一种抗禽流行性感冒病毒转移因子的制备方法

摘要

本发明涉及一种体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法。本发明以鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，然后用植物血凝素和禽流行性感冒病毒诱导培养淋巴细胞，体外生产抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子。本发明所制备的特异性转移因子可以用于预防和治疗禽流行性感冒，同时可以提高鸡自身的免疫力。本发明具有特异性强、成本低、效果好等优点，是一种较为理想的抗禽流行性感冒病毒转移因子制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及兽药领域，更具体的说，是一种抗禽流行性感冒病毒转移因子的制备方法。

背景技术

它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33%。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车辆往来是传播本病的重要途径。近年来还出现新亚型流感病毒H

目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等，反复冻融并经半透膜透析得到，工艺复杂，无特异性，回收率低。本发明通过体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子特异性强、产出率高，对转移因子的大规模工厂化生产以及大范围应用具有很好的促进作用。近年来，不断有研究发现转移因子可提高机体抵抗力或调节免疫力预防多种疾病，可用于禽流行性感冒的预防和治疗。

发明内容

本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备以及针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫方法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法。

本发明体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法，按照以下步骤进行：

（1）无菌环境下采取鸡脾脏，用外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血10-30ml，加0.8%肝素溶液0.2m1抗凝，静置30-60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS (pH为7.2)液反复洗涤2-3次，离心速度1000-1800转/分，然后用含30%犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；

（2）对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察（1）中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；

（3）病毒的提纯：将禽流行性感冒病毒接种于7-9日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养24-120h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，离心速度10000-12000转/分，得到较为纯正的病毒；

（4）抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备。当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素（终浓度为100mg/L）和禽流行性感冒病毒（终浓度为800-1200血凝单位/ml）诱导培养，离心培养2-3天后，10000转/分、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析24-36h，超滤除菌，即获得体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子。

本发明一种抗禽流行性感冒病毒转移因子的制备方法，具有以下优点：

（1）本发明所需外周血等原料较少，用植物血凝素和禽流行性感冒病毒诱导培养诱导淋巴细胞单层即可体外生产出大量抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的混合体；

（2）本发明的方法制备的抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子无需进一步的提纯，直接将混合体用于禽类；

（3）本发明所得到的特异性转移因子即可起到抗禽流行性感冒病毒及抗菌的作用，同时又可以提高禽类的免疫力；

（4）本发明具有特异性强、成本低、产出率高、效果好等优点，是一种较为理想的禽流行性感冒病毒转移因子制备方法。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1

一种体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法：

（1）无菌环境下采取鸡脾脏，用外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血20ml，加0.8%肝素溶液0.2m1抗凝，静置40min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS (pH为7.2)液反复洗涤3次，离心速度1200转/分，然后用含30%犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；

（2）对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察（1）中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；

（3）病毒的提纯：将禽流行性感冒病毒接种于8日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养72h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，离心速度12000转/分，得到较为纯正的病毒；

（4）抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备。当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素（终浓度为100mg/L）和禽流行性感冒病毒（终浓度为1000血凝单位/ml）诱导培养，离心培养2天后，12000转/分、20min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析24h，超滤除菌，即获得体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子。

实施例2

一种体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备方法：

（1）无菌环境下采取鸡脾脏，用外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血30ml，加0.8%肝素溶液0.2m1抗凝，静置60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS (pH为7.2)液反复洗涤3次，离心速度1000转/分，然后用含30%犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层；

（2）对所制备的淋巴细胞单层进行传代培养。显微镜下观察（1）中所制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；

（3）病毒的提纯：将禽流行性感冒病毒接种于9日龄的鸡胚尿囊腔内，37℃培养96h增值病毒，将收集的尿囊液反复冻融三次后，超声破碎处理，离心，取沉淀，根据病毒粒子的大小利用密度梯度高速离心，离心速度10000转/分，得到较为纯正的病毒；

（4）抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的制备。当传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素（终浓度为100mg/L）和禽流行性感冒病毒（终浓度为1000血凝单位/ml）诱导培养，离心培养2天后，10000转/分、30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析36h，超滤除菌，即获得体外制备抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子。

实施例3:

对本发明所述工艺制备的抗禽流行性感冒病毒特异性转移因子的检测对实施例1所述工艺制备的抗禽流行性感冒病毒转移因子(下称“本品”）进行以下检测：

（1）标准液为黄色澄明液体，pH值在5.7-7.2之间；

（2）紫外线分光光度测定：本品在280. 0 - 290. 0nm处有一高吸收峰，且ABS260/ABS280>2.2；

（3）多肽含量测定：本品经双缩脉法测定多肽含量为1.012mg/ml；

（4）核酸含量测定：本品经地衣酚法测定核酸含量为0.472 mg/ml。

临床应用

试验1

2019年10月，在蓟县选取5000只感染禽流行性感冒的养鸡场，用本发明进行治疗，一周后，治愈率可达到88.8%，有效率达到100.0%。