys Ile Glu Thr Asn Val Cys Ile Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Cys Ser Gly Glu Gly Cys Arg Cys Gly Asp Ala Cys Lys Cys

20 25 30

Thr Gly Asp Cys Lys Cys Ser Gly Cys Lys Val Val Cys Lys Cys Ser

35 40 45

Gly Ser Cys Ala Cys Glu Ala Gly Cys Thr Gly Pro Ser Thr Cys Lys

50 55 60

Cys Lys Ser Asp Cys Ser Cys Lys

65 70

<210> 2

<211> 72

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Gly Pro Cys Asn Cys Ile Glu Thr Asn Val Cys Ser Cys Gly

1 5 10 15

Ala Gly Cys Ser Gly Lys Cys Cys Gln Cys Gly Asp Ala Cys Lys Cys

20 25 30

Ala Ser Gly Cys Ala Cys Pro Gly Cys Lys Val Val Cys Arg Cys Ser

35 40 45

Gly Thr Cys Ala Cys Gly Cys Asp Cys Thr Gly Pro Ser Thr Cys Lys

50 55 60

Cys Gln Ser Gly Cys Ser Cys Lys

65 70

<210> 3

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagaaatatt acgacgaatt aaaaatgcca ggaccttgta actgcatcga aacaaatgtt 60

tgtatctgtg gcactggctg cagcggtgaa ggttgtcgct gtggtgacgc ctgcaagtgc 120

acaggtgact gtaaatgttc cggatgtaaa gtagtttgca agtgttcagg tagctgtgcg 180

tgtgaagcag gatgtacagg accttcaacg tgtaaatgta aatcggattg ttcctgcaag 240

tgaaacaaaa agaaagaaca ctcgaactta ttccatgcat caaagtattc attttgtatt 300

aaaattttca tgttcacatt gc 322

<210> 4

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacccgttct cttattaagc ttaggcagat caactgaaac gaataaaaat gcctggacct 60

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tgtagatgtt caggtacttg tgcgtgtgga tgtgattgta ctggcccgtc aacctgcaaa 240

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taaacaaact tttcatct 378

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtgttcagg tagctgtgcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacttgcagg aacaatccga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgtgcatgt cccggatgta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacgggccag tacaatcaca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagtgcccct gacaacagat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaccctacaa cgaccgcaat 20