一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法

摘要

本发明公开了一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法，以里氏木霉为发酵菌种，通过控制发酵条件：底物形式、诱导底物浓度、发酵时间和转速，实现阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖的同步积累。本发明可大大简化阿拉伯低聚木糖生产工艺，有助于阿拉伯低聚木糖产业的高附加值和规模化发展。

说明书

技术领域

本发明属生物化学中微生物培养与生物酶水解技术领域，具体涉及一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法。

背景技术

车前子作为我国重要的中草药资源，应用历史悠久，有清热解毒、凉血利尿、祛痰止咳、抗炎杀菌等功效。近年来对车前子资源的综合开发备受研究者关注，其中车前子壳所包含的25％-35％强吸水、高粘度的水溶性多糖，已被开发成水溶性膳食纤维、无糖膳食等系列产品。研究表明，车前子壳中的水溶性多糖主要成分为阿拉伯木聚糖，隶属于半纤维素家族的重要成员，其结构主要由木糖经β-1,4-糖苷键形成木聚糖主链，并在主链木聚糖的C2-OH和C3-OH位置被随机取代，形成α-1,2/α-1,3-阿拉伯糖支链。为实现车前子资源的高附加值利用，车前子阿拉伯木聚糖资源的精深加工技术正如火如荼的进行。阿拉伯低聚木糖作为益生元家族的重要成员，可由阿拉伯木聚糖经物理、化学、生物等方法实现定向降解制备获得，为车前子资源的高附加值开发提供新思路。

生物酶法是已知制备低聚糖最为可行的制备方法，阿拉伯木聚糖水解酶系中阿拉伯糖苷酶、木糖苷酶和木聚糖酶的协同作用方可实现阿拉伯木聚糖的高效水解。目前，低聚木糖的酶水解制备过程均包括以下两个步骤：(1)木聚糖水解酶系的制备；(2)木聚糖的定向水解。对于步骤(1)而言，木聚糖水解酶系的制备能力与诱导底物、产酶菌种、产酶条件等因素有关；对于步骤(2)而言，木聚糖的定向水解与水解酶添加量、底物浓度、水解条件等因素有关，且产酶条件与水解条件差距较大，无法将步骤(1)与步骤(2)进行有机整合，因而在低聚木糖生产工厂中均需建造木聚糖酶系制备车间和低聚木糖水解车间，工厂投资成本和运营成本较大。

发明内容

针对现有技术生物酶法制备低聚糖过程均包括酶制剂生产和定向酶水解两个步骤，无法实现阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖同步制备的瓶颈问题，本发明提出了一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的思路是，微生物在利用诱导底物时，通过分泌相应水解酶系，将高分子诱导物逐级降解成小分子诱导物、低聚糖，最后水解为单糖后才可为微生物的生理代谢提供能量。因而，如能将高分子诱导物降解过程控制在低聚糖阶段，即可在发酵条件下实现低聚糖的有效积累。本发明提出以车前子为产酶诱导碳源，通过调整发酵条件、体系粘度等因素，达成阿拉伯木聚糖水解酶高效诱导目的的同时，实现阿拉伯低聚木糖同步累积。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法，以里氏木霉作为发酵菌种，在以车前子作为诱导碳源的产酶培养基中，进行半固态发酵，同步制备得到阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖。

其中，所述的车前子为平车前子或大车前子，所述的车前子为整粒车前子、车前子种皮或车前子多糖中的任意一种，优选的为车前子多糖。

具体的，所述的车前子多糖为经热水抽提和冷冻干燥处理获得的车前子多糖。

其中，所述的车前子作为诱导碳源的质量浓度范围为2-50g/L，优选的为20-40g/L，最优选的为30g/L。

在本发明中，所述的产酶培养基包含以下营养物质：车前子2-50g/L、葡萄糖1.00g/L、硫酸铵14.00g/L、尿素3.00g/L、磷酸二氢钾20.00g/L、硫酸镁1.50g/L、氯化钙4.00g/L、FeSO

在本发明中，所述的里氏木霉T.reesei Rut C-30，购买于美国ATCC菌种保藏中心，保藏编号为ATCC56765。通过无菌水分散和血小球计数板计数方法制备得到里氏木霉孢子悬浮液。具体制备步骤如下：取一支新鲜成熟的里氏木霉菌种试管斜面培养基，加入一定量的无菌水，孢子数量控制为1.0×10

上述里氏木霉孢子悬浮液按5％的接种量与产酶培养基混合均匀，通过控制半固态发酵参数，制备发酵液。

其中，所述的半固态发酵控制参数为：发酵液初始粘度10-5000cps，第一天发酵温度30℃，第二天将发酵温度调整至28℃，继续发酵时间3-8d，摇床转速设置为0-500转/min。优选的发酵时间为5-7d，摇床转速为100-400转/min。最优选的发酵时间为6d，摇床转速为200转/min。

在本发明中，半固态发酵结束后经固液分离得到的发酵上清液，发酵上清液经过超滤处理，截留液为阿拉伯木聚糖水解酶，透过液为阿拉伯低聚木糖。

其中，所述的阿拉伯木聚糖水解酶为木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶中的任意一种或几种的组合。

其中，所述的超滤处理选择5000-10000Da任意分子量的超滤离心管，优选的为5000Da超滤离心管。

其中，在进行超滤处理时使用超滤离心管，将超滤离心管于5000转/min离心60min后，测量透过液体积，用去离子水补充截留液体积至初始体积，再次于5000转/min离心60min，重复上述步骤3次，将3次透过液混合均匀后测定透过液总体积和透过液中阿拉伯低聚木糖的含量，测定截留液体积和截留液中阿拉伯木聚糖水解酶的活力。

具体的，发酵上清液经超滤处理后，透过液中阿拉伯低聚木糖的含量和截留液中阿拉伯木聚糖水解酶的活力测定方法如下：

(1)透过液中阿拉伯低聚木糖的含量测定方法：将透过液与8％稀硫酸按体积比1:1混合均匀，于121℃下水解60min，将阿拉伯低聚木糖完全水解为木糖和阿拉伯糖，利用高效液相色谱仪测定稀硫酸水解液中的木糖和阿拉伯糖的浓度。具体的测试条件如下：色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪1260；色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H；检测器为示差检测器；流动相为5mmol/L的硫酸溶液；流速为0.6mL/min；柱温55℃；进样体积20.0μL。阿拉伯低聚木糖含量的测定计算公式如下：

式中：Yield阿拉伯低聚木糖为透过液中阿拉伯低聚木糖的浓度，g/L；C为半固态发酵液中添加的阿拉伯木聚糖的质量浓度，g/L；0.05为半固态发酵液的总体积，L；CAla-1为酸水解前截留液中阿拉伯糖的质量浓度，g/L；CAla-2为酸水解液中阿拉伯糖的质量浓度，g/L；CXyl-1为酸水解前截留液中木糖的质量浓度，g/L；CXyl-2为酸水解液中木糖的质量浓度，g/L；V为用于酸水解的截留液的总体积，L；2V为酸水解液的总体积，L；0.88为阿拉伯低聚木糖与单糖之间的转化系数。

(2)截留液中木糖苷酶活力和阿拉伯糖苷酶的活力测定方法：于15mL试管中加入0.1mL适当稀释的发酵上清液和0.9mL 1mmol/L对硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)/对硝基苯酚-α-D-木糖苷(pNPA)溶液于50℃下保温10min后，立即加入2.0mL 1mol/L的Na

(3)截留液中木聚糖酶的活力测定方法：于25mL试管中加入0.9mL的1.0％的桦木木聚糖底物溶液，50℃预热5min，加入0.1mL适当稀释的发酵上清液，于50℃下反应30min后，立即加入3.0mL DNS溶液终止反应，随后沸水浴中煮沸5min，冷却后定容到25mL，充分摇匀，使用分光光度计(日本岛津UV-2450)于550nm下测定反应混合物的吸光度，并根据吸光度与还原糖的线性相关关系，计算反应生成的还原糖的浓度。

上述一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法在生产中的应用也在本发明的保护范围之内。

有益效果：

与现有技术相比，本发明利用里氏木霉作为发酵菌种，以车前子为诱导碳源，采用半固态发酵方式，通过控制半固态发酵条件，在获得阿拉伯木聚糖水解酶的同时，实现半固态发酵液中阿拉伯低聚木糖的高含量积累，可有效简化阿拉伯低聚木糖生产工艺，降低生产成本。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为不同诱导底物对发酵初始粘度、阿拉伯低聚木糖得率和阿拉伯木聚糖水解酶系同步制备的影响。

图2为不同车前子多糖添加浓度对发酵初始粘度、阿拉伯低聚木糖得率和阿拉伯木聚糖水解酶系同步制备的影响。

图3为不同发酵时间对发酵液粘度、阿拉伯低聚木糖得率和阿拉伯木聚糖水解酶系同步制备的影响。

图4为不同转速对发酵液粘度、阿拉伯低聚木糖得率和阿拉伯木聚糖水解酶系同步制备的影响。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

分别以玉米芯木聚糖、整粒车前子、车前子种皮和车前子多糖为诱导碳源，研究对阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖进行同步制备效果的影响，包括以下步骤：

(1)分别以玉米芯木聚糖、整粒车前子、车前子种皮和车前子多糖为诱导碳源，诱导碳源添加量为20.00g，葡萄糖1.00g，硫酸铵14.00g，尿素3.00g，磷酸二氢钾20.00g，硫酸镁1.50g，氯化钙4.00g，FeSO

(2)将里氏木霉孢子悬浮液(控制孢子数量为1.0×10

(3)将发酵上清液转移至分子量为5000Da的超滤离心管，于5000转/min离心60min后，测量透过液体积，用去离子水补充截留液体积至初始体积，再次于5000转/min离心60min，重复上述步骤3次。

(4)将3次透过液混合均匀后测定透过液总体积和透过液中阿拉伯低聚木糖的含量。

(5)测定截留液体积和截留液中阿拉伯木聚糖水解酶中木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的活力。

结果表明，不同形式的诱导碳源对阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖的同步制备效果存在较大区别。从图1中可知，当以车前子种皮和车前子多糖为诱导碳源时，整个发酵体系的前期粘度较高，阿拉伯低聚木糖得率分别为31.32％和55.27％，此时发酵液中木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的活性较高，木糖苷酶的活力较低。此结果表明，发酵体系初始粘度较大，不利于里氏木霉的快速增殖，此时存在明显的底物抑制，因而里氏木霉分泌出木聚糖水解酶的酶水解效率受到限制，因而酶水解速率缓慢，且体系中木糖苷酶活力较少，有助于阿拉伯低聚木糖的积累。

实施例2：

以车前子多糖为诱导碳源，控制车前子多糖的添加量分别为5、10、20、30、40、50g/L，研究发酵体系初始粘度和底物浓度对阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖同步制备效果的影响，包括以下步骤：

(1)分别称取车前子多糖5.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00g，葡萄糖1.00g，硫酸铵14.00g，尿素3.00g，磷酸二氢钾20.00g，硫酸镁1.50g，氯化钙4.00g，FeSO

(2)将里氏木霉孢子悬浮液(控制孢子数量为1.0×10

(3)将发酵上清液转移至分子量为5000Da的超滤离心管，于5000转/min离心60min后，测量透过液体积，用去离子水补充截留液体积至初始体积，再次于5000转/min离心60min，重复上述步骤3次。

(4)将3次透过液混合均匀后测定透过液总体积和透过液中阿拉伯低聚木糖的含量。

(5)测定截留液体积和截留液中阿拉伯木聚糖水解酶中木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的活力。

结果如图2所示，当诱导底物浓度较低为5g/L时，整个发酵体系粘度较低，发酵液呈现流体状态，里氏木霉充分利用发酵液中的营养物质实现快速增殖，当葡萄糖等可直接利用碳源物质的消耗殆尽时，里氏木霉才会分泌阿拉伯木聚糖水解酶，其中木糖苷酶活力明显高于其他底物浓度，可将阿拉伯木聚糖水解成木糖和阿拉伯糖等可直接代谢碳源，但是不利于阿拉伯低聚木糖的积累。随着诱导底物浓度的增加，发酵液初始粘度逐渐增加，当诱导底物浓度增加至10-50g/L时，发酵液呈现半固体凝胶状，里氏木霉仅于半固态培养基表面缓慢生长，此时底物抑制微生物生长和酶水解效率。随着培养时间的延长，微生物增长和木聚糖水解酶分泌的增多，半固态培养基中阿拉伯木聚糖被逐步降解。当诱导底物浓度为30g/L时，发酵第5d时发酵液中阿拉伯低聚木糖得率、木聚糖酶酶活力、阿拉伯糖苷酶活力和木糖苷酶活力达到最大值，分别为57.15％、15.27IU/mL、10.44IU/mL和0.72IU/mL。因而，优选底物浓度在20-40g/L时，此底物浓度下有利于阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖的同步制备。

实施例3：

以车前子多糖为诱导碳源，车前子多糖的添加量为20g/L，研究发酵时间对阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖同步制备效果的影响，包括以下步骤：

(1)以里氏木霉为产酶菌种，分别称取车前子多糖20.00g，葡萄糖1.00g，硫酸铵14.00g，尿素3.00g，磷酸二氢钾20.00g，硫酸镁1.50g，氯化钙4.00g，FeSO

(2)将里氏木霉孢子悬浮液(控制孢子数量为1.0×10

(3)将发酵上清液转移至分子量为5000Da的超滤离心管，于5000转/min离心60min后，测量透过液体积，用去离子水补充截留液体积至初始体积，再次于5000转/min离心60min，重复上述步骤3次。

(4)将3次透过液混合均匀后测定透过液总体积和透过液中阿拉伯低聚木糖的含量。

(5)测定截留液体积和截留液中阿拉伯木聚糖水解酶中木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的活力。

结果如图3所示，随着发酵时间的延长，发酵液粘度呈现显著降低的趋势，发酵时间在0-8d范围内，发酵液粘度由初始的1526cps降低至3.47cps。随着发酵时间的延长，发酵液中阿拉伯低聚木糖得率和木聚糖水解酶系呈现先增加后降低的趋势，发酵时间为6d时实现最优选，此时条件下阿拉伯低聚木糖得率、木聚糖酶酶活力、阿拉伯糖苷酶活力和木糖苷酶活力达到最大值，分别为59.24％、13.79IU/mL、9.85IU/mL和0.89IU/mL。随着发酵时间的进一步延长，发酵液中木糖苷酶活力逐渐增加，阿拉伯低聚木糖被彻底水解成木糖和阿拉伯糖，发酵时间过长不利于阿拉伯低聚木糖的积累，因而将发酵时间优选为5-7d。

实施例4：

以车前子多糖为诱导碳源，车前子多糖的添加量为20g/L，研究不同转速对阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖同步制备效果的影响，包括以下步骤：

(1)以里氏木霉为产酶菌种，分别称取车前子多糖20.00g，葡萄糖1.00g，硫酸铵14.00g，尿素3.00g，磷酸二氢钾20.00g，硫酸镁1.50g，氯化钙4.00g，FeSO

(2)将里氏木霉孢子悬浮液(控制孢子数量为1.0×10

(3)将发酵上清液转移至分子量为5000Da的超滤离心管，于5000转/min离心60min后，测量透过液体积，用去离子水补充截留液体积至初始体积，再次于5000转/min离心60min，重复上述步骤3次。

(4)将3次透过液混合均匀后测定透过液总体积和透过液中阿拉伯低聚木糖的含量。

(5)测定截留液体积和截留液中阿拉伯木聚糖水解酶中木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶的活力。

结果如图4所示，里氏木霉为好氧丝状真菌，当转速为0转/min时，发酵液处于半固体状态，里氏木霉仅在发酵液表面生长，发酵液粘度变化较小，由初始1526cps降低至513cps，此时阿拉伯低聚木糖得率、木聚糖酶酶活力、阿拉伯糖苷酶活力和木糖苷酶活力较低，分别为5.34％、1.38IU/mL、1.41IU/mL和0.26IU/mL。随着转速的逐渐增加，里氏木霉菌丝与发酵液充分混匀，体系中氧传质较好，因而当转速为100-400转/min时，阿拉伯低聚木糖得率、木聚糖酶酶活力、阿拉伯糖苷酶活力均较高，此时有利于阿拉伯木聚糖水解酶和阿拉伯低聚木糖的同步制备。当转速达到500转/min时，虽然发酵液传质效率较好，但转速过大会导致酶蛋白的失活，发酵液粘度仅降低至319cps，此时阿拉伯低聚木糖得率、木聚糖酶酶活力、阿拉伯糖苷酶活力和木糖苷酶活力较低，分别为18.98％、7.75IU/mL、6.51IU/mL和4.63IU/mL，高木糖苷酶活力不利于阿拉伯低聚木糖的积累。因而不利于阿拉伯低聚木糖和阿拉伯木聚糖水解酶系的同步制备，因而将转速优选为100-400转/min，最优选的为200转/min。

本发明提供了一种阿拉伯木聚糖水解酶与阿拉伯低聚木糖同步制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。