一株羊驼源纳米抗体及其应用

摘要

本发明涉及一株羊驼源纳米抗体及其应用，具体涉及一种与SARS‑CoV‑2RBD结合的羊驼源纳米抗体及其应用，包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的CDR：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，以及氨基酸序列如SEQID NO:3所示的CDR3。本发明的S43纳米抗体与SARS‑CoV‑2的结合常数为1.2E‑10±1.4E‑11M，能有效抑制SARS‑CoV‑2假病毒感染。本发明的S43纳米抗体有着预防、治疗和/或检测SARS‑CoV‑2感染的临床应用价值。

说明书

交叉引用

本申请要求于2021年9月16日提交的、申请号为202111087998.X、发明名称为“一株羊驼源纳米抗体及其应用”的发明专利申请的优先权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一株羊驼源纳米抗体及其应用，更具体地，涉及一种与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防、治疗和/或检测新冠病毒感染的药物中的应用。

背景技术

中和抗体，该药物主要是通过与病原微生物表面的抗原结合，阻止病原微生物表达的特定分子与细胞表面受体结合，达到“中和”的效果。SARS-CoV和SARS-CoV-2 病毒表面都具有糖基化的刺突蛋白(spike protein,S)，该S蛋白能与宿主细胞受体蛋白 ACE2相互作用并触发膜融合，因此阻断S蛋白与ACE2的结合是治疗新冠病毒感染的有效途径。

然而旨在阻断病毒与宿主细胞受体的抗体策略，仍需要进一步优化和升级。一方面，新冠病毒这样的RNA病毒具有易突变、易发生免疫逃逸等特点，单一特异性抗体很难满足长久的治疗需求。另外，常规的单克隆抗体因其分子量过大，在实际应用中也存在一定的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的表达载体、其制备方法、转化的细胞以及包含上述的药物组合物，以及它们在制备预防或新冠病毒的药物中的应用。本发明的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段为高中和活性的纳米抗体，与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合能力强，能有效抑制SARS-CoV-2感染，该纳米抗体具有分子量小(～15kDa)、免疫原性小、更好的溶解度和稳定性、较长的CDR3区的优点，可以雾化给药，能直达肺部，起效更快，为新冠或其他冠状病毒感染提供了潜在的治疗策略。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，所述重链可变区包含以下的CDR：

氨基酸序列如SEQ ID NO:1(即，GFTLDYYAIG)所示的CDR1，

氨基酸序列如SEQ ID NO:2(即，CISSNNSTYYADSVKG)所示的CDR2，

以及氨基酸序列如SEQ ID NO:3(即，EPDYSGVYYYTCGWTDFGS)所示的CDR3。

进一步地，所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4，所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。

在一个优选的实施方案中，所述FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4(即，QVQLQESGGGLVQPGGSLRLTCAPS)、SEQ ID NO:5(即，WFRQAPGKEREGVS)、 SEQ ID NO:6(即，RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA)和SEQ ID NO:7 (即，WGQGTQVTVSS)所示。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示：

第二方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码所述的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。

进一步地，所述多核苷酸为DNA或mRNA。

进一步地，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCT CTGAGACTCACCTGTGCACCCTCTGGATTCACTTTGGATTATTATGCCATAGGCTGG TTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGGGGTCTCATGTATTAGTAGTAATAA TAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACG CCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGT TTATTACTGTGCAGCAGAACCAGACTATAGCGGTGTTTACTACTACACCTGCGGATG GACTGACTTTGGTTCCTGGGGCCAGGGGACGCAGGTGACCGTGAGCTCT。

第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含所述的多核苷酸。

进一步优选地，所述多核苷酸还包含与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。例如组氨酸标签、终止密码子等。

第四方面，本发明提供一种表达载体，其包含所述的核酸构建体。

第五方面，本发明提供了一种转化的细胞，其包括如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。

第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

进一步优选地，所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。

进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。

进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂。

进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。

第七方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物在制备预防、治疗和/或检测新冠病毒感染的药物中的应用。

优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。

进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)毒株。

第八方面，本发明提供了一种预防或治疗新冠病毒感染的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的转化的细胞或如上述第六方面所述的药物组合物。

优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。

进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)毒株。

本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

第九方面，本发明提供了一种检测新冠病毒的方法，其包括使用如上述第一方面所述的与SARS-CoV-2RBD结合的羊驼源纳米抗体或其抗原结合片段。

优选地，所述新冠病毒为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。进一步优选地，所述SARS-CoV-2变异毒株为Alpha(B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和/或Delta(B.1.617.2)毒株。

本发明针对新冠病毒进行纳米抗体药物开发，通过用SARS-CoV-2S蛋白免疫羊驼、构建抗体文库、利用噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体等，筛选到以高亲和力特异性结合SARS-CoV-2RBD的纳米抗体，本文命名为S43纳米抗体。本发明的S43纳米抗体能以高亲和力与SARS-CoV-2RBD结合，其结合常数为1.2E-10±1.4E-11M，并且在假病毒中和实验中，能以高中和活性中和SARS-CoV-2假病毒，这些均表明：S43纳米抗体是能够以高亲和力与SARS-CoV-2RBD结合的、并具有高中和活性的新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)羊驼源纳米抗体。

本发明为新型冠状病毒(包括原始毒株以及一系列变异毒株)的临床预防、治疗和检测提供了潜在的纳米抗体新药。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例1的SARS-CoV-2S蛋白分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图2是本发明实施例1的SARS-CoV-2RBD蛋白分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图3是本发明实施例4的S43纳米抗体的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定结果示意图；

图4是本发明实施例5测定的S43纳米抗体结合SARS-CoV-2RBD的动力学曲线示意图；其中，虚线是指原始数据，实线是指拟合后的动力学曲线；

图5是本发明实施例6测定的S43纳米抗体中和VSV-SARS-CoV-2假病毒感染的效果示意图，其中，其中，A为S43纳米抗体中和原始毒株SARS-CoV-2WT的假病毒感染的效果图；B为S43纳米抗体中和SARS-CoV-2变异毒株Alpha(B.1.1.7)的假病毒感染的效果图；C为S43纳米抗体中和SARS-CoV-2变异毒株Beta(B.1.351)的假病毒感染的效果图；D为S43纳米抗体中和SARS-CoV-2变异毒株Gamma(P.1)的假病毒感染的效果图；E 为S43纳米抗体中和SARS-CoV-2变异毒株Kappa(B.1.617.1)的假病毒感染的效果图；F 为S43纳米抗体中和SARS-CoV-2变异毒株Delta(B.1.617.2)的假病毒感染的效果图。

图6显示了本发明实施例9中所检测的S43纳米抗体在雾化前、后对新冠病毒原始毒株假病毒的中和活性。

图7显示了本发明实施例10中所检测的S43纳米抗体在小鼠体内预防新冠病毒感染的功效。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

以下，对本发明进行详述。

定义

“纳米抗体”，即“重链单域抗体”，该类抗体只包含一个重链可变区(VHH，variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，相比于其他抗体，轻链天然缺失。

由于纳米抗体自身的生物物理优势，可以很容易地对其进行雾化并通过吸入器直接递送到肺部，从而治疗呼吸系统病毒引起的感染，被认为是非常有潜力的抗体类药物。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的纳米抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。

本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基、抗生素和牛奶等化学材料均为市售产品，例如，TRIzol购自Invitrogen，Superscript II First-Strand Synthesis Systemfor RT-PCR试剂盒购自Invitrogen。

一些常用的生物材料，如感受态细胞、载体、辅助噬菌体、待转化的细胞等也为市售产品，例如，pCAGGS载体购自MiaoLingPlasmid，293F细胞、HEK293T细胞等购自 ATCC；电感受态E.coli TG1细胞购自Lucigen，VCSM13辅助噬菌体购自StrataGene、质粒pMES4购自Addgene；protein A芯片购自GE Healthcare；Vero细胞购自ATCC CCL81。

一些合成类生物材料，例如引物、序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成，例如，本发明中的引物(SED ID NO:14～19)由北京擎科生物科技有限公司合成。

本发明的SARS-CoV-2S蛋白、SARS-CoV-2RBD蛋白为发明者实验室获得(参见实施例1)。

实施例1：SARS-CoV-2S和SARS-CoV-2RBD的表达与纯化

在SARS-CoV-2S蛋白编码序列(如SEQ ID NO:10所示)的3’端连上三聚体标签(如SEQ ID NO:11所示)和8个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子(TGA)，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染至293F 细胞中，进行SARS-CoV-2S-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap

同样地，在SARS-CoV-2RBD蛋白编码序列(如SEQ ID NO:12所示)的3’端连上6 个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子(TGA)，通过限制性内切酶位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染至293F细胞中，进行SARS-CoV-2 RBD-his蛋白的表达。含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(HisTrap

在SARS-CoV-2RBD蛋白编码序列(如SEQ ID NO:12所示)的3’端连上人源Fc标签(hFc)的编码序列(如SEQ ID NO:13所示)及翻译终止密码子，通过连接EcoRI和XhoI 构建入pCAGGS载体中，转染至293F细胞中，进行SARS-CoV-2RBD-hFc蛋白的表达。

实施例2：羊驼免疫和抗体文库构建

实施例1中制备的带有6个组氨酸标签的SARS-CoV-2S蛋白200μg，用PBS稀释至终体积1mL，加1ml完全弗氏佐剂乳化5min，皮下多点注射进行免疫。之后每两周进行一次免疫，并改用MF59水溶性佐剂乳化S蛋白，第五次免疫后的第12天，采集 50-60mL的血液，分离PBMCs(外周血单个核细胞)。将分离的PBMCs加入1mL TRIzol (购自Invitrogen)，按照说明书的步骤提取总RNA。以提取的总RNA为模板，使用 Superscript II First-StrandSynthesis System for RT-PCR试剂盒(购自Invitrogen)，用随机引物oligo-dT

使用双酶切法，通过限制性酶切位点PstⅠ和BstEⅡ，将VHHs片段连接入质粒pMES4。将纯化的克隆载体和电感受态E.coli TG1细胞混合，使用电转仪(BIO-RAD电转化仪MicroPulser)将克隆载体转化入电感受态E.coli TG1细胞，全部涂布在含有氨苄青霉素的选择性培养基上，37℃过夜培养后，收集所有的菌落于LB培养基中，离心并弃上清，用 LB重悬细胞，此为抗体文库。

表1、反应引物

实施例3：噬菌体展示技术筛选特异性的纳米抗体

取实施例2已转染重组质粒的E.coli TG1，以感染复数(multiplicity ofinfection,MOI) 约为20的比例，加入VCSM13辅助噬菌体，过夜培养后，4000rpm离心，取上清，0.22 μm的膜过滤后，按体积比1:4加入PEG6000/NaCl，混合后，4℃下放置至少1小时，8000×g 离心30min，弃上清，沉淀用PBS重悬，即为收集的噬菌体颗粒，测定噬菌体效价。

将2×10

表2、反应引物

实施例4：S43纳米抗体的表达

为了使S43的重链可变区更加完整，在实施例3获得的S43的核心编码序列的5’端连上QVQLQ的编码序列(CAGGTGCAGCTGCAG)，3’端连上QVTVSS的编码序列(CAGGTGACCGTGAGCTCT)，得到如SEQ ID NO:9的核苷酸序列，即本申请的S43纳米抗体的编码序列，然后在其后连上6个组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列及翻译终止密码子TGA，通过限制性酶切位点EcoRI和XhoI，将其构建入pCAGGS载体中，转染293F细胞，培养5天后，收集上清，经过5000rpm离心30min后，经过0.22μm滤膜过滤后，经镍离子亲和层析(HisTrap

实施例5：表面等离子共振技术检测抗体与SARS-CoV-2RBD的结合能力

表面等离子共振分析利用Biacore 8K(Biacore Inc.)进行。具体步骤如下：

选用protein A芯片(购自GE Healthcare)，通过protein A芯片与hFc的亲和力将实施例 1得到的SARS-CoV-2RBD-hFc蛋白固定在芯片上，固定量约为100RU，用PBST缓冲液(2.7mM KCl，137mM NaCl，4.3mM Na

表3、抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白结合的动力学常数

实施例6：SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装

1)分别将编码SARS-CoV-2原始毒株(WT)及变异毒株(Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)和Delta(B.1.617.2))的S蛋白后18位氨基酸的基因去掉，S蛋白其余序列进行合成(由苏州金唯智提供合成服务)，得到 SARS-CoV-2-WT-S-del18、B.1.1.7-S-del18、B.1.351-S-del18、P.1-S-del18、B.1.617.1-S-del18、B.1.617.2-S-del18基因的核苷酸序列，序列分别如SEQ ID NO:20～25所示。

2)分别将1)中获得的该蛋白基因克隆到pCAGGS载体上，得到表达质粒 pCAGGS-SARS-CoV-2-WT-S-del18、pCAGGS-B.1.1.7-S-del18、pCAGGS-B.1.351-S-del18、 pCAGGS-P.1-S-del18、pCAGGS-B.1.617.1-S-del18、pCAGGS-B.1.617.2-S-del18。

SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株假病毒的包装步骤如下：

a.细胞准备：在10cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞，使第二天细胞汇合密度至80％左右。培养液为含10％FBS的DMEM培养基。

b.转染：取上述步骤2)中的各S蛋白的表达质粒，用PEI转染30μg质粒/10cm细胞培养皿，目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％FBS的DMEM 培养基)，37℃培养24h。

c.加毒：将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，并加入VSV-G抗体(表达该抗体的杂交瘤细胞购自ATCC细胞库)，在培养箱中继续培养30h。

d.收毒：收上清3000rpm离心10min,在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。

分别得到SARS-CoV-2原始毒株(SARS-CoV-2WT)及变异毒株(Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)及Delta(B.1.617.2))的假病毒。

实施例7：S43纳米抗体中和SARS-CoV-2假病毒感染的检测

将实施例4得到的纯化的S43纳米抗体从5μg/mL开始5倍倍比稀释至第9个梯度(2.56pg/mL)与1.6x10

表4、S43纳米抗体对新冠病毒的假病毒中和效果

*其中，IC

由表4可知，S43纳米抗体能以高中和活性中和上述一系列SARS-CoV-2原始毒株及变异毒株的假病毒。

综上，S43纳米抗体能够作为高中和活性的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)羊驼源纳米抗体。

实施例8：S43纳米抗体中和SARS-CoV-2活病毒感染的检测

本实施例中，通过基于细胞病变效应(CPE)的活病毒中和试验，测定纳米抗体S43对新冠病毒活病毒的中和效果；具体程序如下：

将纳米抗体S43以2倍倍比稀释至第11个梯度，每个梯度4个重复孔，每孔50μL，将各稀释液与等体积的100TCID

上述实验重复了两次，均在中国疾病预防控制中心的生物安全三级实验室(BSL3)中进行。

纳米抗体S43对新冠病毒原始毒株及其变异毒株的活病毒的中和效果见以下表5。

表5、S43纳米抗体对新冠病毒活病毒的中和效果

表5结果显示：本发明纳米抗体S43对新冠病毒原始毒株及其变异毒株的活病毒均具有良好的抑制效果。

实施例9：S43纳米抗体雾化前后稳定性的检测

使用Aerogen Solo(Aerogen Inc.,Chicago,USA)雾化器，将纳米抗体S43进行雾化，然后使用含有20mL PBS的全玻璃SKC(Eighty Four,PA,USA)收集雾化后的抗体，并按实施例7所述进行假病毒中和试验。

结果如图6所示，图6结果表明：本发明的纳米抗体S43在雾化前、后对新冠病毒原始毒株的假病毒的中和活性保持稳定，提示该纳米抗体适于通过雾化途径给药。

实施例10：S43纳米抗体在体内预防新冠病毒感染的效果检测

本实施例中，在7-8周的雌性BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)中，检测本发明纳米抗体S43预防新冠病毒感染的功效；具体程序如下：

1)对7-8周的雌性BALB/c小鼠进行麻醉，滴鼻感染重组腺病毒Ad5-hACE2(按照Jing Sun et al.,“Generation of a Broadly Useful Model for COVID-19Pathogenesis, Vaccination,and Treatment”Cell.2020Aug 6；182(3):734-743中描述的方法制得)；

2)第5天，对小鼠进行给药和攻毒；

具体地，纳米抗体S43通过滴鼻方式进行给药：将5只小鼠麻醉后，用移液枪往小鼠鼻孔滴注50μL 2mg/ml的纳米抗体S43，给药剂量为5mg/kg；此外，对另外5只小鼠通过滴鼻的方式给予200μL的PBS，作为对照组；

给药后6小时，再次将小鼠麻醉，滴鼻感染新冠病毒原始毒株的活病毒(5×10

3)第10天，解剖小鼠，取肺组织，提RNA，测病毒载量。

上述实验在中国疾病预防控制中心的生物安全三级实验室(BSL3)中进行。

结果如图7所示，图7结果显示，本发明的纳米抗体S43能有效降低肺部病毒载量，有效预防小鼠感染新冠病毒。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一株羊驼源纳米抗体及其应用

<130> 1087-210169F-1

<160> 25

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的重链互补区的CDR1氨基酸序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(10)

<400> 1

Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的重链互补区的CDR2氨基酸序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(16)

<400> 2

Cys Ile Ser Ser Asn Asn Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的重链互补区的CDR3氨基酸序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(19)

<400> 3

Glu Pro Asp Tyr Ser Gly Val Tyr Tyr Tyr Thr Cys Gly Trp Thr Asp

1 5 10 15

Phe Gly Ser

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的FR1框架区

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(25)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Pro Ser

20 25

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的FR2框架区

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(14)

<400> 5

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的FR3框架区

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(32)

<400> 6

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的FR4框架区

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(11)

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的重链互补区的氨基酸序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(127)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Pro Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Asn Asn Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Glu Pro Asp Tyr Ser Gly Val Tyr Tyr Tyr Thr Cys Gly Trp Thr

100 105 110

Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 9

<211> 381

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 骆驼源纳米抗体S43的核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(381)

<400> 9

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

acctgtgcac cctctggatt cactttggat tattatgcca taggctggtt ccgccaggcc 120

ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcatgt attagtagta ataatagcac atactatgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240

caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtttatt actgtgcagc agaaccagac 300

tatagcggtg tttactacta cacctgcgga tggactgact ttggttcctg gggccagggg 360

acgcaggtga ccgtgagctc t 381

<210> 10

<211> 3657

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SARS-CoV-2 S蛋白的核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3657)

<400> 10

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccag 60

tgcgtgaacc tgaccacacg gacccagctc cctcccgcct acacaaactc tttcacccgg 120

ggcgtgtact accccgacaa ggtgttccgg tctagcgtgc tccactctac acaggacctg 180

ttcctccctt tcttcagcaa cgtgacatgg ttccacgcca tccacgtgtc tggcacaaac 240

ggcacaaagc ggttcgacaa ccccgtgctc cctttcaacg acggcgtgta cttcgccagc 300

accgagaagt ctaacattat ccggggctgg attttcggca ccacactcga ctctaagaca 360

cagtccctcc tgattgtgaa caacgccaca aacgtggtga ttaaggtgtg cgagttccag 420

ttctgcaacg accctttcct gggcgtgtac taccacaaga acaacaagtc ttggatggag 480

tctgagttca gagtgtactc tagcgccaac aactgcacct tcgagtacgt gtcccagcct 540

ttcctcatgg acctggaggg caagcagggc aacttcaaga acctgagaga gttcgtgttc 600

aagaacattg acggctactt caagatttac tctaagcaca ccccaattaa cctcgtgagg 660

gacctccctc agggcttctc cgccttagaa ccactggtgg acctccctat tggcattaac 720

atcacacgct tccagacact gctcgccctc caccggtctt acctgacccc aggcgactct 780

agctctggct ggacagccgg cgccgccgcc tactacgtgg gctacctgca gcctaggacc 840

ttcctcctga agtacaacga gaacggcaca attaccgacg ccgtggactg cgccctggac 900

ccactgtccg agacaaagtg cacactgaag tccttcacag tggagaaggg catttaccag 960

acatctaact tccgggtgca gcctacagag tctattgtgc ggttcccaaa catcacaaac 1020

ctgtgccctt tcggcgaggt gttcaacgcc acccggttcg cctctgtgta cgcctggaac 1080

cggaagcgga tctctaactg cgtggccgac tactccgtgc tgtacaactc cgcctctttc 1140

tctacattca agtgctacgg cgtgtcccct acaaagctga acgacctgtg cttcaccaac 1200

gtgtacgccg actctttcgt gattagaggc gacgaggtga ggcagattgc ccccggccag 1260

acaggcaaga tcgccgacta caactacaag ctgcccgacg acttcacagg ctgcgtgatc 1320

gcctggaact ctaacaacct ggactctaag gtgggcggca actacaacta cctgtacaga 1380

ctgttccgga agtctaacct gaagccattc gagagggaca ttagcaccga gatttaccag 1440

gccggctcta ccccatgcaa cggcgtggag ggcttcaact gctacttccc actgcagtcc 1500

tacggcttcc agcctacaaa cggcgtgggc taccagcctt accgggtggt ggtgctgtct 1560

ttcgagctgc tccacgcccc cgccacagtg tgcggcccaa agaagagcac aaacctcgtg 1620

aagaacaagt gcgtgaactt caacttcaac ggcctcacag gcacaggcgt gctcaccgag 1680

tctaacaaga agttcctccc tttccagcag ttcggccgcg acattgccga caccaccgac 1740

gccgtgcggg accctcagac actggaaatt ctcgacatca ccccttgcag cttcggcggc 1800

gtgtccgtga tcaccccagg cacaaacaca tctaaccagg tggccgtgct gtaccaggac 1860

gtgaactgca ccgaggtgcc agtggccatc cacgccgacc agctcacccc aacatggagg 1920

gtgtacagca caggctctaa cgtgttccag acccgggccg gctgcctcat tggcgccgag 1980

cacgtgaaca actcttacga gtgcgacatc cctattggcg ccggcatttg cgcctcttac 2040

cagacccaga caaactctcc atctagcgcc tcctctgtgg cctctcagag cattattgcc 2100

tacaccatgt ctctgggcgc cgagaactct gtggcctact ctaacaactc tattgccatc 2160

cctacaaact tcacaatttc tgtgaccacc gagattctcc cagtgtctat gaccaagaca 2220

tctgtggact gcaccatgta catttgcggc gactccaccg agtgctctaa cctcctgctc 2280

cagtacggct ctttctgcac ccagctcaac cgcgccctga caggcatcgc cgtggagcag 2340

gacaagaaca cccaggaggt gttcgcccag gtgaagcaga tttacaagac ccccccaatt 2400

aaggacttcg gcggcttcaa cttctctcag attctccccg acccatccaa gcctagcaag 2460

cggtccttca ttgaggacct cctgttcaac aaggtgacac tggccgacgc cggcttcatt 2520

aagcagtacg gcgactgcct gggcgacatt gccgcccggg acctgatttg cgcccagaag 2580

ttcaacggcc tcacagtgct ccccccactg ctcaccgacg agatgattgc ccagtacaca 2640

tctgccctcc tggccggcac aattacatct ggctggacct tcggcgccgg cgccgccctg 2700

cagatccctt tcgccatgca gatggcctac cgcttcaacg gcatcggcgt gacacagaac 2760

gtgctgtacg agaaccagaa gctgatcgcc aaccagttca acagcgccat tggcaagatt 2820

caggactctc tgagcagcac agccagcgcc ctgggcaagc tgcaggacgt ggtgaaccag 2880

aacgcccagg ccctgaacac actggtgaag cagctgtctt ctaacttcgg cgccatttct 2940

agcgtgctga acgacattct gtcgcggctg gaccctccag aggccgaggt gcagattgac 3000

aggctcatca caggcagact gcagtctctg cagacatacg tgacccagca gctgattaga 3060

gccgccgaga ttagagcctc cgccaacctg gccgccacca agatgagcga gtgcgtgctc 3120

ggccagtcta agcgggtgga cttctgcggc aagggctacc acctcatgtc tttccctcag 3180

tccgcccctc acggcgtggt gttcctccac gtgacatacg tgcccgccca ggagaagaac 3240

ttcaccacag cccccgccat ttgccacgac ggcaaggccc acttccctag ggagggcgtg 3300

ttcgtgtcta acggcaccca ctggttcgtg acccagcgga acttctacga gcctcagatt 3360

attaccacag acaacacatt cgtgagcggc aactgcgacg tggtgattgg cattgtgaac 3420

aacacagtgt acgacccact gcagcctgag ttggactctt tcaaggagga actcgacaag 3480

tacttcaaga accacacatc tcctgacgtg gacctgggcg acattagcgg cattaacgcc 3540

tctgtggtga acattcagaa ggagattgac agactgaacg aggtggccaa gaacctgaac 3600

gagtctctca ttgacctgca ggagctgggc aagtacgagc agtacattaa gtggcct 3657

<210> 11

<211> 114

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 三聚体标签的核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(114)

<400> 11

cgactggtac cacgaggtag tccaggatca ggttatattc ctgaagctcc aagagatggg 60

caagcttacg ttcgtaaaga tggcgaatgg gtattacttt ctaccttttt agga 114

<210> 12

<211> 669

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SARS-CoV-2 RBD蛋白的核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(669)

<400> 12

agagtgcaac ctacagaatc aatcgtgaga tttcctaaca tcacaaacct ttgccctttc 60

ggcgaggtgt ttaacgcaac aagatttgca tcagtgtacg catggaacag aaagcgtata 120

tcaaactgcg tggcagatta ctcagtgctt tacaactcag catcattcag tacgtttaaa 180

tgctacggag tgtcacctac aaagctaaat gatctttgct ttacaaacgt gtacgcagat 240

tcatttgtga tcagaggaga tgaagtgaga caaatcgcac ctggacaaac aggaaagatt 300

gccgattaca actacaaact tcctgatgat ttcaccggct gcgtgatcgc atggaactca 360

aacaaccttg attcaaaggt aggtggtaat tataattatt tgtataggct ctttcgtaag 420

agcaacttaa agccatttga gcgagatatc tcaacagaaa tctaccaagc aggatcaaca 480

ccttgcaacg gagtggaagg atttaactgc tactttcctc ttcaatcata cggatttcaa 540

cctacaaacg gagtgggata ccaaccttac agagtggtgg tgctttcatt tgaacttctt 600

cacgcacctg caacagtgtg cggacctaag aagagcacga accttgtgaa gaataagtgc 660

gtgaacttt 669

<210> 13

<211> 681

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源Fc标签的编码核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(681)

<400> 13

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaactatctc caaagccaaa 360

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660

ctctccctgt ctccgggtaa a 681

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CALL001引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<400> 14

gtcctggctg ctcttctaca agg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CALL002引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<400> 15

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VHH-BA引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<400> 16

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PMCF引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<400> 17

ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MP57引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<400> 18

ttatgcttcc ggctcgtatg 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GⅢ引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<400> 19

ccacagacag ccctcatag 19

<210> 20

<211> 3786

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 新冠病毒SARS-CoV-2-WT-S-del18的编码核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3786)

<400> 20

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc aatgcgtgaa cctgaccaca 60

agaacacagc tgccccccgc ctacaccaac agcttcacaa gaggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttca gaagcagcgt cctccacagc acccaagacc tgttcctgcc cttcttcagc 180

aacgtgacct ggttccacgc catcagcggc accaacggca ccaagagatt cgacaacccc 240

gtgctgccct tcaacgacgg cgtgtacttc gctagcaccg agaagagcaa catcatcaga 300

ggctggatct tcggcaccac cctggacagc aaaacacaga gcctgctgat cgtgaacaac 360

gccacaaacg tggtgatcaa ggtgtgcgag tttcagttct gcaacgaccc cttcctgggc 420

gtgtaccaca agaacaacaa gagctggatg gagagcgagt tccgggtgta cagcagcgcc 480

aacaactgca ccttcgagta cgtgagccaa cccttcctga tggacctgga gggcaagcaa 540

ggcaatttta agaacctgag agagttcgtg ttcaagaaca tcgacggcta cttcaagatc 600

tacagcaagc acacccccat caacctggtg agagacctgc cccaaggctt cagcgccctg 660

gagcccctgg tggacctgcc catcggcatc aacatcacaa gatttcagac cctgctggcc 720

ctgcacagaa gctatctgac ccccggcgac agcagcagcg gctggaccgc cggcgccgcc 780

gcttactacg tgggctacct gcagcctaga accttcctgc tgaagtacaa cgagaacggc 840

acaatcaccg acgccgtcga ctgcgccctg gaccccctga gcgagaccaa gtgcaccctg 900

aagagcttca ccgtggagaa gggcatctat cagacaagca acttcagagt gcagcccacc 960

gagagcatcg tgagattccc caacatcacc aacctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaac 1020

gccacaagat tcgctagcgt gtacgcctgg aacagaaaga gaatcagcaa ctgcgtggcc 1080

gactacagcg tgctgtacaa cagcgctagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtcagc 1140

cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatcaga 1200

ggcgacgagg tgagacagat cgcccccggg cagaccggca agatcgccga ctacaactac 1260

aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggactcc 1320

aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac agactgttca gaaagagcaa cctgaagccc 1380

ttcgagagag acatcagcac cgagatctac caagccggca gcaccccctg caacggcgtg 1440

gagggcttca actgctactt ccccctgcag agctacggct ttcagcccac ctacggcgtg 1500

ggctatcagc cctacagagt ggtcgtgctg agcttcgagc tgctgcacgc ccccgccacc 1560

gtgtgcggcc ccaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgcgtgaa cttcaacttc 1620

aacggcctca ccgggaccgg cgtgctgacc gagagcaaca agaagttcct gcctttccaa 1680

cagttcggca gagacatcga cgacaccacc gacgccgtca gagaccctca gaccctggag 1740

atcctggaca tcacaccctg cagcttcggc ggcgtgagcg tgatcacccc cggcaccaac 1800

acaagcaacc aagtggccgt gctgtaccaa ggcgtgaact gcaccgaggt gcccgtggcc 1860

atccacgccg atcagctgac ccccacctgg agagtgtaca gcaccggcag caacgtgttt 1920

cagacaagag ccggctgcct gatcggcgcc gagcacgtga acaacagcta cgagtgcgac 1980

atccccatcg gcgccggcat ctgcgctagc tatcagacac agaccaacag ccacagaaga 2040

gctagaagcg tggctagcca aagcatcatc gcctacacca tgagcctggg cgccgagaac 2100

agcgtggcct acagcaacaa cagcatcgcc atccccacca acttcaccat cagcgtgacc 2160

accgaaatcc tgcctgtgag catgaccaag acaagcgtgg actgcaccat gtacatctgc 2220

ggcgacagca ccgagtgcag caacctgctc ctgcagtacg gcagcttctg cattcagctg 2280

aacagagccc tgaccggcat cgccgtggag caagacaaga acacccaaga ggtgttcgcc 2340

caagtgaagc agatctacaa gacccccccc atcaaggact tcggcggctt caacttcagc 2400

caaatcctgc ctgaccctag caagcctagc aagagaagct tcatcgagga cctgctgttc 2460

aacaaggtga ccctggccga cgccggcttc atcaagcagt acggcgactg cctgggcgac 2520

atcgccgcta gagacctgat ctgcgctcag aagttcaacg gcctgaccgt gctgcccccc 2580

ctgctgaccg acgagatgat cgctcagtac acaagcgccc tgctcgctgg caccatcaca 2640

agcgggtgga ccttcggcgc cggggccgcc ctgcagatcc ccttcgccat gcagatggcc 2700

tacagattca acggcatcgg cgtgacacag aacgtgctgt acgagaatca gaagctgatc 2760

gccaatcagt tcaacagcgc catcggcaag atccaagaca gcctgagcag caccgctagc 2820

gccctgggca agctgcaaga cgtggtgaat cagaacgccc aagccctgaa caccctggtg 2880

aagcagctga gcagcaactt cggcgccatc agcagcgtgc tgaacgacat cctggctaga 2940

ctggacaagg tggaggccga ggtgcagatc gatagactga tcaccggcag actgcagagc 3000

ctgcagacct acgtgacaca gcagctgatc agagccgccg agatcagagc tagcgccaac 3060

ctggccgcca ccaagatgag cgagtgcgtg ctggggcaga gcaagagagt ggacttctgc 3120

ggcaagggct accacctgat gagcttccct cagagcgccc cccacggcgt ggtgttcctg 3180

cacgtgacct acgtgcccgc ccaagagaag aacttcacca ccgcccccgc catctgccac 3240

gacggcaagg cccacttccc tagagagggc gtgttcgtga gcaacggcac ccactggttc 3300

gtgacacaga gaaacttcta cgagcctcag atcatcacca cccacaacac cttcgtgagc 3360

ggcaactgcg acgtggtgat cggcatcgtg aacaacaccg tgtacgaccc tctgcagccc 3420

gagctggaca gcttcaagga ggagctggac aagtacttca agaaccacac aagccccgac 3480

gtggacctgg gcgacatcag cgggatcaac gctagcgtgg tgaacattca gaaggaaatc 3540

gacagactga atgaggtggc caagaacctg aacgagagcc tgatcgacct gcaagagctg 3600

ggcaagtacg agcagtacat caagtggccc tggtacatct ggctgggctt catcgccggc 3660

ctgatcgcca tcgtgatggt gaccatcatg ctgtgctgca tgacaagctg ctgctcctgt 3720

ctgaaggggt gctgcagctg cggcagctgc tgcaaggact acaaggacga tgacgacaag 3780

ggcccc 3786

<210> 21

<211> 3786

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 新冠病毒SARS-CoV-2-B.1.1.7-S-del18的编码核苷酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3786)

<400> 21

atgttcgtgt tcctggtgct gctgcccctg gtgagcagcc aatgcgtgaa cctgaccaca 60

agaacacagc tgccccccgc ctacaccaac agcttcacaa gaggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttca gaagcagcgt cctccacagc acccaagacc tgttcctgcc cttcttcagc 180

aacgtgacct ggttccacgc catcagcggc accaacggca ccaagagatt cgacaacccc 240

gtgctgccct tcaacgacgg cgtgtacttc gctagcaccg agaagagcaa catcatcaga 300

ggctggatct tcggcaccac cctggacagc aaaacacaga gcctgctgat cgtgaacaac 360

gccacaaacg tggtgatcaa ggtgtgcgag tttcagttct gcaacgaccc cttcctgggc 420

gtgtaccaca agaacaacaa gagctggatg gagagcgagt tccgggtgta cagcagcgcc 480

aacaactgca ccttcgagta cgtgagccaa cccttcctga tggacctgga gggcaagcaa 540

ggcaatttta agaacctgag agagttcgtg ttcaagaaca tcgacggcta cttcaagatc 600

tacagcaagc acacccccat caacctggtg agagacctgc cccaaggctt cagcgccctg 660

gagcccctgg tggacctgcc catcggcatc aacatcacaa gatttcagac cctgctggcc 720

ctgcacagaa gctatctgac ccccggcgac agcagcagcg gctggaccgc cggcgccgcc 780

gcttactacg tgggctacct gcagcctaga accttcctgc tgaagtacaa cgagaacggc 840

acaatcaccg acgccgtcga ctgcgccctg gaccccctga gcgagaccaa gtgcaccctg 900

aagagcttca ccgtggagaa gggcatctat cagacaagca acttcagagt gcagcccacc 960

gagagcatcg tgagattccc caacatcacc aacctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaac 1020

gccacaagat tcgctagcgt gtacgcctgg aacagaaaga gaatcagcaa ctgcgtggcc 1080

gactacagcg tgctgtacaa cagcgctagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtcagc 1140

cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatcaga 1200

ggcgacgagg tgagacagat cgcccccggg cagaccggca agatcgccga ctacaactac 1260

aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggactcc 1320

aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac agactgttca gaaagagcaa cctgaagccc 1380

ttcgagagag acatcagcac cgagatctac caagccggca gcaccccctg caacggcgtg 1440

gagggcttca actgctactt ccccctgcag agctacggct ttcagcccac ctacggcgtg 1500

ggctatcagc cctacagagt ggtcgtgctg agcttcgagc tgctgcacgc ccccgccacc 1560

gtgtgcggcc ccaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgcgtgaa cttcaacttc 1620

aacggcctca ccgggaccgg cgtgctgacc gagagcaaca agaagttcct gcctttccaa 1680

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atgttcgtgt tcctcgtgct cctgcctctg gtgtctagcc agtgcgtgaa cctgagaaca 60

cggacccagc tccctcccgc ctacacaaac tctttcaccc ggggcgtgta ctaccccgac 120

aaggtgttcc ggtctagcgt gctccactct acacaggacc tgttcctccc tttcttcagc 180

aacgtgacat ggttccacgc catccacgtg tctggcacaa acggcacaaa gcggttcgac 240

aaccccgtgc tccctttcaa cgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gtctaacatt 300

atccggggct ggattttcgg caccacactc gactctaaga cacagtccct cctgattgtg 360

aacaacgcca caaacgtggt gattaaggtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccctttc 420

ctggacgtgt actaccacaa gaacaacaag tcttggatgg agtctggcgt gtactctagc 480

gccaacaact gcaccttcga gtacgtgtcc cagcctttcc tcatggacct ggagggcaag 540

cagggcaact tcaagaacct gagagagttc gtgttcaaga acattgacgg ctacttcaag 600

atttactcta agcacacccc aattaacctc gtgagggacc tccctcaggg cttctccgtg 660

ttagaaccac tggtggacct ccctattggc attaacatca cacgcttcca gacactgctc 720

gccctccacc ggtcttacct gaccccaggc gactctagct ctggctggac agccggcgcc 780

gccgcctact acgtgggcta cctgcagcct aggaccttcc tcctgaagta caacgagaac 840

ggcacaatta ccgacgccgt ggactgcgcc ctggacccac tgtccgagac aaagtgcaca 900

ctgaagtcct tcacagtgga gaagggcatt taccagacat ctaacttccg ggtgcagcct 960

acagagtcta ttgtgcggtt cccaaacatc acaaacctgt gccctttcgg cgaggtgttc 1020

aacgccaccc ggttcgcctc tgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc taactgcgtg 1080

gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tctttctcta cattcaagtg ctacggcgtg 1140

tcccctacaa agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc tttcgtgatt 1200

agaggcgacg aggtgaggca gattgccccc ggccagacag gcaagatcgc cgactacaac 1260

tacaagctgc ccgacgactt cacaggctgc gtgatcgcct ggaactctaa caacctggac 1320

tctaaggtgg gcggcaacta caactacaga tacagactgt tccggaagtc taacctgaag 1380

ccattcgaga gggacattag caccgagatt taccaggccg gctctaagcc atgcaacggc 1440

gtggagggct tcaactgcta cttcccactg cagtcctacg gcttccagcc tacaaacggc 1500

gtgggctacc agccttaccg ggtggtggtg ctgtctttcg agctgctcca cgcccccgcc 1560

acagtgtgcg gcccaaagaa gagcacaaac ctcgtgaaga acaagtgcgt gaacttcaac 1620

ttcaacggcc tcacaggcac aggcgtgctc accgagtcta acaagaagtt cctccctttc 1680

cagcagttcg gccgcgacat tgccgacacc accgacgccg tgcgggaccc tcagacactg 1740

gaaattctcg acatcacccc ttgcagcttc ggcggcgtgt ccgtgatcac cccaggcaca 1800

aacacatcta accaggtggc cgtgctgtac cagggcgtga actgcaccga ggtgccagtg 1860

gccatccacg ccgaccagct caccccaaca tggagggtgt acagcacagg ctctaacgtg 1920

ttccagaccc gggccggctg cctcattggc gccgagcacg tgaacaactc ttacgagtgc 1980

gacatcccta ttggcgccgg catttgcgcc tcttaccaga cccagacaaa ctctagacgg 2040

agagcccggt ctgtggcctc tcagagcatt attgcctaca ccatgtctct gggcgccgag 2100

aactctgtgg cctactctaa caactctatt gccatcccta caaacttcac aatttctgtg 2160

accaccgaga ttctcccagt gtctatgacc aagacatctg tggactgcac catgtacatt 2220

tgcggcgact ccaccgagtg ctctaacctc ctgctccagt acggctcttt ctgcacccag 2280

ctcaaccgcg ccctgacagg catcgccgtg gagcaggaca agaacaccca ggaggtgttc 2340

gcccaggtga agcagattta caagaccccc ccaattaagg acttcggcgg cttcaacttc 2400

tctcagattc tccccgaccc atccaagcct agcaagcggt ccttcattga ggacctcctg 2460

ttcaacaagg tgacactggc cgacgccggc ttcattaagc agtacggcga ctgcctgggc 2520

gacattgccg cccgggacct gatttgcgcc cagaagttca acggcctcac agtgctcccc 2580

ccactgctca ccgacgagat gattgcccag tacacatctg ccctcctggc cggcacaatt 2640

acatctggct ggaccttcgg cgccggcgcc gccctgcaga tccctttcgc catgcagatg 2700

gcctaccgct tcaacggcat cggcgtgaca cagaacgtgc tgtacgagaa ccagaagctg 2760

atcgccaacc agttcaacag cgccattggc aagattcagg actctctgag cagcacagcc 2820

agcgccctgg gcaagctgca gaacgtggtg aaccagaacg cccaggccct gaacacactg 2880

gtgaagcagc tgtcttctaa cttcggcgcc atttctagcg tgctgaacga cattctgtcg 2940

cggctggaca aggtggaggc cgaggtgcag attgacaggc tcatcacagg cagactgcag 3000

tctctgcaga catacgtgac ccagcagctg attagagccg ccgagattag agcctccgcc 3060

aacctggccg ccaccaagat gagcgagtgc gtgctcggcc agtctaagcg ggtggacttc 3120

tgcggcaagg gctaccacct catgtctttc cctcagtccg cccctcacgg cgtggtgttc 3180

ctccacgtga catacgtgcc cgcccaggag aagaacttca ccacagcccc cgccatttgc 3240

cacgacggca aggcccactt ccctagggag ggcgtgttcg tgtctaacgg cacccactgg 3300

ttcgtgaccc agcggaactt ctacgagcct cagattatta ccacagacaa cacattcgtg 3360

agcggcaact gcgacgtggt gattggcatt gtgaacaaca cagtgtacga cccactgcag 3420

cctgagttgg actctttcaa ggaggaactc gacaagtact tcaagaacca cacatctcct 3480

gacgtggacc tgggcgacat tagcggcatt aacgcctctg tggtgaacat tcagaaggag 3540

attgacagac tgaacgaggt ggccaagaac ctgaacgagt ctctcattga cctgcaggag 3600

ctgggcaagt acgagcagta cattaagtgg ccttggtaca tttggctggg cttcattgcc 3660

ggcctgatcg ccattgtgat ggtgaccatc atgctgtgct gcatgacatc ttgctgcagc 3720

tgcctgaagg gctgctgctc ttgcggctct tgctgcaagg actacaagga cgacgatgac 3780

aagggacct 3789