一种磷酸化激活的细胞外调节蛋白激酶抑制剂的应用

摘要

本发明公开了一种磷酸化激活的细胞外调节蛋白激酶抑制剂的应用，该抑制剂为U0126。本发明用一种抑制剂阻断ERK信号通路，具体涉及p‑ERK受体抑制剂即U0126，通过结扎小鼠后腿浅层血管来建立外周血管痛模型，用免疫荧光法评估了假手术对照组和外周血管痛模型组小鼠同侧L4‑5DRG中p‑ERK的表达，进一步用免疫荧光法评估ETAR与p‑ERK在小鼠L4‑5DRG中的共表达，然后采用药理学方法来评估p‑ERK受体抑制剂即U0126在外周血管痛中的作用。U0126是一种特异性的p‑ERK阻断剂，研究发现，在外周血管痛模型中的不同时期，通过中枢局部(鞘内)给予U0126，都能治疗外周血管痛。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种磷酸化激活的细胞外调节蛋白激酶抑制剂的应用。

背景技术

细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于促分裂原活化的蛋白激酶家族。哺乳动物神经系统内ERK参与外周和中枢痛觉信号的调节，在细胞内信号调节和细胞间信息交流过程中扮演重要角色。背根神经节和脊髓背角内ERK能被伤害性刺激信号异常激活为p-ERK，然后通过转录或非转录途径促进多种类型疼痛的形成和维持，ERK抑制剂能显著缓解疼痛，但在外周血管痛动物模型的研究还鲜有报道。

外周血管疾病，即除了心脏及脑血管疾病以外所有血管疾病，常见的有下肢静脉曲张、下肢深静脉血栓、下肢动脉硬化闭塞症、下肢动脉血栓形成，以及急性下肢动脉栓塞、下肢血栓闭塞性脉管炎，以及下肢深静脉功能不全、瓣膜分流等，都属于下肢的血管疾病；而外周血管疾病还包括颈动脉狭窄、颈动脉瘤，以及颈动脉夹层、主动脉夹层、胸主动脉瘤、腹主动脉瘤、髂动脉瘤，还包括脏器动脉瘤，如脾动脉瘤、肠系膜动脉瘤、肠系膜动脉狭窄、肠系膜动脉血栓、肠系膜静脉血栓，都是周围血管常见的疾病，他们的共同临床症状、也是他们共同临床主诉，就是疼痛，在这里我们定义为外周血管痛。目前，对于外周血管痛，缺乏相关的实验动物模型，所以在疼痛机制研究方面以及疼痛药物研发上，少有研究报道。

其他疼痛模型如神经病理性疼痛模型、炎性痛疼痛模型、癌症痛模型、糖尿病所致疼痛模型等，均与外周血管痛无关。而偏头痛和心绞痛模型，为血管痛模型，但非外周血管痛模型。

ERK在炎性痛和神经病理性疼痛中发挥一定的作用，其ERK受体抑制剂在动物模型水平也有一定的治疗炎性痛和神经病理性疼痛的作用，但在外周血管痛模型上目前研究较少，更无有效的治疗药物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种磷酸化激活的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)抑制剂的应用，以解决现有技术中无外周血管痛治疗药物的问题，本发明研究发现p-ERK抑制剂即U0126可以在外周血管痛的不同阶段都有缓解血管痛的作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种磷酸化激活的细胞外调节蛋白激酶抑制剂在制备治疗外周血管痛的药物中的应用，所述抑制剂为U0126。

优选地，所述抑制剂还包括U0126在药学上可接受的盐。

优选地，所述外周血管痛为下肢静脉曲张、下肢深静脉血栓、下肢动脉硬化闭塞症、下肢动脉血栓形成、急性下肢动脉栓塞、下肢血栓闭塞性脉管炎、下肢深静脉功能不全、瓣膜分流、颈动脉狭窄、颈动脉瘤、颈动脉夹层、主动脉夹层、胸主动脉瘤、腹主动脉瘤、髂动脉瘤、脾动脉瘤、肠系膜动脉瘤、肠系膜动脉狭窄、肠系膜动脉血栓或肠系膜静脉血栓。

一种治疗外周血管痛的药物组合物，包括U0126或其在药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

一种磷酸化激活的细胞外调节蛋白激酶抑制剂在制备用于阻断ERK信号通路的药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明用一种抑制剂阻断ERK信号通路，具体涉及p-ERK受体抑制剂即U0126，通过结扎小鼠后腿浅层血管来建立外周血管痛模型，用免疫荧光法评估了假手术对照组和外周血管痛模型组小鼠同侧L4-5 DRG中p-ERK的表达，进一步用免疫荧光法评估ETAR与p-ERK在小鼠L4-5 DRG中的共表达，然后采用药理学方法来评估p-ERK受体抑制剂即U0126在外周血管痛中的作用。U0126是一种特异性的p-ERK阻断剂，研究发现，在外周血管痛模型中的不同时期，通过中枢局部(鞘内)给予U0126，都能治疗外周血管痛。

附图说明

图1A为小鼠L4-5 DRG组织中神经元上的p-ERK免疫荧光图；

图1B为p-ERK表达的定量；

图1C为外周血管痛模型组小鼠早期的机械痛结果图；

图2A为TRPA1与ETAR在小鼠L4-5 DRG组织中神经元上共表达的免疫荧光图；

图2B为ETAR与p-ERK在小鼠L4-5 DRG组织中神经元上共表达的免疫荧光图；

图2C为ETAR与CGRP在小鼠L4-5 DRG组织中神经元上共表达的免疫荧光图；

图3A为外周血管痛模型组小鼠早期鞘内注射抑制剂U0126测量机械痛的结果图；

图3B为外周血管痛模型组小鼠中期鞘内注射抑制剂U0126测量机械痛的结果图。

具体实施方式

以下是本发明的动物试验例，对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐述。但是，本发明的保护范围并不受限于以下实施例，凡是基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以下实施例中的成年雄性野生型(WT)C57BL/6J小鼠由汕头大学动物实验中心和南通大学动物实验中心提供。

实施例1

一种磷酸化激活的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)受体抑制剂即U0126应用于治疗外周血管痛，包括以下步骤：

(1)动物分组：选取20只的成年雄性野生型(WT)C57BL/6J小鼠，小鼠(2～5只/笼)在标准条件下饲养(21～24℃，60％湿度，光照/黑暗周期12h:12h)，并提供自由饮水和进食。随机选取5只小鼠作为假手术对照组(Sham)，其余15只分配为外周血管痛模型组(CVP)。

(2)外周血管痛模型制备：用1％戊巴比妥钠(100mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，剃除左后肢大腿内侧的毛发，将小鼠置于仰卧位，此时通过皮肤能够清楚地看到大隐静脉和隐动脉；常规消毒后，用眼科剪刀沿血管内侧约0.5cm和胫骨的一半做一个约0.5cm的纵向切口；在手术显微镜下可看到大隐静脉(内侧)和其伴随的隐动脉及隐神经(外侧)，用眼科剪的尖端把动静脉和神经之间的黏膜小心地分离开，然后用6-0缝合线把动脉和静脉完全结扎，对于假手术对照组的处理是类似操作但不结扎；缝合皮肤；术后把动物放在电热毯上恢复，随后把他们放回笼子里如常饲养。

(3)实施Von Frey实验来测试机械痛：对步骤(2)中的假手术对照组和外周血管痛模型组小鼠实施Von Frey实验。机械痛的测量是通过小鼠对Von Frey纤毛刺激的缩足阈值来确定的，即把小鼠放在高架金属网上的箱子里，允许他们在里面适应30min。然后，用一系列硬度呈对数增长的Von Frey纤毛(0.16、0.40、0.60、1.00和2.00g)来刺激它们的后足。纤毛垂直于小鼠后足的跖面，使用Dixon’s up-down法确定50％的缩足阈值。通过测量使用0.16、0.40或0.60g Von Frey纤毛的亚阈值重复刺激(10～20次，每次刺激之间间隔＞5s)时的缩足频率来评估机械痛敏。

(4)免疫荧光法测量腰(L)4-5背根神经节(DRG)中p-ERK的表达以及ETAR与p-ERK的共表达：深度麻醉小鼠(2％戊巴比妥钠，80mg/kg)后用含4％多聚甲醛和0.02％苦味酸的PBS灌注。分离出L4-5 DRG和脊髓(SC)，在4％多聚甲醛中，DRG固定1.5h，脊髓固定过夜。随后用30％蔗糖溶液对组织进行脱水过夜。使用Leica CM1950切片机制备DRG切片(7μm)。对于ETAR、p-ERK的染色，在柠檬酸缓冲液中进行抗原修复，然后将切片在室温下封闭。用鼠抗ETAR单克隆抗体(1:800)结合兔抗p-ERK抗体(1:1000)孵育切片。接下来，用二抗孵育切片。用LSM 800激光扫描共聚焦成像系统对荧光图像进行拼图拍照，并使用Image-Pro Plus8.0软件分析荧光信号。

(5)免疫荧光半定量分析：为了对免疫染色结果进行量化，每只动物至少选择3个切片(每4个切片取1张)，每组至少5只动物进行双盲分析。为了确定DRG中标记的神经元(标记为ETAR、p-ERK)的百分比，将阳性神经元的数量(背景信号的3倍)除以神经元的总数。

(6)中枢局部给药(鞘内注射)：在外周血管痛模型组小鼠早期(5周)、中期(9周)和晚期(13周)鞘内给药U0126。在进行鞘内注射三天前，用异氟烷(2％)将动物麻醉后，将每只动物的背面的毛发剃光，以暴露出注射部位。蛛网膜下腔穿刺的部位是通过触诊髂骨粗隆、最后一个腰椎的棘突和腰骶部下面的区域来确定的。通过食指沿中线向喙部方向滑动来确定腰椎(L)5-6椎间隙。动物被麻醉后，将无菌的30-G针头推进到椎间隙的中线，针头的斜面朝向喙侧。当针尖插入椎间隙的深度为2～3mm时，通过小鼠轻弹尾巴来验证针尖在蛛网膜下的准确位置。然后，将药物(5μL)注入马尾区的蛛网膜下腔。针头在原地停留5s后再拔出，以避免注射的药物反流。

实施例2

通过实施例1所述各步骤，分析p-ERK受体抑制剂即U0126治疗外周血管痛的作用，分析结果如下：

(1)用免疫荧光法评估了假手术对照组和外周血管痛模型组小鼠同侧L4-5DRG中p-ERK的表达。与假手术对照组相比，外周血管痛模型组小鼠DRG中p-ERK表达有所增加，如图1A和图1B所示，外周血管痛小鼠L4-5 DRG中磷酸化ERK(p-ERK)的表达增高。

(2)进一步用免疫荧光法评估ETAR与p-ERK在小鼠L4-5 DRG中的共表达，如图2A、图2B和图2C所示，发现在外周血管痛期间，这两对蛋白的共表达在4周(w)时有所增加。

(3)采用药理学方法来评估p-ERK受体抑制剂即U0126在外周血管痛中的作用。由于本发明专注于神经内ERK-CGRP通路，所以采用了鞘内给药途径。对p-ERK的抑制剂U0126进行一次、两次或三次鞘内注射，可适度缓解血管痛，在晚期有明显的抑制作用，如图1C所示，局部抑制p-ERK信号可缓解外周血管痛小鼠早期的机械痛敏；如图3A和图3B所示，U0126对ERK信号的局部阻断抑制了外周血管痛小鼠在早期(图3A)和中期(图3B)的机械痛。