禽肠道上皮细胞及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种禽肠道上皮细胞及其制备方法和应用。一种禽肠道上皮细胞，来源于禽胚小肠段细胞，基因组中含有SV40的大T抗原基因。本发明研究人员发现，在禽胚小肠段细胞基因组中整合SV40的大T抗原基因能够使得禽肠道上皮细胞在体外能长期培养，能够连续培养超过6个月，传代超过30代，并且基因表达稳定，呈现肠道上皮细胞的特异性特征，表达肠道上皮细胞标志分子，适用于禽类肠道健康的相关研究和生物制品的开发。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种禽肠道上皮细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肠道器官可分为小肠(十二指肠、空肠和回肠)和大肠(直肠、盲肠和结肠)，前者可抵御外界病原菌的入侵及维持消化道稳态，负责营养物质的消化和吸收；后者主要吸收多余水分。在肠道发育过程中，小肠占主导作用。小肠是重要的免疫和内分泌器官，同时也是营养物质消化吸收的重要场所。小肠上皮是更新最快的组织，其对于维持肠道健康、修复损伤、防止病毒细菌和寄生虫入侵等方面均发挥着重要的作用，对于禽类来说尤其重要。肠道的健康直接关乎禽类的免疫力，一旦禽类的肠道被破坏，禽类的健康就难以保障。因此，对小肠上皮功能的探究具有重要意义，也是促进养禽业健康养殖的重要方面。

体外细胞模型是重要的研究工具，其能通过增加实验的可重复性和样品的可获得性及减少实验动物的使用，促使细胞机制的研究成为可能。但目前仍难以有可用的禽类肠道细胞，仅能通过分离培养肠道原代细胞，原代细胞在添加大量生长因子的条件下才得以维持，而且培养时间一般仅维持在2周以内，不能长期培养，在时间上达不到药物筛选和一些生物制品开发的基本要求，这严重限制了当前禽类肠道健康的相关研究和生物制品的开发。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够在体外长期培养的禽肠道上皮细胞。

此外，还提供一种禽肠道上皮细胞的制备方法和应用。

一种禽肠道上皮细胞，来源于禽胚小肠段细胞，基因组中含有SV40的大T抗原基因。

本发明研究人员发现，在禽胚小肠段细胞基因组中整合SV40的大T抗原基因能够使得禽肠道上皮细胞在体外能长期培养，能够连续培养超过6个月，传代超过30代，并且基因表达稳定，呈现肠道上皮细胞的特异性特征，表达肠道上皮细胞标志分子，适用于禽类肠道健康的相关研究和生物制品的开发。

在其中一个实施例中，所述禽胚小肠段细胞包括9胚龄的禽胚小肠段细胞。

在其中一个实施例中，所述禽胚小肠段细胞包括禽胚小肠段细胞。

在其中一个实施例中，所述禽肠道上皮细胞表达肠上皮细胞标志分子，所述肠上皮细胞标志分子包括TJP1。

一种禽肠道上皮细胞的制备方法，以禽胚小肠段细胞为宿主细胞，将SV40的大T抗原基因整合到所述宿主细胞的基因组中。

在其中一个实施例中，所述制备方法包括以下步骤：分离禽胚小肠段细胞；使用含有SV40的大T抗原基因的逆转录病毒载体对所述禽胚小肠段细胞进行转导；细胞传代、筛选及鉴定。

在其中一个实施例中，所述转导时间为36h～60h。

在其中一个实施例中，所述禽胚小肠段细胞包括9胚龄的禽胚小肠段细胞。

在其中一个实施例中，所述禽胚小肠段细胞包括禽胚小肠段细胞。

上述任一实施例所述的禽肠道上皮细胞在制备禽类肠道相关的生物工程产品或体外筛选禽类肠道相关的治疗药物中的应用。

附图说明

图1为实施例1的实验设计流程示意图；

图2为实施例1中岭南黄鸡在9胚龄、11胚龄、13胚龄、15胚龄和18胚龄时的胚胎、全肠段和小肠段示意图；

图3为实施例1中岭南黄鸡在9胚龄、11胚龄、13胚龄、15胚龄和18胚龄时小肠段的横截面在显微镜下低倍和高倍的组织结构示意图；

图4为实施例1中带有大T抗原基因的慢病毒载体转导禽胚肠道上皮细胞2天后的细胞形态和病毒表达情况示意图；

图5为实施例1中带有大T抗原基因的慢病毒载体转导禽胚肠道上皮细胞成功后单克隆扩大培养后细胞形态和病毒表达情况示意图；

图6为实施例1中带有大T抗原基因的慢病毒载体转导禽胚肠道上皮细胞成功后的传代培养细胞形态和病毒表达情况示意图；

图7为实施例1中带有大T抗原基因的慢病毒载体转导禽胚肠道上皮细胞成功后的F10代和F30代的小肠上皮细胞标志性基因的电泳检测结果图；

图8为实施例1中F30代禽肠道上皮细胞的TJP1蛋白表达情况的免疫荧光检测图；

图9为实施例1中F10代、F20代和F30代禽肠道上皮细胞的差异基因表达的FPKM层次聚类分析图，其中，横轴代表不同代次的细胞组，纵轴代表基因，深色代表基因表达上调，浅色代表基因表达下调；

图10为实施例1中F10代和F30代禽肠道上皮细胞的差异表达基因的KEGG通路分析图；

图11为实施例1中F10代和F30代禽肠道上皮细胞的差异表达基因的细胞周期信号通路分析图；

图12为实施例1中F10代和F30代禽肠道上皮细胞的差异表达基因的实时荧光定量PCR的验证结果统计图；

图13为实施例1中E.tenella子孢子在禽肠道上皮细胞的发育情况显微镜下明场观察示意图；

图14为实施例1中E.tenella子孢子在禽肠道上皮细胞的发育情况的HE染色图；

图15为对比例1中分离9胚龄岭南黄鸡胚小肠上皮细胞原代细胞进行传代培养后的细胞形态示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所述的“SV40”是“Simian vacuolating virus 40”或“Simian virus 40”的缩写，即猴空泡病毒40。SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumor antigen，T抗原)，其分子量分别为94000(大T抗原)和17000(小T抗原)。

所述的“禽胚”是指禽类的胚胎，主要被用于发育生物学的研究。

所述的“胚龄”是指胚胎的日龄，例如，“9胚龄”即是指9日龄的胚胎。

所述的“TJP1”为Tight Junction Protein 1的缩写，也称为ZO-1。

所述的“转导”是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。

所述的“FPKM”是“Fragments Per Kilobase Million”的缩写，为每百万Reads中来自某一基因每千碱基长度的Reads数目，是一种普遍采用的基因表达量标准化方法，这种方法同时考虑了测序深度和基因长度对基因表达量计数的影响。

所述的“GFP”是“Green fluorescent protein”的缩写，即绿色荧光蛋白，该蛋白能稳定地在后代遗传，并且能根据启动子特异性地表达，在一些实验中取代了传统的化学染料成为更好的研究工具。

所述的“DEGs”是“Differentially expressed genes”的缩写，即差异表达基因，是指在mRNA水平处在不同环境压力、时间或空间等不同条件下表达有显著性差异的基因。

所述的“逆转录病毒”又称反转录病毒，属于RNA病毒中的一类，它们的遗传信息不是储存在脱氧核糖核酸(DNA)，而是储存在核糖核酸(RNA)上。逆转录病毒基因组为二倍体，两条相同的单股正链RNA，其两端为长末端重复序列(LTR)，内含有较强启动子和增强子，对病毒DNA的转录调控具有重要作用。病毒核心包含逆转录酶和整合酶，与其他RNA病毒不同之处在于，逆转录病毒的RNA不进行自我复制，进入宿主细胞后，RNA经逆转录酶合成双链DNA，双链DNA被整合酶整合至宿主细胞染色体DNA上形成前病毒，建立终生感染并可随宿主细胞分裂传递给子代细胞。

所述的“慢病毒载体”是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达。此外，这一载体区别于一般的逆转录病毒载体，即可以将外源基因整合到分裂和非分裂细胞的基因组中。

本申请一实施方式提供了一种禽肠道上皮细胞，来源于禽胚小肠段细胞，基因组中含有SV40的大T抗原基因。

本发明研究人员发现，在禽胚小肠段细胞基因组中整合SV40的大T抗原基因(GeneID：29031019)能够使得禽肠道上皮细胞在体外能长期培养，能够连续培养超过6个月，传代超过30代，并且细胞形态保持良好，基因表达稳定，呈现肠道上皮细胞的特异性特征，表达肠道上皮细胞标志分子，适用于禽类肠道健康的相关研究和生物制品的开发。

进一步地，上述禽胚小肠段细胞包括9胚龄的禽胚小肠段细胞。

具体地，本发明研究人员发现，早期胚胎发育过程中禽胚小肠细胞活力强，分裂能力强，更适合用于体外细胞的制备，优选9胚龄禽肠段进行细胞的制备培养。

在其中一个实施例中，上述禽胚小肠段细胞包括禽胚小肠段细胞。

在一个可选的具体示例中，上述禽胚小肠段细胞为岭南黄鸡小肠段细胞。

在其中一个实施例中，上述禽肠道上皮细胞表达肠上皮细胞标志分子，所述肠上皮细胞标志分子包括TJP1。

进一步地，上述肠上皮细胞标志分子还包括KRT18(Keratin 18)、CDH1(Cadherin1)、CLDN1(Claudin 1)、OCLN(Occludin)和VILL(Villin-like protein)中的至少一种。

在其中一个实施例中，使用含有SV40的大T抗原基因的逆转录病毒载体将大T抗原基因转导进入禽胚小肠段细胞。

进一步地，上述逆转录病毒载体包括慢病毒载体。

一种禽肠道上皮细胞的制备方法，以禽胚小肠段细胞为宿主细胞，将SV40的大T抗原基因整合到所述宿主细胞的基因组中。

具体地，采用上述禽肠道上皮细胞的制备方法，制备得到的禽肠道上皮细胞纯度高，适用于药物筛选和生物制品开发的研究，能够明确发挥作用的细胞种类。

在其中一个实施例中，所述制备方法包括步骤a1、步骤a2和步骤a3，具体地：

步骤a1：分离禽胚小肠段细胞。

优选地，该禽胚小肠段细胞包括9胚龄的禽胚小肠段细胞。

在其中一个实施例中，该禽胚小肠段细胞包括禽胚小肠段细胞。

在一个可选的具体示例中，上述禽胚小肠段细胞为岭南黄鸡小肠段细胞。

步骤a2：使用含有SV40的大T抗原基因的逆转录病毒载体对所述禽胚小肠段细胞进行转导。

具体地，上述逆转录病毒载体包括慢病毒载体。

在其中一个实施例中，上述转导时间为36h～60h。进一步地，转导时间为40h～55h。更进一步地，转导时间为45h～50h。

步骤a3：细胞传代、筛选及鉴定。

上述任一实施例所述的禽肠道上皮细胞在制备禽类肠道相关的生物工程产品或体外筛选禽类肠道相关的治疗药物中的应用。

具体地，利用上述禽肠道上皮细胞制备得到的禽肠道上皮细胞模型，具备禽肠道上皮细胞的特异性特征，且基因表达稳定，适合用在长期的研究中，适合用于制备禽类肠道相关的生物工程产品或体外筛选禽类肠道相关的治疗药物。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例和对比例中的禽胚小肠上皮细胞均来源于岭南黄鸡。

实施例1

实施例1的实验流程示意图如图1所示。

1.禽胚小肠细胞的分离培养

不同胚龄的小肠组织发育程度不同，如图2～图3所示，图2为岭南黄鸡在9胚龄、11胚龄、13胚龄、15胚龄和18胚龄时的胚胎、全肠段和小肠段示意图；图3为岭南黄鸡在9胚龄、11胚龄、13胚龄、15胚龄和18胚龄时小肠段的横截面在低倍和高倍显微镜下的组织结构示意图。

通过分离不同胚龄的肠段组织，本发明研究人员观察到9胚龄的鸡肠道绒毛表面分布着一些粘膜层上皮细胞，这可能是可满足小肠上皮细胞具有干性的最原始的细胞，数量虽少，但增殖能力强；11胚龄的小肠隐窝深度发生了变化，隐窝显著，排列整齐；随着胚龄的增大以及肠道组织的不断发育，肠绒毛固有层结构增宽且增厚，细胞数量和种类也在增加。优选9胚龄鸡小肠段进行细胞分离培养。

禽胚小肠细胞的分离培养的具体步骤为：

分离9胚龄的鸡小肠组织转移到EP管中，剪碎，体积小于1mm

2.SV40大T抗原慢病毒载体转导

1)慢病毒包装和浓缩

(a)提前将293FT细胞复苏，待细胞处于生长对数期时，密度为80％～90％时传代，铺板；当细胞数量为10

(b)分别取两个1.5mL无菌EP管，加入300μL基础培养基DMEM，添加3.5μg包装质粒pMD2.G、10.4μg psPAX2、10μg连接有GFP的SV40大T抗原质粒和相对剂量的转染试剂，轻轻混匀后作用15min；将混合液均匀滴加至含有细胞的培养瓶中，混匀培养；

(c)5h～6h后进行第一次换液，并添加新培养基继续培养；次日进行第二次换液；48h和72h后收集上清液，3000RPM离心3min，0.45μm过滤器过滤后，进行病毒浓缩；将病毒液依次分别转入超滤管，4℃，4000RPM离心0.5h；弃滤液，添加100μL基础培养液重悬沉淀，20μL/管，-80℃保存。

2)慢病毒侵染

将浓缩后的病毒液按照MOI值20进行计算，最终添加50μL病毒液到1mL完全培养基中，侵染生长状态良好的鸡胚小肠上皮细胞；添加终浓度为6μg/mL Polybrene(聚凝胺)协助感染，37℃培养箱培养；24h后观察绿色荧光表达情况，判定细胞转导效率，若效率较低，进行多次侵染。

3)单细胞克隆筛选

筛选出阳性细胞进行消化，经洗涤离心后，细胞计数；取100μL中含1个细胞的悬液接种96孔板中，每孔含一个细胞，培养1周后观察，标记出表达GFP的单克隆孔，连续培养2～3周，阳性单克隆细胞长满后进行消化、传代和冻存。

图4为带有大T抗原基因的慢病毒载体转导鸡胚肠道上皮细胞2天后的细胞形态和病毒表达情况示意图。从图4中可以看出，传代后的鸡胚肠段细胞，通过SV40大T抗原慢病毒侵染，培养2天后，部分细胞表达绿色荧光蛋白GFP，证明大T抗原在鸡胚小肠上皮细胞中已表达。

通过单克隆细胞筛选的方法，进行细胞计数，将细胞铺于96孔板中，每孔含一个细胞，培养一周后观察，细胞融合达到80％左右。图5为带有大T抗原基因的慢病毒载体转导鸡胚肠道上皮细胞成功后单克隆扩大培养后细胞形态和病毒表达情况示意图。从图5中可以看出，细胞均表达GFP，根据形态初步判断，类似上皮细胞克隆，并进行挑选扩大培养，发现该细胞具有较高的增殖速率。

3.细胞传代，扩大培养

传代：细胞密度大于80％～90％时，弃旧培养基，PBS洗涤1～2遍，37℃消化30s，加入完全培养基终止消化，随后吹打细胞，将脱落细胞全部转移离心管中，离心；细胞沉淀按照1：3的比例将细胞悬液接种培养瓶中培养。

通过单细胞筛选法筛选出成功表达GFP的鸡胚小肠上皮细胞，连续培养6个月，传代30代，细胞仍保持快速增长的状态，融合率达80％～90％。

图6为带有大T抗原基因的慢病毒载体转导鸡胚肠道上皮细胞成功后的传代培养细胞形态和病毒表达情况示意图。从图6中可以看出，通过传代培养，F5代细胞形态呈短梭形，分布均匀；F10代细胞汇集成片；F20代少数细胞呈多边形，其它细胞由短梭形汇集；F30代同F10代，大部分细胞也逐渐汇集，细胞分布均匀，活力较好，形态结构完整。

以上结果证实了该细胞经过传代，细胞形态保持良好，并可持续增殖和多次传代。

4.小肠上皮细胞标志性基因转录水平检测

提取F10代和F30代鸡胚小肠上皮细胞RNA，经过反转录后进行琼脂糖凝胶电泳。图7为带有大T抗原基因的慢病毒载体转导鸡胚肠道上皮细胞成功后的F10代和F30代的小肠上皮细胞标志性基因cDNA的电泳检测结果图。从图7中可以看出，F10代和F30代鸡胚小肠上皮细胞标志性基因Krt-18、Cdh1、Cldn1、Tjp1、Ocln和Vill均有表达。

5.小肠上皮细胞标识性蛋白免疫荧光检测

对F30代肠上皮细胞进行TJP1蛋白免疫荧光检测，细胞核采用Hochest33342抗体(Solarbio C0031)标记，TJP1蛋白采用TJP1抗体(碧云天生物技术公司，货号：AF8394)标记。图8为F30代鸡肠道上皮细胞的TJP1蛋白表达情况的免疫荧光检测图，从图8中可以看出，F30代肠上皮细胞TJP1蛋白结果呈阳性，即呈现荧光，未添加TJP1抗体阴性对照结果呈阴性。该结果说明所制备的细胞高表达肠上皮细胞标记TJP1。

6.差异表达基因聚类分析和同源比较

对不同代次的小肠上皮细胞差异基因表达的FPKM值为表达水平进行层次聚类分析，图9为F10代、F20代和F30代鸡肠道上皮细胞的差异基因表达的FPKM层次聚类分析图，其中，横轴代表不同代次的细胞组，纵轴代表基因，深色代表基因表达上调，浅色代表基因表达下调。从图9中可以看出，同组内的基因表达模式相近，可能具有相似的功能或共同参与的生物学过程。结果显示F10代、F20代和F30代不同组别的细胞差异表达基因都分别聚在一起，随代次的增加，参与调控的基因表达模式也逐渐发生变化。同时，从F20代和F30代聚类图中，发现这两个代次的基因表达稳定，同一代次之间差异不明显，随着代次的不断变化，基因表达越来越稳定。

7.细胞间差异表达基因KEGG通路分析

根据转录组测序结果选择F10代和F30代的小肠上皮细胞间高表达的差异基因进行KEGG富集分析，发现它们显著富集204条通路。图10为F10代和F30代鸡肠道上皮细胞的差异表达基因的KEGG通路分析图，结果显示，差异基因主要涉及9条途径，分别是细胞周期、MAPK信号通路、Wnt信号通路、细胞衰老、TGF-β信号通路、FoxO信号通路、p53信号通路、细胞凋亡和ErbB信号通路，这些信号途径主要是与物质代谢和细胞周期调控相关通路，侧面说明了所建立细胞的主要功能是物质转运代谢功能的肠上皮细胞。其中，发现51个差异表达基因(DEGs)显著富集于CELL CYCLE(细胞周期)通路，在此通路中细胞周期蛋白Cyclin和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK复合物发挥着着重要作用。

8.细胞间差异表达基因细胞周期差异分析

采用KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)分析了细胞间差异表达基因在CELL CYCLE信号通路中的功能网络互作关系。图11为F10代和F30代鸡肠道上皮细胞的差异表达基因的细胞周期信号通路分析图(图中浅灰色代表下调基因，深灰色代表上调基因，黑色代表无差异基因)，结果显示在细胞培养和传代次数增加以后，细胞增殖能力比早期代数显著增加，细胞周期趋于稳定，说明该细胞在传代次数增加以后有利于重复性实验的进行。

随后，利用转录组测序结果，筛选出显著性差异表达的基因，采用实时荧光定量PCR技术对F10代和F30代细胞的相关mRNA的表达水平进行验证。图12为F10代和F30代鸡肠道上皮细胞的差异表达基因的实时荧光定量PCR的验证结果统计图，结果显示，促进细胞增殖的Cdk1、Cdc25a、Perp2、Ctse1和Ccne2的mRNA表达上调；而抑制周期运转的Tp53i3、Cdknla、Ccnb1、Ccng1和Tgfb3的mRNA表达下调，该结果与转录组测序结果一致。

9.应用柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)接种鸡肠道上皮细胞模型

将纯化后的E.tenella子孢子接种于鸡肠道上皮细胞模型，图13为E.tenella子孢子在鸡肠道上皮细胞的发育情况显微镜下明场观察示意图。结果显示，0h子孢子游离细胞表面，似月牙样，活力较好(如图13中A所示)；培养6h后，子孢子开始成对入侵细胞，子孢子中部凹陷，两端较尖，形成带虫空泡(如图13中B所示)；12h后多个子孢子一起定植细胞内发育，形态变肥，中央变直，排列整齐(如图13中C所示)；48h后发现球虫子孢子形态变圆，紧密连接，旋转式运动(如图13中D所示)；72h后发现裂殖子数量增加，游离于细胞内部(如图13中E所示)；140h后可发育为裂殖体，出现包裹裂殖子的圆形滤泡，镜下观察原地缓慢蠕动(如图13中F所示)。

通过对细胞爬片进行HE染色的方法对子孢子在鸡肠道上皮细胞上的发育情况进行探究，图14为E.tenella子孢子在鸡肠道上皮细胞的发育情况的HE(苏木素-伊红)染色图。结果显示子孢子6h内入侵细胞并在细胞核附近定植，完成入侵，并发育成纳虫空泡，子孢子外形由长纺锤形变钝圆形并向侧边突起形成椭圆形的粉红色滋养体，2个折光体消失(如图14中A所示)；24h子孢子脱囊继续发育，形成单核滋养体，且滋养体几乎占据整个子孢子，子孢子外形呈长椭圆形开始向第一代裂殖体发育(如图14中B所示)；30h后子孢子环形质膜滤泡包裹子孢子(如图14中C所示)；48h子孢子外形轮廓完全消失，球形的第一代裂殖体形成，裂殖体内含大量月牙形的I代裂殖子(如图14中D所示)；54h后形成抱团裂殖子(如图14中E所示)；72h后第Ⅱ代成熟裂殖体出现，成团裂殖子开始向四周游离，分布于细胞中(如图14中F所示)。

上述结果表明E.tenella子孢子接种鸡肠道上皮细胞模型进行体外培养能完成第Ⅱ代裂殖生殖，并释放裂殖子。

对比例1

9胚龄鸡小肠上皮细胞分离培养传代

本实验采用组织块培养法分离培养9胚龄鸡胚小肠上皮细胞，图15为9胚龄分离岭南黄鸡胚小肠上皮细胞原代细胞进行传代培养后的细胞形态示意图。结果显示，培养24h后，细胞逐渐增殖，并包围其组织；培养至第48h后，细胞增殖迅速，形态呈明显的多边型，结构显著；96h后观察该细胞，形态发生一定的变化，由原来的卵圆形分化为梭形，且细胞生长状态较好，显微镜下观察细胞颜色明亮有光泽分布均匀，这时细胞密度达90％，进行传代；传代后培养24h，细胞形态变化，呈明显的梭形；培养48h，部分细胞变圆，呈多角形，细胞周围发亮；培养120h，细胞显著性变化，形态拉长变尖，肉眼观察细胞颜色暗淡、无光泽，并出现空泡化现象，最终趋于凋亡。

以上结果表明禽类小肠上皮细胞可能不同于哺乳动物，由于该类细胞自身的性质，更新速率较快，体外需求营养条件苛刻，体外较难维持长期培养。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。