一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的NO微泡制剂及促进卵母细胞体外成熟的方法

摘要

本发明属于生殖生物学领域，具体涉及一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的NO微泡制剂及促进卵母细胞体外成熟的方法，其由壳膜层与内层空腔组成，所述内层空腔填充有包含NO的气体；所述壳膜层包括脂质材料、起泡剂、冻干支撑剂，所述脂质材料、起泡剂、冻干支撑混合后加入溶剂进行冷冻干燥后制成冻干粉末，得到壳膜层；所述的脂质材料成分选自天然磷脂、氢化磷脂、合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物中的一种或多种；所述起泡剂为吐温‑80；所述冻干支撑剂为Poloxamer 188。本发明提供的NO微泡制剂添加进常规卵母细胞体外培养液中可实现NO长效释放，并且生物安全性高，促进了GV期卵母细胞的体外成熟率，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生殖生物学领域，具体涉及一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的NO微泡制剂及促进卵母细胞体外成熟的方法。

背景技术

不孕症已成为当今社会上的一种不可忽视的常见病。未成熟卵母细胞体外成熟培养(in vitro maturation, IVM)是指从不孕患者体内获取未成熟卵子，通过模拟体内卵母细胞的成熟环境，将卵子体外培养至成熟，再通过体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术治疗不孕症的方法。

一氧化氮（nitric oxide, NO）作为一种细胞信号分子广泛存在于生物体内，研究表明NO参与了女性生殖的各个阶段，例如卵泡发育、卵母细胞成熟、排卵、黄体变性、受精、胚胎植入、妊娠维持、分娩调节和月经/发情周期调节。NO对卵母细胞成熟的促进作用可能是由于 cGMP 水平升高和 cAMP 活化降低。然而，过量的 NO 也会抑制卵母细胞的成熟。这些表明NO参与并调控卵母细胞成熟过程。

鉴于NO功能的多样性，因此其在心血管治疗、抗癌治疗和抗菌治疗等方面都有很大的药用潜能。但是，由于NO在体内半衰期极短，仅数秒钟，一般仅起局部作用，吸入NO给药的途径不方便，而常用的NO供体物质如硝普钠（SNP）等具有一定的细胞毒性，不利于卵母细胞的体外培养。故开发有临床实用价值的NO给药方式，既可作为一种NO体内的运输形式，又可作为一种储存形式，具有广阔的临床应用前景，其中一种尝试就是基于脂质材料的药物载体系统。

从临床的角度出发，理想的促进卵母细胞体外成熟的NO微泡制剂应满足一下要求：（1）生物安全性高，所选材料无毒无刺激；（2）制剂性状稳定，便于运输和保存；（3）添加入培养体系后可稳定长效地释放NO气体，在未成熟卵母细胞体外成熟培养期间提供外源NO。目前以生物安全性较高的微泡和脂质材料药物递送在生殖领域应用较少。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的NO微泡制剂及促进卵母细胞体外成熟的方法。

本发明所采取的技术方案如下： 一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的NO微泡制剂，其由壳膜层与内层空腔组成，所述内层空腔填充有包含NO的气体；所述壳膜层包括脂质材料、起泡剂、冻干支撑剂，所述脂质材料、起泡剂、冻干支撑混合后加入叔丁醇进行冷冻干燥后制成冻干粉末，得到壳膜层；

所述起泡剂为吐温-80；

所述冻干支撑剂为Poloxamer 188。

所述的脂质材料成分选自天然磷脂、氢化磷脂、合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物中的一种或多种。

所述壳膜层制备过程包括以下步骤：氢化蛋黄磷脂和天然磷脂PC混合物作为空白脂质微泡的成膜材料，吐温-80为起泡剂，Poloxamer 188为冻干支撑剂，按照4：10：100的比例混合得到混合物，加入叔丁醇，冷冻干燥后得到冻干粉末。

每114mg混合物加入2mL叔丁醇。

每20mg冻干粉末加NO气体。

一种促进卵母细胞体外成熟的方法，在卵母细胞体外培养的过程中使用如上所述的促进未成熟卵母细胞体外成熟的NO微泡制剂。

NO微泡制剂在卵母细胞体外培养体系中的终浓度为0.05-0.5mg/mL。

本发明的有益效果如下：本发明提供的NO微泡制剂添加进常规卵母细胞体外培养液中可实现NO长效释放，并且生物安全性高，促进了GV期卵母细胞的体外成熟率，而且降低了细胞内的氧自由基水平及钙离子水平，保护了线粒体功能，提高了卵母细胞质量，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1中，A为NO微泡制剂的构建过程示意图，B为未包裹NO的脂质微泡（MB）和NO微泡（NO-MB）制剂在外观上的对比，C为未包裹NO的脂质微泡（MB）和NO微泡（NO-MB）制剂在微观形貌上的对比；

图2 中，A为NO微泡的粒径分布和粒子数，B为未包裹NO的脂质微泡（MB）和NO微泡（NO-MB）制剂的稳定性检测结果；

图3中，A为NO微泡制剂安全性检测结果，B为NO微泡处理细胞后，细胞内NO含量随时间变化的检测结果；

图4中，A为对照组（Control）、NO微泡处理组（NO-MB）、SNP给药组（SNP）培养16-18h后在显微镜下的卵母细胞胞质形态，B为对照组（Control）、NO微泡处理组（NO-MB）、SNP给药组（SNP）培养16-18h后成熟率的对比；

图5为利用荧光探针检测NO微泡处理后卵母细胞内(A)NO含量(B)钙离子含量(C)线粒体膜电位变化(D)ROS含量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

（1）脂质微泡的制备

应用不同类型和比例的磷脂材料或者磷脂材料混合物、起泡剂和冻干支撑剂等制备脂质微泡，并通过冻干粉形态及复溶性、脂质微泡浓度、脂质微泡形态、脂质微泡粒径及粒径分布等作为指标，对脂质微泡的质量进行评价。其中的磷脂类成分选自天然磷脂、氢化磷脂、合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物中的一种或几种。

将磷脂材料或者磷脂材料混合物、起泡剂和冻干支撑剂按照表1所示的原料混合得到混合物，加入叔丁醇（叔丁醇用量为：每114mg混合物加入2mL），混合物加热至65℃完全溶解混匀，冷冻干燥后得到冻干粉末。

初步评价微泡质量的方法：吸取少量微泡冻干粉样品混悬液点于细胞计数板上，通过光学显微镜(400倍)观察细胞计数板每个小格内的微泡个数并换算成微泡浓度、粒径2-8μm范围内的微泡百分比A，10分钟后粒径2-8μm范围内的微泡百分比B，用于评价微泡的质量。

其中，实施例1制备得到的微泡质量为最佳，以下实验选择实施例1制备得到的微泡进行。

（2）NO微泡的制备及稳定性实验

称取制备好的空白脂质微泡冻干粉20mg，加入西林瓶中密封，并抽出瓶内气体，用注射器加入1ml NO气体，可放置备用，使用时加入1ml工作液，混匀后可配制成需要的浓度。如图1所示，未包裹NO的脂质微泡（MB）和NO微泡（NO-MB）制剂在外观上没有显著差异。如图2所示，NO微泡的粒径90%<3.681μm，相比与未包裹NO的脂质微泡，NO微泡在室温环境下具有更高的稳定性。

（3）NO微泡细胞毒性实验和细胞内NO浓度检测

细胞毒性实验：收集人颗粒细胞，消化成单个细胞后进行原代细胞培养，细胞密度合适时制备细胞悬液进行细胞计数，然后根据合适的细胞数（约4×104）铺96孔板，每孔约100ul细胞悬液，37℃培养，待细胞贴壁后可加入不同浓度NO微泡处理，每个浓度可做4-6个重复孔，37℃培养24h后，用CCK8方法，酶标仪测定细胞存活率。

荧光探针法检测细胞内NO浓度：如上所述进行颗粒细胞原代培养，细胞密度合适时制备细胞悬液进行细胞计数，然后根据合适的细胞数（约1.2×105）铺48孔板。以SNP为对照，用不同浓度制剂处理不同时间（如4h、6h、12h、24h、48h）。按照1:1000比例稀释DAF-FMDA，使终浓度为5微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DAF-FM DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。37ºC细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA。对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

如图3所示，MTT结果显示在5mg/mL的浓度下NO微泡毒性明显小于SNP。在细胞内NO检测试验中，在不同时间点对细胞内NO含量进行检测，可以看出相比空白对照组，NO微泡制剂和SNP都能够显著增加细胞内NO的含量，但NO微泡和SNP之间没有显著差异.

（4）小鼠未成熟卵母细胞体外成熟培养

雌鼠腹腔注射 PMSG 10IU，44 ～46h 颈椎脱臼法处死。取出双侧卵巢，在体视显微镜下用 1ml 针头刺破卵泡，收集生发泡 GV 期卵母细胞，放入经 37℃、CO2 孵箱中平衡2-6h 的含不同浓度NO微泡制剂、SNP或不含其它物质添加的通用IVM培养基中培养。

（5）对卵子质量进行评估，评估NO微泡制剂及SNP对卵子质量影响

未成熟卵母细胞体外成熟情况观察：观察NO微泡或者SNP添加入IVM培养体系后卵母细胞成熟率，成熟卵子的形态。如图4所示，显微镜下观察，NO微泡处理组有更高的成熟率，且成熟的卵母细胞胞质形态优于对照组及SNP给药组。

线粒体膜电位测定：以JC-1亲脂阳离子荧光染料测定线粒体膜电位，荧光显微镜观察分析。高膜电位线粒体呈红色，低膜电位呈绿色。活性氧（ROS）水平检测：利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。细胞内钙离子水平检测：细胞内钙离子荧光探针Fluo-4 AM进行钙离子水平的检测。上述三种荧光探针按照1:1000比例稀释，使终浓度为5微摩尔/升。去除细胞培养液， 37ºC细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的荧光探针。样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光酶标仪或流式细胞仪检测。如图5所示，NO微泡制剂降低了细胞内氧自由基水平，提高了钙离子浓度，保护了线粒体功能。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。