一种龙柏叶抗冻蛋白及其制备方法

摘要

本发明涉及一种龙柏叶抗冻蛋白及其制备方法，属于抗冻蛋白技术领域。其通过冷诱导、浸提、离心、蛋白沉淀得到粗龙柏叶抗冻蛋白，再通过蛋白纯化和二次蛋白沉淀得到电泳纯的龙柏叶抗冻蛋白；其氨基酸序列中包括如SEQID No.1所示片段。采用本发明所述的方法，能够简单快速的从龙柏叶中提取分离出具有较好热稳定性的电泳纯抗冻蛋白，这为进一步纯化龙柏叶抗冻蛋白并研究其结构、功能与抗冻机制及在冷冻食品中的应用奠定了有价值的前期工作，也为植物抗冻蛋白的研究扩充了资源。

说明书

技术领域

本发明涉及一种龙柏叶抗冻蛋白及其制备方法，通过该方法成功提取并分离得到龙柏叶中的抗冻蛋白，属于抗冻蛋白技术领域。

背景技术

抗冻蛋白是一些生活在零度以下环境的生物产生的抵抗冷冻威胁的蛋白，其能够与冰晶结合从而修饰冰晶形态、降低溶液冰点和抑制冰晶重结晶，因此也被称为冰结合蛋白。自从20世纪60年代末在南极鱼类的血液中发现了抗冻糖蛋白以来，在许多生物中已经发现了各种类型的抗冻蛋白。其中植物AFPs与其他AFPs相比有着更好的抑制冰重结晶能力，这使其能够在更低的温度环境温度下生存，降低冰晶对组织细胞的损伤。基于此特性，植物抗冻蛋白在冷冻食品中有着很好的应用前景。但相比于耐冻植物种类的庞大数量，目前研究人员对于植物抗冻蛋白的发掘还较少，这可能限制了植物抗冻蛋白的研究和工业化应用。

龙柏，是柏科圆柏属植物圆柏的栽培变种。经过多年引种，龙柏广泛种植于全国各地，是一种常见的耐寒树种，能够在中国北方零度以下环境顽强生存，保持四季常青，其枝和叶可以入药，具有活血利尿、祛风散寒的功效，是具有重要经济价值的植物资源。本发明提供了龙柏叶抗冻蛋白的提取分离方法，该方法能够快速简单的获得具有较好热稳定性的电泳纯的龙柏叶抗冻蛋白，这为进一步纯化龙柏叶抗冻蛋白，并研究其结构和抗冻机制及在冷冻食品中的应用奠定了有价值的前期工作，也为植物抗冻蛋白的研究扩充了来源。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种具有较好热稳定性的龙柏叶抗冻蛋白，通过该方法能够简单快速的从龙柏叶中提取纯化得到具有较好热稳定性的电泳纯抗冻蛋白。

本发明的技术方案，一种龙柏叶抗冻蛋白，其氨基酸序列中包括如SEQ ID No.1所示片段。

进一步地，所述氨基酸片段表现出抗冻活性。

进一步地其具有高含量的亲水性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基，及高达75％的脂肪族氨基酸含量。

所述龙柏叶抗冻蛋白的制备方法，通过冷诱导、浸提、离心、蛋白沉淀得到粗龙柏叶抗冻蛋白，再通过蛋白纯化和二次蛋白沉淀得到电泳纯的龙柏叶抗冻蛋白。

进一步地具体步骤如下：

(1)冷诱导：在冬季采摘长势良好的龙柏新鲜枝叶，清洗干净后在低温处冷诱导放置处理；将冷诱导后的龙柏叶片置于粉碎机，倒入液氮，将叶片打碎；

(2)浸提：向步骤(1)所得叶片中倒入2～3倍质量的Tris-HCl缓冲液搅拌浸提1～2小时，过滤后得到浸提液；

(3)离心：将步骤(2)所得浸提物在4～10℃、10000～15000g的转速下离心25～35分钟，取上清液；

(4)蛋白沉淀：取4～5倍体积的预冰冷丙酮倒入步骤(3)所得上清液中，在-20℃环境下沉淀10～15h后，在4～10℃、10000～15000g的转速下离心15～25分钟，取沉淀；冻干，得到粗龙柏叶抗冻蛋白；

(5)蛋白纯化：将步骤(4)制备所得粗龙柏叶抗冻蛋白复溶于Tris-HCl缓冲液中，60～100℃水浴加热10～30分钟，得到电泳纯的具有较好热稳定性的龙柏叶抗冻蛋白；

(6)蛋白沉淀：取4～5倍体积的预冰冷丙酮倒入步骤(5)所得热处理后的龙柏叶抗冻蛋白溶液中，在-20℃下沉淀10～15小时后，在4～10℃、10000～15000g的转速下离心15～25分钟，取沉淀；冻干，即得到电泳纯龙柏叶抗冻蛋白。

进一步地所述Tris-HCl缓冲液具体为60～65mM、pH 6～8的缓冲液。

进一步地所述预冷丙酮温度为-10～-20℃。

进一步地所述冷诱导具体为在-20℃环境下低温放置4周以上。

包括所述龙柏叶抗冻蛋白或SEQ ID No.1所示片段的蛋白质异构体和衍生物。

所述龙柏叶抗冻蛋白的应用，含有上述蛋白的食品，其表现出抗冻特性。

本发明的有益效果：采用本发明所述的方法，能够简单快速的从龙柏叶中提取分离出具有较好热稳定性的电泳纯抗冻蛋白，这为进一步纯化龙柏叶抗冻蛋白并研究其结构、功能与抗冻机制及在冷冻食品中的应用奠定了有价值的前期工作，也为植物抗冻蛋白的研究扩充了资源。

附图说明

图1为龙柏叶抗冻蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳。

1为标准蛋白marker，2为粗龙柏叶抗冻蛋白，3为热处理后龙柏叶抗冻蛋白，4为热处理后龙柏叶抗冻蛋白的非还原电泳。

图2为电泳纯龙柏叶抗冻蛋白二级质谱图。

图3为龙柏叶抗冻蛋白与蛋白cytochrome f肽链序列匹配情况。

图4为龙柏叶抗冻蛋白的三维结构模型。

具体实施方式

以下实施例中龙柏叶采自冬季河南工业大学校园；丙酮、盐酸，郑州轩之成化工科技有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、甘氨酸、PAGE胶蛋白微量回收试剂盒、彩虹130广谱蛋白marker，北京索莱宝科技有限公司；三(羟甲基)氨基甲烷，北京博奥拓达科技有限公司；十二烷基硫酸钠，上海麦克林生化科技有限公司。

实施例1

(1)冷诱导：于每年冬季采集河南工业大学校园的龙柏枝条叶片，-20℃冰箱中，进行冷诱导处理一个月左右；取100g龙柏叶叶片，放入粉碎机，倒入适量液氮，将叶片在低温下破碎后，倒入烧杯；

(2)浸提：向步骤(1)所述烧杯中加入200mL的Tris-HCl(62.5mM，pH 6.8)，搅拌浸提2小时，过滤后得到浸提液；

(3)离心：将步骤(2)所得浸提液在4℃、12500g的转速下离心30分钟，取上清液；

(4)蛋白沉淀：取四倍体积的预冰冷丙酮倒入上清液中，在-20℃冰箱沉淀12小时后，在4℃、12500g的转速下离心20分钟，取沉淀，-45℃冻干，得到粗龙柏叶抗冻蛋白；

(5)蛋白纯化：将步骤(4)所得粗龙柏叶抗冻蛋白复溶于Tris-HCl(62.5mM，pH6.8)，75℃水浴加热20分钟，得到电泳纯的具有较好热稳定性的龙柏叶抗冻蛋白；

(6)蛋白沉淀：取4倍体积的预冰冷丙酮倒入热处理后的蛋白溶液中，在-20℃冰箱沉淀12小时后，在4℃、12500g的转速下离心20分钟，取沉淀，-45℃冻干，得到电泳纯龙柏叶抗冻蛋白。

实施例2龙柏叶抗冻蛋白的检测

1.SDS-PAGE电泳

将实施例1提取的龙柏叶抗冻蛋白进行蛋白电泳，龙柏叶抗冻蛋白的SDS-PAGE采用5％浓缩胶和12％分离胶。电泳时，浓缩胶时电压为30V，分离胶时电压为60V，电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色2小时，脱色拍照。

具体结果如图1所示。图中1为标准蛋白marker，2为粗龙柏叶抗冻蛋白，3为热处理后龙柏叶抗冻蛋白，4为热处理后龙柏叶抗冻蛋白的非还原电泳。

由图1可以看出，经丙酮沉淀得到的粗龙柏叶抗冻蛋白共有4条蛋白条带，集中在25KDa到55KDa之间，其中25KDa附近的蛋白较少，而33KDa和55KDa附近的蛋白最丰富，且在33KDa处具有两条分子量相近的蛋白条带。将粗龙柏叶抗冻蛋白经热处理后，25KDa附近的蛋白条带消失，55KDa附近的蛋白条带显著变浅，表明经热处理后这两种蛋白发生降解。而热处理后的龙柏叶抗冻蛋白的非还原电泳仅在33KDa处有一条蛋白条带，这可能是由于在33KDa附近的目的蛋白存在分子间二硫键，经还原处理后，分子间二硫键断裂形成两个不同分子量的蛋白。

2.质谱分析

将泳道3的电泳蛋白条带切胶后进行MALDI-TOF-MS-MS质谱鉴定(上海生工生物科技有限公司)，其二级质谱图如图2所示。根据二级质谱得到的序列片段在蛋白数据库中进行检索与比对。根据protein score，经筛选后，得到龙柏叶抗冻蛋白匹配蛋白cytochromef(chloroplast)[Juniperus chinensis](Accession No.：QZI85440.1)的理论肽段共有19段匹配。序列覆盖情况如图3所示：黑色为蛋白cytochrome f序列，红色为抗冻蛋白与其重复部分，序列覆盖率为54％。

对龙柏叶抗冻蛋白的氨基酸组成进行分析，其中疏水性氨基酸残基占比44.86％，亲水性氨基酸残基占比55.14％，这与大麦抗冻蛋白的氨基酸组成分析相似。根据以往研究当抗冻蛋白的冰结合位点的疏水残基比例平均为39％，亲水性残基大于40％时，抗冻蛋白的抗冻机制符合吸附-抑制机制的锚定结合水模型。另抗冻蛋白的脂肪族氨基酸含量为75％，芳香族氨基酸含量为15％，杂环族氨基酸含量为10％，通常脂肪族氨基酸含量高，表明蛋白具有较好的耐热性，这与龙柏叶抗冻蛋白在提取过程中具有热稳定性结果一致。

3.热滞活性分析：见表1

取10mg样品置于铝制坩埚中，参比为空锅。设置起始温度为10℃，以1℃/min的速率降温至-25℃，停留5min至样品完全冻结，再以1℃/min的速率升温至10℃。记录样品熔点T

所述Φ＝(1-ΔH

为检测龙柏叶抗冻蛋白的抗冻活性，本发明采用差示扫描量热仪测定龙柏叶抗冻蛋白溶液在部分熔融状态下的热滞活性。

表1龙柏叶抗冻蛋白的热滞活性

表1显示了提取和纯化过程中龙柏叶抗冻蛋白在不同保留温度下的THA值。粗龙柏叶抗冻蛋白溶液的保留温度为0.2℃时，体系冰晶含量较少，此时龙柏叶抗冻蛋白的THA值高达3.70℃，当保留温度为0.1℃和0.0℃时，体系冰晶含量分别为12.3％和17.3％，蛋白热滞值分别为0.40℃和0.33℃，根据以往研究，当冰晶含量大于10％时，所得THA值较准确，因此粗龙柏叶抗冻蛋白的最高THA值约为0.40℃。经热处理后的龙柏叶抗冻蛋白溶液，当保留温度为0.3℃和0.2℃时，体系冰晶含量为11.8％和20％，蛋白热滞值为0.44℃和0.35℃，表明经热处理后龙柏叶抗冻蛋白仍具有较好THA，约为0.44℃。将热处理后的龙柏叶抗冻蛋白的非还原电泳蛋白条带经微量回收得到的电泳纯龙柏叶抗冻蛋白，当保留温度为0.5℃和0.4℃时，体系冰晶含量为7.8％和16.5％，热滞值分别为0.51℃和0.43℃，表明此电泳纯龙柏叶抗冻蛋白的THA约为0.43℃。

实施例3 3D结构预测

龙柏叶抗冻蛋白的三维结构预测如图4所示。目前为止，植物AFPs只有黑麦草AFP的晶体结构已知，它是由8圈扁β-折叠构成，其中4圈是长的β-折叠，4圈是短的β-折叠，两个平坦的β-折叠平面被称为“a”面和“b”面，根据突变实验证明只有“a”面参与冰晶结合。根据以往研究，在对多个植物AFPs使用同源建模预测后发现，来自不同植物的AFPs可以形成β-折叠、α-螺旋和无规则结构。本发明共构建了5个ScAFP的三维结构，在5个模型结构中ScAFP分子两端均存在两个长链的α-螺旋，在分子内部存在数个β-折叠。由于不同物种中的AFPs几乎都是独立进化的，它们的序列和结构完全不同，因此要探究抗冻蛋白具有抗冻特性的序列或结构特征，需要大量的样例以找到其共同的序列或结构特征。

本发明制备得到一种新型植物抗冻蛋白并通过预测得到其3D结构，这为植物AFPs的抗冻机理研究扩充了数据库。

对龙柏叶抗冻蛋白的结构和性质进行预测分析发现，龙柏叶抗冻蛋白的等电点为9.06，相对分子质量为35655；二级结构中存在15.89％的α-螺旋结构，19.31％的β-折叠结构，64.8％的无规则卷曲；具有较高的表面溶剂可及性；其三维结构具有两个长链α-螺旋和数个β-折叠结构。

序列表

<110> 河南工业大学

<120> 一种龙柏叶抗冻蛋白及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 95

<212> PRT

<213> 龙柏叶抗冻蛋白(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Glu Ser Gly Val Ile Asn Glu Gln Asn Ile Ser Glu Ser Lys Phe Ser

1 5 10 15

Ile Leu Glu Thr Gly Ile Lys Phe Val Gln Ala Gly Ser Glu Val Ser

20 25 30

Ala Leu Leu Gly Arg Ser Ala Pro Ala Phe Thr Gln Leu Asp Ile Lys

35 40 45

Val Ala Leu Val Tyr Gly Gln Met Asn Glu Pro Pro Gly Ala Arg Val

50 55 60

Gly Leu Thr Ala Leu Thr Met Ala Glu Tyr Phe Arg Val Ile Asp Thr

65 70 75 80

Gly Gly Pro Leu Ser Val Pro Val Gly Glu Thr Thr Leu Gly Arg

85 90 95