一种能有效监测东亚飞蝗的气味受体衍生肽及其生物传感器

摘要

本发明公开一种能有效监测东亚飞蝗的气味受体衍生肽及其生物传感器，公开了该气味受体衍生肽用于制备能有效监测东亚飞蝗灾害发生情况的设备的用途，该气味受体衍生肽具有如SEQ ID NO：2或3所示的氨基酸序列。本发明进一步公开了该生物传感器，包括基底和叉指电极，所述的叉指电极上牢固附着有单壁碳纳米管，并且还包括与单壁碳纳米管连接的以上性信息素受体衍生肽。本发明能够对东亚飞蝗进行特异性监测，可以特异性地识别东亚飞蝗释放的聚集信息素，而对寄主挥发物的响应小。在实验室条件下，在12000cm

说明书

技术领域

本发明涉及一种能有效监测东亚飞蝗的气味受体衍生肽及其生物传感器。

背景技术

东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)是草原和农田最重要的农业害虫之一。由于它会爆发并给农业造成严重破坏，因此受到了研究人员的广泛关注。密度低的个体称为散居型东亚飞蝗，密度高的群体称为群居型。危害小麦、玉米、水稻、甘蔗、棉花等2科数十种作物。L.migratoria能够远距离迁徙，群居型蝗虫对农作物、牧场和其他绿色植被具有破坏性。

多年来，这种害虫主要通过施用多种杀虫剂进行防治，但也造成了环境污染。为了控制蝗虫入侵，需要潜在的监测策略。传统的方法是对各龄期的发生情况进行实地调查，准确但耗费人力。此外，遥感还用于监测L.migratoria，包括基于无人机的数据、WebGIS平台和MODIS。然而，由于环境更复杂，遥感数据集和应用程序是否可能不足以映射和监测重要变量的问题出现了。监测是控制害虫的发生和发展的重要措施，通过监测有害生物的种群发生动态，才能制定适时、有效的防治措施。生物电子气体传感器有着成本低、操作简单、响应快、实时监测等优点，在检测有害气体领域得到了广泛的应用。例如，金属氧化物、石墨烯和导电聚合物已被用作不同气态物质的传感材料。然而，这些材料的检测极限和选择性通常不令人满意。近年来，气味受体(OR)和气味受体衍生肽(ORP)作为一种新的敏感物质出现。气味受体(OR)是一种在嗅觉神经元中表达的膜蛋白，属于G蛋白偶联受体，具有7个α螺旋跨膜结构域(TM)，可以特异性识别对应的目标气味(配体)。然而，受体蛋白只能在液体中稳定存在，只能在液体中检测目标物质。气味受体衍生肽(ORP)设计自气味受体的配体结合位点区域，简短的多肽片段能稳定的存在于空气中，能高灵敏度、特异性识别目标气味。但是由于气味受体(OR)附着于细胞膜上，提纯后结构会发生改变，所以很难解析其蛋白质结构。目前已鉴定的昆虫气味受体结构只有通过冷冻电镜鉴定出一个榕小蜂Apocryptabakeri的共受体。同源建模来预测蛋白质的三维结构需要目标序列与模板至少拥有25％的相似性，因此无法利同源建模预测其他昆虫气味受体的结构。因此需要选择昆虫性信息素受体这一类气味受体(OR)，设计出气味受体衍生肽对东亚飞蝗进行特异性监测。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的是提供一种气味受体衍生肽用于制备能有效监测东亚飞蝗发生情况的设备的用途，具有如SEQ ID NO：2或3所示的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供一种传感器，包括基底和叉指电极，所述的叉指电极上牢固附着有单壁碳纳米管，并且还包括与单壁碳纳米管连接的聚集信息素受体衍生肽，其序列如SEQ ID NO：2或3所示氨基酸序列，能够对东亚飞蝗进行特异性监测。

进一步的，所述的单壁碳纳米管为羧基化单壁碳纳米管，所述的聚集信息素受体衍生肽的N-末端添加了一个半胱氨酸残基与羧基化单壁碳纳米管连接。

本发明还提供一种有效监测东亚飞蝗发生情况的电子设备，包括如上所述的传感器。

本发明的优点及有益效果：本发明的气味受体衍生肽的传感器可以实时、敏感、特异性地监测到东亚飞蝗释放的聚集信息素的变化，具有监测东亚飞蝗种群动态的潜力，可以特异性地识别东亚飞蝗释放的聚集信息素而对寄主挥发物的响应小。在实验室条件下，在12000cm

附图说明

图1为预测确定性信息素的气味受体衍生肽的流程图；

图2为通过,LmigOR35的一致性预测进行二级结构预测图；

图3为LmigOR35的7个跨膜结构域的3D结构图；

图4为本发明的不同气味受体衍生肽传感器对不同浓度聚集信息素气体的响应图；

图5为本发明的不同气味受体衍生肽传感器对不同数量东亚飞蝗活体产生的聚集信息素气体的响应图；

具体实施方式

下面根据举例对本发明做进一步的说明：

实施例1

制备气味受体衍生肽传感器的试验材料和方法

1、气味受体的选择及结构预测

聚集信息素是由群居性昆虫释放的非常重要的信息素，能引起该物种雌性和雄性的聚集行为。东亚飞蝗通过气味受体识别聚集信息素来聚集、吸引。群居型东亚飞蝗释放聚集信息素，成分为4-甲氧基苯乙烯(4-vinylanisole，4VA)，4VA在田间和实验室内对东亚飞蝗有显著的引诱作用。气味的结合位点都在OR的跨膜结构域(TM)上。气味受体因此推测结合位点位于跨膜结构域上，且因G蛋白偶联受体跨膜结构域通常包含21个疏水的氨基酸序列，其三维结构为一个α螺旋结构，且无蛋白质结构中的对预测有影响的β-折叠以及无规则的loop区。因此推测可以用结构预测较为可靠的跨膜结构域与聚集信息素对接来鉴定结合位点，进而设计出可以连在传感器上识别聚集信息素的多肽序列。

选择东亚飞蝗已经鉴定的识别4VA气味受体，LmigOR35。根据在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的基因登录号，获取这些受体的完整编码区(CDS)氨基酸序列。利用CDS、网站topcons(https://topcons.net/pred/)在线预测这些聚集信息素受体的二级结构，预测得到这些受体的7个跨膜结构域，通常包含21个氨基酸。在7个跨膜结构域(21aa)上下游选择40个氨基酸的序列作为建模序列，即利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对7个带有跨膜结构域的肽链(40aa)分别建模，下载建模结果。

1.1、东亚飞蝗气味受体的筛选

东亚飞蝗依靠释放聚集信息素实现种内的聚集，进而爆发危害，具有特异性。此前已鉴定出东亚飞蝗聚集信息素的成分为4VA，在爪蟾卵母异源表达系统中鉴定出LmigOR35是识别4VA的气味受体基因。因此选择研究东亚飞蝗气味受体LmigOR35识别聚集信息素的结合位点，并将多肽片段连接在传感器上，实现利用多肽传感器监测棉铃虫发生的动态。其中从NCBI上获得HarmOR13、HarmOR6的一级列。完整编码区氨基酸序列FASTA格式如下。

>LmigOR35

MAVDAPWSDTALWLNARLLALGGMWRPPWCPARCYLLYRAWVFFTLFSFFVAQIQALWHFWGDMDKITHDVCLMISIILSITKFFIFNFKEREVFRLVRRIDDTRAEQIETGDSEITSILDASYRSARGVALMMTCLGGSIPGVWAVIPILMRRLGIFPPERELPGTSWYTGRDGETPIYETLYVLQYFSMQNSFFTAVGPDLLFVAFIIHAAGQLEVLNARLRRVGGASDARKLQKAREEEEESGEAGCGELAWRELCGCIRHHQHVIGLIKEIERMVSKIVLLQFLGATVIICVTLYQSSKHTENMAALLMLQGYLGLIMYEVFMYCWYAEDILYQNSRLAVSAYSSGWVGAVPQLQRALVFVICRTQRPLGLTAGKFYYVSRESFVSLMSASYSYYALLRQVNDK

1.2、二级结构预测

利用TOPCONS(https://topcons.net/pred/)预测整个受体的二级结构，由于气味受体跨膜结构域的疏水特性，所以利用氨基酸序列的疏水性预测跨膜结构域的数量以及起止位点。

LmigOR35全长408aa。利用https://topcons.net/pred/预测得到七个跨膜结构域(TM)，氨基酸序号36-56aa,67-87aa,129-149aa,193-213aa,280-300aa,310-330aa,381-401aa，分别为LmigOR35-TM1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6、TM7。表1列出了LmigOR35的7个跨膜结构域的序列。

表1.LmigOR35的7个TM的氨基酸序列

1.3、三级结构的建模

在二级结构中确定了的跨膜结构域(21aa)上下游选择40个氨基酸的序列作为建模序列，利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对带有跨膜结构域的肽链(40aa)分别建模,LmigOR35分别得到了7条α螺旋结构的肽链(图5)。同时跨膜结构域α螺旋结构的特性，且无影响结构预测的β折叠及loop区，因此认为这些建模结果可靠。

1.4、结合位点分析预测可能的结合位点及设计ORP序列

利用Discovery Studio2016中CDOCKER精准对接功能将各个跨膜结构域的3D结构分别与配体分子对接。CDOCKER的操作步骤(settings)：打开receptor文件；利用sketch功能绘制配体；定义receptor活性位点；点击CDOCKER进行精准对接；分析对接结果。利用sketch绘制的构象不同产生的对接结果不同，多次对接后我们记录了所有结果的结合位点。结果中可以查看配体分子每个pose相应的-CDOCKER_ENERGY值，该值越高，表明结合的pose越佳。

LmigOR35与配体4VA对接结果中，其中与TM2、TM4、TM5、TM6、TM7对接成功。经过多次对接，TM2上的结合位点分别为，Met74、Ile77、Ile81，最低cdocker energy为-4.14。TM4上的结合位点分别为，Val199、Leu203，最低cdocker energy为-0.09。其中TM6上的结合位点为，Tyr323、Phe326，cdocker energy为-6.67。TM7上的结合位点为，Tyr381、Leu391，cdocker energy为-8.85。结合位点两侧选择了9-14个氨基酸序列为待合成序列，分别为

2、气味受体衍生肽的制备及与SWCNTs连接

分别在气味受体衍生肽：

ORP1，如SEQ ID NO:1所示，:

ORP2，如SEQ ID NO:2所示，:

ORP3，如SEQ ID NO:3所示，:

以上三种衍生肽的N-末端添加了一个半胱氨酸残基(即C

3、聚集信息素气体的制备

4VA标准品购自天津希恩思奥普德科技有限公司。使用正己烷将4VA稀释至所需浓度。将试剂密封并保存在室温下。等待瓶中的气体气化，实验时注入进测试箱。

目标物质气体标准样品由购买的目标物质稀释(％v/v，分析级)生成。为了确定所需的目标溶液的体积，使用公式(1)，其中V

V

4、制备气味受体衍生肽传感器

首先，对单壁碳纳米管进行羧基改性(成都中科时代纳能科技有限公司生产的羧基化单壁碳纳米管)。将羧基化单壁碳纳米管悬浮在纯乙醇中，超声振动20分钟，得到浓度为0.1mg/mL的悬浮液。然后在叉指电极(14对金电极，电极宽度＝0.15mm，电极间距＝0.18mm，电极厚度＝5μm，基底材料为Al

5、气体检测

以气味受体衍生肽传感器的电阻变化作为检测信号。传感器被放在一个封闭的检测箱中。传感器的实时电阻值由直流探头和电阻分析仪(HPS2518，常州海尔帕电子技术有限公司)测量。当传感器电阻值稳定时，将密闭瓶中的气体用注射器注入检测箱中，注入后密封检测箱。传感器对东亚飞蝗聚集信息素的响应以ΔR/R

6、东亚飞蝗产生的聚集信息素(4VA)的检测

东亚飞蝗购自河北省沧州市，在人工气候箱中±利用新鲜麦苗饲养，光周期为14：10(light:dark)，温度30±2℃，湿度60％。测试前，将一定数量的东亚飞蝗放置至纱网材质的虫笼中，并放入试验箱，一定时间后，打开试验箱并观察传感器的信号变化。

实施例2

试验检测结果

1、气味受体衍生肽传感器检测4VA标准品

如图4所示，气味受体衍生肽传感器对4VA气体的响应图，通过多周期实时测量传感器的电阻变化。

图中a:气味受体衍生肽2传感器对浓度为：10ppb至100ppb的4VA气体的响应；

图中b:气味受体衍生肽3传感器对浓度为：1ppb至100ppb的4VA气体的响应；

本实施例一个测量周期包括气入和气出状态。气体进入状态时，封闭检测室充满了4VA气体，气体排出状态时，用新鲜空气冲洗检测室，直到没有4VA。不含气味受体衍生肽的传感器的电阻在不同种类和浓度的4VA下没有变化，这表明裸单壁碳纳米管对4VA没有响应。ORP2-传感器和ORP3-传感器显示出对4VA的响应。

其次，比较了ORP2和ORP3修饰传感器对4VA的灵敏度，ORP2-传感器对气态4VA的检出限为10ppb，响应范围为10ppb～100ppb(图4(a))，ORP3-传感器对气态H-SP1的检出限为1ppb，响应范围为1ppb～100ppb(图4(b))，因此OPR3-传感器的性能优于ORP2-传感器。该观察结果与分子对接结果一致，即ORP3与4VA对接时的结合能低于ORP2。所以后续实验使用识别能力最强的肽3。

2、气味受体衍生肽传感器检测东亚飞蝗释放的4VA

使用活的东亚飞蝗检测了所制备的ORP3-传感器对东亚飞蝗释放的气态4VA的响应。ORP3-传感器对东亚飞蝗表现出显著的响应。此外，ORP3-sensor显示出随着更多的东亚飞蝗或更长的感应时间，电阻变化更大(图5)。同时，没有ORP3的单壁碳纳米管对100只东亚飞蝗没有反应，证明ORP3是4VA的唯一传感物质。当打开测量盒以清除4VA气体时，信号完全恢复到基线(图5)，表明4VA与ORP3的结合是可逆的，传感器可用于实时监测。

本发明的气味受体衍生肽传感器能够检测出浓度低至1ppb的4VA。气味受体衍生肽3传感器对不同数量的东亚飞蝗进行了高效的实时检测，并实现了实验条件下单只东亚飞蝗的检测。结果表明，该方法制备的气味受体衍生肽传感器提供了一种监测东亚飞蝗灾害的方法。在未来农林中的虫害的实时监测和研究昆虫行为的机理等方面有巨大的应用潜力。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种能有效监测东亚飞蝗的气味受体衍生肽及其生物传感器

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Leu Leu Gln Phe Leu Gly Ala Thr Val

1 5 10

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Ile Met Tyr Glu Val

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Tyr Tyr Val Ser Arg Glu Ser Phe Val Ser Leu

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