检测MYOD1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤或骨肉瘤预后制剂中的应用

摘要

本发明公开了检测MYOD1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤或骨肉瘤预后制剂中的应用。可以检测MYOD1基因在骨肉瘤患者中的表达水平，为骨肉瘤患者转化横纹肌肉瘤以及骨肉瘤预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

说明书

技术领域：

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及检测MYOD1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤或骨肉瘤预后制剂中的应用。

背景技术：

骨肉瘤是发病率最高的原发性骨肿瘤，具有少有的双高发病年龄段，青少年或儿童时期和老年期，约为小儿肿瘤的5％，是儿童和青少年恶性肿瘤死亡率很高的疾病。目前，针对骨肉瘤的诊治手段依然十分保守。自上世纪八十年代化疗被广泛应用以来，近几十年来，骨肉瘤的预后和临床策略几乎没有改变，手术切除结合传统化疗依然是治疗的主要手段，无转移患者的长期生存率约为70％，而转移患者的生存率只有约20-30％。目前，对骨肉瘤患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应临床对骨肉瘤患者进行预后判定的需求。因此，对骨肉瘤患者的预后进行判定，以便制定更佳的治疗方案，显著提高患者生存率，成为骨肿瘤领域亟待解决的重要课题。

此外，我们通过高通量测序偶然间发现在部分骨肉瘤患者中存在横纹肌肉瘤转化的现象。在随后的扩大标本量检测中，我们发现存在MYOD1表达的骨肉瘤患者具有相当比例，且预后不好。在随后的实验验证中我们发现在骨肉瘤细胞中单独过表达MYOD1基因就能够让骨肉瘤细胞诱导分化为肌纤维，发生横纹肌肉瘤转化。因此，MYOD1基因可以作为骨肉瘤中是否出现横纹肌肉瘤转化的特异性检测分子，为骨肉瘤病人的预后和将来的个性化治疗提供检测靶点。

发明内容：

本发明的目的是旨在克服现有技术的不足，提供检测MYOD1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤以及骨肉瘤预后检测制剂中的应用，所述的MYOD1基因CDS序列见SEQ ID NO.1。MYOD1基因gDNA序列见SEQ ID NO.2。

所述的应用，检测MYOD1基因表达量的试剂包括PCR检测试剂。

所述的应用，所述PCR检测试剂包括MYOD1基因实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5‘-CGCCATCCGCTATATCGAGG-3’，见SEQ ID NO.3；反向引物： 5’-CTGTAGTCCATCATGCCGTCG-3’，见SEQ ID NO.4。

所述的应用，所述PCR检测试剂还包括GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物:5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，见SEQ ID NO.5；反向引物： 5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’，见SEQ ID NO.6。

本发明还提供了检测MYOD1基因表达量的试剂在制备检测骨肉瘤患者转化横纹肌肉瘤的制剂中的应用，所述的MYOD1基因CDS序列见SEQ ID NO.1。

本发明还提供了过表达MYOD1基因的试剂在制备骨肉瘤细胞诱导分化为肌纤维制剂中的应用。

人MYOD1基因定位于染色体11p15.1，在NCBI中gene ID：4654；在GeneBank 序列中目前只发现一个转录本(NM_002478.5)和一个编码蛋白(NP_002469.2)。在前期的研究工作中，发明人在骨肉瘤组织中提取RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR检测MYOD1基因的表达，发现MYOD1基因表达与否的骨肉瘤患者预后存在明显差异：在检测的样本中，经统计学分析发现MYOD1基因表达的骨肉瘤患者三年复发率为100％，而MYOD1基因不表达患者的三年复发率约为60％(P＝0.016) (图2)，比率风险模型预后分析发现MYOD1基因表达的风险率为0.104,表明 MYOD1基因表达的患者预后较不表达患者预后差，MYOD1基因的表达是骨肉瘤患者预后风险预测的独立危险因素。因此，MYOD1基因能作为骨肉瘤预后的判断标准，作为生物标志物用于制备骨肉瘤患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的骨肉瘤预后预测试剂盒。

将MYOD1基因用于骨肉瘤患者预后的检测方法如下：(1)收集待测个体活检获取或者术后切除的骨肉瘤组织，提取总RNA；(2)以总RNA为模版将MYOD1基因逆转录为cDNA；(3)用MYOD1基因特异性引物和内参GAPDH引物对检测样本和阳性/阴性对照进行实时荧光定量PCR扩增；(4)结果判读：根据以下步骤判断实验结果是否有效：

步骤一：阴性对照和阳性对照样品中的内参GAPDH引物无扩增曲线且Ct值>38，且阳性对照样本中MYOD1基因特异性引物有扩增曲线且Ct<38,说明PCR反应试剂无污染且MYOD1基因特异性引物有效；

步骤二：待测样本中内参GAPDH引物有扩增曲线且Ct<38，并且MYOD1基因特异性引物有扩增曲线且Ct<38，样本中有MYOD1基因表达；

步骤三：待测样本中内参GAPDH引物有扩增曲线且Ct<38，并且MYOD1基因特异性引物无扩增曲线且Ct值>38，样本中无MYOD1基因表达；

步骤四：待测样本中内参GAPDH引物无扩增曲线且Ct值>38，不管MYOD1 基因特异性引物扩增如何，样本制备有问题，结果不可信，需要重新制备样品；

步骤五：阴性对照中内参GAPDH引物有扩增曲线且Ct<38，不管MYOD1基因特异性引物扩增如何，试剂或者样本存在污染，结果不可信，需要更换试剂盒并且重新制备样品；

检测试剂中采用人源MYOD1质粒(pCDH-MYOD-puro，购自湖南丰晖生物科技有限公司)作为阳性对照，阴性对照为RNase-Free TE缓冲液。

综上，利用本发明的检测制剂可以快速判断MYOD1基因在患者骨肉瘤中表达与否，为患者预后的预测提供强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明：

图1为实时荧光定量PCR分析MYOD1基因在不同骨肉瘤样本中的表达情况；

图2为MYOD1基因与骨肉瘤患者预后的关系。

图3为特异性诱导后，稳定过表达MYOD1基因的骨肉瘤细胞株(MG63-MYOD1) 及其对照细胞株(MG63-V)的形态。

图4为特异性诱导后，稳定过表达MYOD1基因的骨肉瘤细胞株(MG63-MYOD1) 及其对照细胞株(MG63-V)的肌纤维特异性蛋白MHC和细胞核DAPI的免疫荧光染色结果。

除非特别说明，本发明采用的试剂，方法和设备为本技术领域常规试剂，方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1制备MYOD1基因用于骨肉瘤预后检测试剂盒(50次反应)

1.RNA稳定溶液50ml

2.异丙醇100ml

3.三氯甲烷100ml

4.Trizol 50ml

5.无酶水10ml

6. 1uM随机逆转录引物50ul

7. 5×逆转录缓冲液200ml

8.三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM)

9. 40U/ul RNA酶抑制剂500ul

10. 200U/ul MMLV逆转录酶50ul

11.Premix Ex Taq 50ul

12. 10uM MYOD1基因实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物：5‘-CGCCATCCGCTATATCGAGG-3’

反向引物：5’-CTGTAGTCCATCATGCCGTCG-3’

13. 10uM内参GAPDH实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’

反向引物：5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’

14. 2×荧光PCR反应液

实施例2骨肉瘤中MYOD1基因检测

1)骨肉瘤组织的保存：收集待测骨肉瘤组织存放于冻存管中，放置与-80℃冰箱备用；

2)组织中RNA的纯化：取适量标本于液氮研磨至粉末状后,加入1ml Trizol室温解离样本5min；加氯仿200μl/ml于离心管中，室温震荡 15-30s，放置5min待液体分层，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新离心管中，加入异丙醇0.5ml混匀，室温静置20min，4℃12000g 离心10min；弃上清，加入75％无酶水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g 离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无核酶水10-20ul 溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0 之间，-80℃保存。

3)RNA逆转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒，20ul逆转录反应体系如表1:

表1

逆转录第一步条件：65℃，5分钟，重新配置反应体系，如表2：

表2

逆转录第二步程序：25℃，5分钟；42℃，60分钟；70℃，5分钟。

4)MYOD1基因特异性引物进行荧光定量PCR：MYOD1基因特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

20ul反应体系如表3:

表3

荧光定量PCR反应程序：95℃，3分钟；95℃，10秒，60℃，30秒，40 个循环。

5)样本中MYOD1基因表达与否的定性分析：根据前述的数据判断条件对样品中MYOD1基因的表达进行判定。分析发现，在25例骨肉瘤样本中，有4例样本存在MYOD1基因的表达。

6)预后判断：通过对实验所采用的25例骨肉瘤患者或家属随访，我们详细询问了这些患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况以及死亡时间等，随访时间为1-60个月。在所检测的25例骨肉瘤患者中，荧光定量 PCR检测MYOD1表达阳性的4位患者与表达阴性的21位患者的无病生存期经Kaplan-Meier生存分析比较，MYOD1表达阳性的患者预后差，具有统计学意义(P＝0.016)。比率风险模型预后分析发现MYOD1基因表达的风险率>1(HR＝9.62)，表面MYOD1基因表达的患者无病生存期显著缩短，该基因的表达是骨肉瘤患者预后风险预测的独立危险因素。以上研究还表明，MYOD1基因可作为骨肉瘤患者预后的特异性分子标志物。

实施例3：过表达人MYOD1基因的骨肉瘤细胞MG63-MYOD1的肌纤维化：

MG63-MYOD1稳定过表达细胞株及其对照细胞株MG63-V的建立

1.慢病毒包装

(1)细胞铺皿：选取细胞状态良好的293T细胞进行慢病毒包装。转染前一天，将适量的胰蛋白酶消化293T细胞于10cm细胞培养皿中均匀铺皿，第二天转染时细胞融合度约为90％；

(2)转染细胞：更换细胞培养液。取2个灭菌离心管，各加入500μl无血清培基Opti-MEM。其中一管加入摇匀的30μl Lipofectamine 2000试剂；另外一管加入pSPAX载体2.5μg，pMD2载体2.5μg(两种载体购买于湖南丰晖生物科技有限公司)，再加入过表达质粒pCDH-MYOD-puro5μg或者等量的空载体pCDH-puro(两种载体购买于湖南丰晖生物科技有限公司)；室温下孵育5分钟后，将两管混合，颠倒混匀；在室温下孵育20分钟后，将形成DNA与Lipofectamine 2000复合物的转染物加入293T细胞，混匀，于 37℃，5％CO

2.慢病毒转染目的细胞构建稳定过表达细胞系

(1)病毒的收集：转染后36小时，用移液枪收集细胞上清液于15ml离心管中，以1300g离心15分钟；收集上清液，并使用0.45μm滤器过滤，去除 293T细胞及其碎片，收集病毒悬液。

(2)病毒的感染：感染前一天，用胰蛋白酶消化对数生长期的MG63细胞至单个细胞，取适量细胞接种于6孔板，感染时细胞融合度约为30％；感染当天，将病毒悬液按照1:1与新鲜培养液混合，并加入终浓度为8ug/ml的 polybrene，充分混匀，制成病毒感染液。去除待感染MG63细胞的培养液后，加入前述的病毒感染液，孵育过夜。

(3)稳定细胞株的筛选：感染第二天，去除病毒感染液，加入新鲜的细胞培养液。待细胞恢复3天后加入puromycin筛选过表达阳性细胞。

(4)稳定细胞株的鉴定：在含有puromycin细胞培养液中生长起来的过表达阳性细胞分别为MG63-MYOD1细胞和MG63-V细胞，MYOD1基因的过表达通过前述的RT-qPCR进行鉴定。

图3:在人骨肉瘤细胞系MG63中通过稳定过表达人MYOD1基因的载体 pCDH-MYOD-puro(过表达载体是由湖南丰晖生物科技有限公司制备)建立MYOD1 过表达细胞株MG63-MYOD1及其转染空载体pCDH-puro的对照细胞株MG63-V。在细胞生长培养基中加入TPA0.1uM处理细胞48小时，然后将细胞生长培养基换成诱导分化培养基，并在其中保持TPA0.1uM。96小时后，在显微镜下可见 MG63-V细胞形态未发生明显改变，依然是大小均匀的上皮样细胞形态；但是 MG63-MYOD1细胞形态却显著不同，细胞大小差别很大，相当一部分细胞形态显著变大，呈现肌纤维样改变，显示细胞出现成肌分化。

实施例4：免疫荧光的方式检测实施例3诱导分化后的MG63-MYOD1细胞株及其对照细胞株MG63-V。

免疫荧光实验

1.1细胞样本的制备

(1)用聚乙基亚胺涂覆盖玻片，在室温下放置1小时。

(2)用无菌水洗涤盖玻片3次，每次1小时。

(3)将盖玻片置于室温干燥环境中紫外光下4小时进行灭菌，并充分干燥盖玻片。

(4)在玻璃盖玻片上培养细胞。

1.2固定细胞

(1)吸去细胞培养液，并用磷酸盐缓冲液短暂冲洗盖玻片上细胞样品。

(2)向样品中加入-20℃预冷的100％甲醇，室温孵育5分钟；

1.3通透化

(1)用含0.1-0.25％Triton X-100的磷酸盐缓冲液孵育样品10分钟。

(2)使用磷酸盐缓冲液中洗涤细胞3次，每次5分钟。

1.4封闭和免疫染色

(1)用含1％牛血清白蛋白、0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液在室温下孵育样品30分钟。

(2)用1％牛血清白蛋白、0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释第一抗体 anti-MHC(Santa Cruz,sc-376157)，常温下与样本孵育1小时。

(3)去除第一抗体孵育液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，每次5分钟。

(4)用1％牛血清白蛋白0.1％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释第二抗体：荧光标记的小鼠抗体(ThermoFisher，A-31571)，与样本在室温黑暗中孵育1h。

(5)去除第二抗体孵育液，在避光环境中用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5 分钟。

1.5复染

(1)用0.1-1μg/mL4',6-二脒基-2-苯基吲哚常温孵育细胞1分钟。

(2)使用磷酸盐缓冲液中洗涤细胞3次，每次5分钟。

1.6封片

(1)用封片介质在载玻片上封闭盖玻片。

(2)在荧光显微镜下观察并拍片。

图4：为了进一步验证MYOD1过表达的稳定细胞株MG63-MYOD1具有成肌分化能力，能够分化为肌纤维，我们使用肌纤维特异性的分子标志物MHC，通过免疫荧光的方式检测通过上述方式诱导分化后的MG63-MYOD1细胞株及其对照细胞株MG63-V。细胞核荧光染料DAPI也与MHC一起染细胞核，方便细胞计数。结果显示，在DAPI染色显示细胞数量相当的情况下，MG63-MYOD1细胞经过诱导分化后，与肌纤维特异性分子标志物MHC的抗体(Santa Cruz,sc-376157)反应呈阳性；而其对照细胞株MG63-V则呈阴性。由此进一步确证，MG63-MYOD1具有成肌分化的能力，可以被诱导分化为肌纤维。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> 检测MYOD1基因表达量的试剂在制备骨肉瘤转化横纹肌肉瘤或骨肉瘤预后制剂中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggagctac tgtcgccacc gctccgcgac gtagacctga cggcccccga cggctctctc 60

tgctcctttg ccacaacgga cgacttctat gacgacccgt gtttcgactc cccggacctg 120

cgcttcttcg aagacctgga cccgcgcctg atgcacgtgg gcgcgctcct gaaacccgaa 180

gagcactcgc acttccccgc ggcggtgcac ccggccccgg gcgcacgtga ggacgagcat 240

gtgcgcgcgc ccagcgggca ccaccaggcg ggccgctgcc tactgtgggc ctgcaaggcg 300

tgcaagcgca agaccaccaa cgccgaccgc cgcaaggccg ccaccatgcg cgagcggcgc 360

cgcctgagca aagtaaatga ggcctttgag acactcaagc gctgcacgtc gagcaatcca 420

aaccagcggt tgcccaaggt ggagatcctg cgcaacgcca tccgctatat cgagggcctg 480

caggctctgc tgcgcgacca ggacgccgcg ccccctggcg ccgcagccgc cttctatgcg 540

ccgggcccgc tgcccccggg ccgcggcggc gagcactaca gcggcgactc cgacgcgtcc 600

agcccgcgct ccaactgctc cgacggcatg atggactaca gcggcccccc gagcggcgcc 660

cggcggcgga actgctacga aggcgcctac tacaacgagg cgcccagcga acccaggccc 720

gggaagagtg cggcggtgtc gagcctagac tgcctgtcca gcatcgtgga gcgcatctcc 780

accgagagcc ctgcggcgcc cgccctcctg ctggcggacg tgccttctga gtcgcctccg 840

cgcaggcaag aggctgccgc ccccagcgag ggagagagca gcggcgaccc cacccagtca 900

ccggacgccg ccccgcagtg ccctgcgggt gcgaacccca acccgatata ccaggtgctc 960

tga 963

<210> 2

<211> 2566

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

aggggtgagg aagccctggg gcgctgccgc cgctttcctt aaccacaaat caggccggac 60

aggagaggga ggggtggggg acagtgggtg ggcattcaga ctgccagcac tttgctatct 120

acagccgggg ctcccgagcg gcagaaagtt ccggccactc tctgccgctt gggttgggcg 180

aagccaggac cgtgccgcgc caccgccagg atatggagct actgtcgcca ccgctccgcg 240

acgtagacct gacggccccc gacggctctc tctgctcctt tgccacaacg gacgacttct 300

atgacgaccc gtgtttcgac tccccggacc tgcgcttctt cgaagacctg gacccgcgcc 360

tgatgcacgt gggcgcgctc ctgaaacccg aagagcactc gcacttcccc gcggcggtgc 420

acccggcccc gggcgcacgt gaggacgagc atgtgcgcgc gcccagcggg caccaccagg 480

cgggccgctg cctactgtgg gcctgcaagg cgtgcaagcg caagaccacc aacgccgacc 540

gccgcaaggc cgccaccatg cgcgagcggc gccgcctgag caaagtaaat gaggcctttg 600

agacactcaa gcgctgcacg tcgagcaatc caaaccagcg gttgcccaag gtggagatcc 660

tgcgcaacgc catccgctat atcgagggcc tgcaggctct gctgcgcgac caggacgccg 720

cgccccctgg cgccgcagcc gccttctatg cgccgggccc gctgcccccg ggccgcggcg 780

gcgagcacta cagcggcgac tccgacgcgt ccagcccgcg ctccaactgc tccgacggca 840

tggtaaggcc gggaccccag gaagtgagga agttagggcg gcgctcggga tatcagggac 900

gcgtttccga gggcggggag ctggccttgc gggaggtttg ggccaggatc cttcccgaga 960

gagaggaccc ccttgtcctg ggcagctgtc actggggtag cctgttttgg aagtgtgcgg 1020

gcaagcgttc gagctgcccc attgggggcg ctattagaac actgcagcgc gaacgtgaag 1080

atctttttct ctacttatcc ctacttccaa aatgtaaatt tgcgcccctt ggtgactgtc 1140

cgcccttggt ttggccctgc atgttgcaga cctcatctcc tacccacccg taattacccc 1200

cccaaccagg acaggtctgg gcccggaact agagccttag gctagagtta gggagggggc 1260

ggctacagga attggtgttc gggcctcgag ccgtcccgcg ggcctgactc agtcgccctt 1320

gctgtttgca gatggactac agcggccccc cgagcggcgc ccggcggcgg aactgctacg 1380

aaggcgccta ctacaacgag gcgcccagcg gtgggtattc cgggcctctc cctgctcgct 1440

cctcctcctt catggagctg tcctggcctc tatctaggac gctcccaccc ccactcacac 1500

acgcctatgt cctgggaagt ggtgcaggag atgaaatact aagcaagtag ctccctgtct 1560

tttggattgt cccggactct aactaaagtc ctcagtttcc aatctgtctc aaagtactgg 1620

gcccgggggt gggaggcttg tcgcggcccc acccctgctt actaaccgag ccctccccgc 1680

gcagaaccca ggcccgggaa gagtgcggcg gtgtcgagcc tagactgcct gtccagcatc 1740

gtggagcgca tctccaccga gagccctgcg gcgcccgccc tcctgctggc ggacgtgcct 1800

tctgagtcgc ctccgcgcag gcaagaggct gccgccccca gcgagggaga gagcagcggc 1860

gaccccaccc agtcaccgga cgccgccccg cagtgccctg cgggtgcgaa ccccaacccg 1920

atataccagg tgctctgagg ggatggtggc cgcccacccg cccgagggat ggtgccccta 1980

gggtccctcg cgcccaaaag attgaactta aatgcccccc tcccaacagc gctttaaaag 2040

cgacctctct tgaggtagga gaggcgggag aactgaagtt tccgcccccg ccccacaggg 2100

caaggacaca gcgcggtttt ttccacgcag cacccttctc ggagacccat tgcgatggcc 2160

gctccgtgtt cctcggtggg ccagagctga accttgaggg gctaggttca gctttctcgc 2220

gccctccccc atgggggtga gaccctcgca gacctaagcc ctgccccggg atgcaccggt 2280

tatttggggg ggcgtgagac ccagtgcact ccggtcccaa atgtagcagg tgtaaccgta 2340

acccaccccc aacccgtttc ccggttcagg accacttttt gtaatacttt tgtaatctat 2400

tcctgtaaat aagagttgct ttgccagagc aggagcccct ggggctgtat ttatctctga 2460

ggcatggtgt gtggtgctac agggaatttg tacgtttata ccgcaggcgg gcgagccgcg 2520

ggcgctcgct caggtgatca aaataaaggc gctaatttat accgcc 2566

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccatccgc tatatcgagg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtagtcca tcatgccgtc g 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaactttgg tatcgtggaa gg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccatcacgc cacagtttc 19