一种提高日香桂抗寒性的基因及其应用

摘要

本发明公开了一种提高日香桂抗寒性的基因及其应用，属于植物分子生物学领域。本发明基于植物基因克隆技术从日香桂中分离、克隆出的两个NAC转录因子，分别命名为OfNAC6和OfNAC49基因，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1‑2所示，其表达蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.3‑4所示。在此基础上构建了超表达载体并利用花絮侵染法将上述基因导入拟南芥中，获得转基因植株，通过对低温处理前后的表型分析，结果表明非转OfNAC6/OfNAC49的植株的抗寒性明显低于转OfNAC6/OfNAC49的植株，表明OfNAC6/OfNAC49基因是潜在的抗寒育种基因。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种提高日香桂抗寒性的基因及其应用。

背景技术

桂花(Osmanthus fragrans)，是我国长江以南地区园林绿化中广泛应用的一种常绿木本树种，观赏与经济价值较高，然而对低温胁迫敏感，在高纬度地区的栽培与应用受到限制。因此，在桂花中发掘抗寒基因，对于桂花抗寒性的提升具有重要的意义。现有研究表明，NAC(NAM，ATAF1/2，CUC2)转录因子与植物的胁迫应答有关，但桂花中的NAC转录因子尚未被探索。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种提高日香桂抗寒性的基因；本发明所要解决的第二技术问题在于提供提高日香桂抗寒性的基因的表达蛋白；本发明所要解决的第三技术问题在于提供提高日香桂抗寒性的基因在改良植物对盐的耐受性的遗传育种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种提高日香桂抗寒性的基因，所述基因为OfNAC6、OfNAC49中的一种，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-2所示，其表达蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.3-4所示。

利用ExPASy软件分析，发现OfNAC6、OfNAC49的基因长度分别为1297bp、1294bp，分别编码298、297个氨基酸蛋白，该蛋白的分子量分别为34.31kDa、34.19kDa，等电点分别为9.08、6.46。

含有所述的提高日香桂抗寒性的基因的重组表达载体或重组菌。

所使用的载体为pBI121载体，将上述基因序列插入到pBI121载体的多克隆位点Xba I和BamH I之间，改造得到相应的重组表达载体。

所述的基因在改良植物抗寒性中的应用，所述植物为拟南芥或日香桂。

所述的基因在提高植物抗寒性中的应用，所述植物为拟南芥或日香桂。

进一步的，构建所述日香桂抗寒性基因的过表达载体，并将其通过稳定遗传转化的方式转化到植物中，应用于植物响应低温胁迫过程中的调控作用，筛选获得抗寒性提高的植物。

本申请采用的是花絮侵染法侵染拟南芥并获得转基因植株。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明基于植物基因克隆技术从日香桂中分离、克隆出的两个NAC转录因子，分别命名为OfNAC6和OfNAC49基因，在此基础上构建了超表达载体并利用花絮侵染法将上述基因导入拟南芥中，获得转基因植株，通过对低温处理前后的表型分析，结果表明非转OfNAC6/OfNAC49的植株的抗寒性明显低于转OfNAC6/OfNAC49的植株，表明OfNAC6/OfNAC49基因是潜在的抗寒育种基因。

附图说明

图1为目的基因OfNAC6和OfNAC49扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为目的基因OfNAC6和OfNAC49扩增片段与pBI121载体连接转化后菌落检测图；

图3为将测序得到的序列正确的质粒进行双酶切验证图；

图4为转化农杆菌GV3101后的菌检琼脂糖凝胶电泳图；

图5为转基因苗的DNA检测图；

图6为转基因苗的GUS检测图；

图7为植物冷处理前图；

图8为植物冷处理后图；

图9为植物冷处理后放置培养箱恢复图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本实施例采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总RNA。采用TaKaRaPrimeScript

实施例1构建日香桂OfNAC6/OfNAC49基因的超表达载体

(1)获取目的基因

根据已发表的桂花全基因组数据库，筛选得到NAC基因家族的全部成员，并把其中2个基因序列分别命名为OfNAC6和OfNAC49。

(2)设计引物

利用BioXM软件对上述基因的核苷酸全长序列进行酶切位点分析，选择Xba I和BamH I酶作为两个限制性内切酶。利用CE design软件设计引物。按要求进行相关信息的填写，具体包括载体上的酶切位点附近的序列、目的基因全长、按顺序填写2个酶切位点(5′端和3′端)，即可得到扩增引物。设计好的序列发送邮箱至捷瑞生物公司合成。

OfNAC6F：gagaacacgggggactctagaATGAACGGTGGTGATCAACAGTT；

OfNAC6R：ggactgaccacccggggatccAAAGGGCTTCTGCATGTACATCA。

OfNAC49F：gagaacacgggggactctagaATGAACGGTGGTGATCAACAGTT；

OfNAC49R：ggactgaccacccggggatccGAAGGGCTTCTGAGTGTAAATGAAC。

(3)载体双酶切

提前将pBI121载体从-80℃超低温冰箱中取出进行活化和摇菌，按照试剂盒提取pBI121载体质粒，随后进行双酶切实验，体系如下：Xba I酶1μL；BamH I酶1μL；Buffer 2μL；载体质粒XμL；ddH

其中X(μL)＝1000ng/载体质粒浓度(ng/μL)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h。将获得的双酶切后的载体进行琼脂糖电泳，然后利用试剂盒进行切胶回收。

(4)目的基因扩增

以稀释10倍的cDNA为模板，进行PCR扩增，体系如下：Forward Primer 1μL；Reverse Primer 1μL；cDNA 1μL；Prime STAR 10μL；ddH

每个基因做3个20μL体系。反应条件为：98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳(图1)，然后利用试剂盒进行切胶回收。

(5)连接转化

在离心管中配置连接转化体系：线性化载体XμL；插入目的片段YμL；5×CE IIBuffer 4μL；Exnase II 2μL；ddH

将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养30min，冰上2min。

转化：超净工作台内，用移液枪取5μL的连接产物于50μL的TreliefTM 5α感受态细胞，轻弹混匀，冰浴5min，42℃水浴60s，再冰浴2min，加250μL液体LB(不含Kana)，37℃，200rpm的摇床内孵育30min。

涂板：取200μL孵育后的菌液，用灭菌的玻璃棒均匀涂布在LB固体培养基上(内含50mg/L的Kana)并晾干，用封口膜后倒置在37℃恒温培养箱内培养12-14h。

(6)阳性单菌落检测和测序

当培养基上长出菌后，于超净工作台内进行单菌落检测。每个基因挑取8个饱满的单菌落，依序依次在含Kana抗性的LB固体培养基上进行备份，并用无菌牙签将相应的单菌落沾取至以下体系进行菌检：35sF 1μL；Gene R 1μL；Green Mix 10μL；ddH

其中，35S F：ACGCACAATCCCACTATCCTTC；Gene R见实施例1(2)小节引物设计。

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳(图2)，挑取3个正确的阳性菌落送测。

(7)双酶切验证

将测序得到的序列正确的质粒进行双酶切验证，体系如下：

Xba I酶1μL；BamH I酶1μL；Buffer 2μL；载体质粒XμL；ddH

其中X(μL)＝1000ng/载体质粒浓度(ng/μL)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h。将获得的双酶切后的载体进行琼脂糖电泳(图3)，检测双酶切情况。

实施例2转化农杆菌GV3101

(1)将保存在-80℃超盐冰箱内的GV3101感受态取出放在冰上融化。每33μL感受态加入1μL质粒，吸打混匀后依次冰浴20min、液氨速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

(2)加500μL无抗性的LB液体培养基，28℃，200rpm摇床上培养1h；

(3)培养完成后，将菌液6000rpm，离心1min，弃去部分上清液，留100μL均匀涂布于LB固体培养基上(内含50mg/L Kana)，封口膜密封，倒置于28℃培养箱中培养40-48h；

(4)菌检和备份：菌检中的目的条带正确且亮度一致(图4)，则将备份的板子中相对应的菌落挑入LB液体培养基(内含50mg/L Kana)中摇菌，再将菌液和50％甘油按3∶7的体积比保菌，液氮中速冻后保存在-80℃超盐冰箱内。

实施例3花絮侵染法侵染拟南芥并获得转基因植株

(1)植物材料准备：提前一天将拟南芥浇透水、并将拟南芥的种荚以及开放的花蕾全部剪掉，只剩下未开放的花序；

(2)侵染：第二天在侵染时再进行一下修剪，将新开的花序剪掉，将未开放的花序浸入已经准备好的侵染液中，60s后取出，如一株上的花序过多，可以分多次浸入，每一基因对应两盆拟南芥，在拟南芥的营养钵上做好对应基因的标记，侵染后放置1～2h，待侵染液完全干后，将拟南芥植株用锡箔纸包裹起来，放在生长箱中暗培养20～23h左右，然后揭掉锡箔纸，进行正常生长；

(3)二次侵染：为了更有效的提高转化效率，在7～10d后(或者拟南芥生长恢复健壮且开花较多)再进行一次侵染，第二次侵染除了不用修剪拟南芥的花蕾及种荚外，其他都参考第一次侵染的方法，二次侵染后至花期结束前，正常条件下培养拟南芥，待拟南芥种子成熟后，可适当控制水肥的供应以促进拟南芥种子的成熟，当种荚变黄可以收取T0代转基因种子。

(4)转基因苗的鉴定及T2转基因苗的获得：

转基因拟南芥T0代收种后，将种子消毒后放在添加有kana抗性的MS筛选培养基上培养，同时在不含kana抗性的MS培养基上培养野生型(WT)拟南芥种子做为对照，一周过后，初步认定能够在含有kana的培养基上正常生长且颜色为绿色的植株转基因成功，将幼苗从培养基移至盆栽基质中继续培养，待其生长良好后取叶片进行DNA检测(图5)以及GUS染色(图6)，检验OfNAC6/OfNAC49基因是否成功转入到植物中。按上述方式培养转基因苗至T2代。

实施例4 T2代转基因苗冷胁迫处理及表型观察

(1)养苗：将T2种子消毒后，放置在有kana抗性的MS筛选培养基上培养，同时将野生型的拟南芥种子放置在无kana抗性的MS筛选培养基上培养作为对照，培养10天左右将转基因小苗和野生型小苗移植到盆钵中继续生长，生长两周后进行冷胁迫处理。

(2)冷胁迫：将移植到盆钵中生长两周的转基因株系(6-2、6-3、6-4、6-5、6-6、6-9、49-4、49-5)和野生型苗(WT)从培养箱中拿出，拍照记录(图7)，然后，放置到-8℃冰箱中冷处理30h后拿出并拍照纪录(图8)后，放回至培养箱。

(3)观察：将冷胁迫后的苗放回培养箱生长并定期浇水，看其恢复的情况，并拍照记录(图9)。

序列表

<110> 南京林业大学，大千生态环境集团股份有限公司

<120> 一种提高日香桂抗寒性的基因及其应用

<130> 1

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> OfNAC6基因(Artificial)

<400> 1

atgaacggtg gtgatcaaca gttgaattta ccggcggggt ttcggttcca tccgacggat 60

gaggagctcg tggtgcacta cctctgccgt aaatgtgcag ggcagccaat cgccgtccca 120

gttatagctg acctcgatct ttataaattt gacccttggg atcttcctgg tatggctttg 180

tatggtgaaa aagagtggta cttcttttct cctagagacc ggaagtatcc caatggttca 240

cggccgaacc gggcagctcg gacggggtac tggaaggcca ccggagctga taagccagtg 300

gggaagccaa agccactgtg cataaagaag gctttggtgt tctatgcagg aaaagctccc 360

agagggctca aaaccaactg gattatgcac gaatatcgac tagccaatgt cgatagatct 420

gccgggaaga aaaacgattc taggcttgat gattgggtgt tgtgccgact atacaacaag 480

aaaggtactc ttgaaaaaca tcacattaat gttgaccaga atatgttgca attttcagat 540

agtaaaaaac agaaaccaaa attggatggt ttcgtatata atgggatggt aacacaaggg 600

cagccggccc tagcacctcg aatagtgaag aatgcctact tgcattctga agcgtctgaa 660

tcagtcccta agtttcatac aaactcgagt agttttgagc atgcattatc tcccgagtac 720

aagggtgata aggaggtcgt aagtgaacca acttggaatg gctttcagaa accccttgat 780

tttcagctta attacaagga tggcttccaa tacgatccct tcatgtctca aatgcagtac 840

aatgatcaat attctttgtt cgacaactcg ttgatgtaca tgcagaagcc cttttga 897

<210> 2

<211> 894

<212> DNA

<213> OfNAC49基因(Artificial)

<400> 2

atgaacggtg gtgatcaaca gttgaattta ccggcggggt ttcggttcca tccgacggat 60

gaggagctgg tggtgcatta tctctgtcgg aaatgtgccg gggagccaat cgccgtccca 120

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agaggtgtca aaaccaactg gattatgcat gaataccgtc tagccaatgt cgacagatca 420

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gatcattttt ctttgttcga cgatgtgttc atttacactc agaagccctt ctaa 894

<210> 3

<211> 298

<212> PRT

<213> OfNAC6基因的表达蛋白(Artificial)

<400> 3

Met Asn Gly Gly Asp Gln Gln Leu Asn Leu Pro Ala Gly Phe Arg Phe

1 5 10 15

His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His Tyr Leu Cys Arg Lys Cys

20 25 30

Ala Gly Gln Pro Ile Ala Val Pro Val Ile Ala Asp Leu Asp Leu Tyr

35 40 45

Lys Phe Asp Pro Trp Asp Leu Pro Gly Met Ala Leu Tyr Gly Glu Lys

50 55 60

Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser

65 70 75 80

Arg Pro Asn Arg Ala Ala Arg Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala

85 90 95

Asp Lys Pro Val Gly Lys Pro Lys Pro Leu Cys Ile Lys Lys Ala Leu

100 105 110

Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Arg Gly Leu Lys Thr Asn Trp Ile

115 120 125

Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asn Val Asp Arg Ser Ala Gly Lys Lys

130 135 140

Asn Asp Ser Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys

145 150 155 160

Lys Gly Thr Leu Glu Lys His His Ile Asn Val Asp Gln Asn Met Leu

165 170 175

Gln Phe Ser Asp Ser Lys Lys Gln Lys Pro Lys Leu Asp Gly Phe Val

180 185 190

Tyr Asn Gly Met Val Thr Gln Gly Gln Pro Ala Leu Ala Pro Arg Ile

195 200 205

Val Lys Asn Ala Tyr Leu His Ser Glu Ala Ser Glu Ser Val Pro Lys

210 215 220

Phe His Thr Asn Ser Ser Ser Phe Glu His Ala Leu Ser Pro Glu Tyr

225 230 235 240

Lys Gly Asp Lys Glu Val Val Ser Glu Pro Thr Trp Asn Gly Phe Gln

245 250 255

Lys Pro Leu Asp Phe Gln Leu Asn Tyr Lys Asp Gly Phe Gln Tyr Asp

260 265 270

Pro Phe Met Ser Gln Met Gln Tyr Asn Asp Gln Tyr Ser Leu Phe Asp

275 280 285

Asn Ser Leu Met Tyr Met Gln Lys Pro Phe

290 295

<210> 4

<211> 297

<212> PRT

<213> OfNAC49基因的表达蛋白(Artificial)

<400> 4

Met Asn Gly Gly Asp Gln Gln Leu Asn Leu Pro Ala Gly Phe Arg Phe

1 5 10 15

His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His Tyr Leu Cys Arg Lys Cys

20 25 30

Ala Gly Glu Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Val Asp Leu Asp Leu Tyr

35 40 45

Lys Phe Asp Pro Trp Asp Leu Pro Gly Met Ala Leu Tyr Gly Glu Lys

50 55 60

Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser

65 70 75 80

Arg Pro Asn Arg Ala Ala Arg Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala

85 90 95

Asp Lys Pro Val Gly Lys Pro Lys Pro Leu Gly Ile Lys Lys Ala Leu

100 105 110

Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Arg Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile

115 120 125

Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asn Val Asp Arg Ser Ala Gly Lys Lys

130 135 140

Asn Asn Ser Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys

145 150 155 160

Arg Gly Thr Leu Glu Lys His Tyr Asn Val Asp Gln Lys Thr Leu Gln

165 170 175

Phe Ser Asp Ser Glu Glu Gln Lys Pro Lys Leu Asp Gly Leu Val Tyr

180 185 190

Asn Gly Thr Val Thr Gln Val Gln Pro Ala Gln Glu Pro Gln Leu Val

195 200 205

Lys Asn Asp Tyr Leu Arg Ser Glu Ala Ser Glu Ser Val Pro Lys Leu

210 215 220

His Thr Asp Ser Cys Ser Ser Glu His Ala Leu Ser Pro Glu Phe Met

225 230 235 240

Gly Asp Lys Glu Val Gln Ser Val Pro Thr Trp Asn Gly Phe Glu Lys

245 250 255

Pro Leu Asp Tyr Gln Leu Asn Tyr Glu Asp Gly Phe Gln Tyr Asp His

260 265 270

Phe Thr Ser Gln Thr Gln Tyr Thr Asp His Phe Ser Leu Phe Asp Asp

275 280 285

Val Phe Ile Tyr Thr Gln Lys Pro Phe

290 295

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> OfNAC6F(Artificial)

<400> 5

gagaacacgg gggactctag aatgaacggt ggtgatcaac agtt 44

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> OfNAC6R(Artificial)

<400> 6

ggactgacca cccggggatc caaagggctt ctgcatgtac atca 44

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

gagaacacgg gggactctag aatgaacggt ggtgatcaac agtt 44

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> OfNAC49R(Artificial)

<400> 8

ggactgacca cccggggatc cgaagggctt ctgagtgtaa atgaac 46