β-谷甾醇在治疗缺血性脑卒中的应用

摘要

本发明涉及β‑谷甾醇在治疗缺血性脑卒中的应用，本发明利用小鼠原代神经元缺氧/再氧模型及小鼠大脑中动脉闭塞模型，发现β‑谷甾醇可以抑制神经细胞内的胆固醇蓄积，有效调节细胞膜上胆固醇转运蛋白NPC1L1的胆固醇转运功能，并且腹腔注射后可以显著改善大脑中动脉闭塞模型动物的大脑梗死程度及神经功能损伤。本发明为治疗缺血性脑卒中提供了新的药效物质，这为β‑谷甾醇在医药上单独应用或联合应用提供可靠的依据。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及β-谷甾醇在治疗缺血性脑卒中的应用。

背景技术

缺血性脑卒中是一种急性脑血管疾病，具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，给患者的家庭经济和社会医疗带来了巨大的负担。目前采用阿替普酶、尿激酶等溶栓药物进行血管再通被认为是治疗缺血性脑卒中的标准策略，但由于治疗时间窗短和易出血的风险，大大限制了其临床应用。因此，深入探索新的潜在治疗靶点已成为该领域的重点研究方向。

缺血性脑卒中是一个复杂的病理生理过程，其发生机制十分复杂，包括能量衰竭，兴奋性中毒，神经炎症，细胞凋亡及氧化应激等。这些环节互为因果，相互影响，形成恶性循环，最终导致神经元细胞不可逆性坏死。其中神经元细胞凋亡被认为是导致脑损伤的中心环节和关键因素。

细胞内胆固醇及胆固醇代谢物稳态紊乱是神经细胞凋亡的一个重大诱因。其中NPC1L1基因是近年来新发现的与胆固醇吸收密切相关的位点，是维持生物体胆固醇动态平衡的重要因素，同时也是新型降脂药物依折麦布的作用靶点。

β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，属于四环三萜类化合物，广泛存在于各种植物油、植物种子、果蔬中。β-谷甾醇在抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、中枢神经系统等方面表现出良好的药理作用。目前仍未见β-谷甾醇在治疗缺血性脑卒中方面的相关报道。因此，将β-谷甾醇引入到治疗缺血性脑卒中药物中(单独或多药联合治疗)，具有重大现实意义。

发明内容

本发明提供一种β-谷甾醇在治疗和/或预防缺血性脑卒中的应用。尤其是在制备治疗和/或预防缺血性脑卒的药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供一种β-谷甾醇在抑制神经细胞内胆固醇过度积累中的应用。其是通过与NPC1L1蛋白有效结合来抑制神经细胞内胆固醇过度积累。

本发明的另一实施方案提供一种β-谷甾醇在抑制缺血性脑卒中神经细胞的内质网应激导致的细胞凋亡中的应用。

本发明的另一实施方案提供β-谷甾醇在治疗和/或预防缺血性脑卒中大脑梗死中的应用。

本发明的另一实施方案提供β-谷甾醇在治疗和/或预防缺血性脑卒中神经功能损伤中的应用。

本发明提供一种用于治疗和/或预防缺血性脑卒中的药物，其特征在于以β-谷甾醇作为有效成分。任选与其他治疗和/或预防缺血性脑卒中的药物联合使用。所述其他治疗和/或预防缺血性脑卒中的药物优选中药、植物药提取物、有效部位或有效成分、NPC1L1的小分子化合物、核酸类如RNAi、多肽类或蛋白质类药物。

β-谷甾醇的给药方式包括腹腔注射、皮下注射和/或口服给药。给药剂量优选2-100mg/kg，优选10-50mg/kg。

本发明的优点在于：公开了β-谷甾醇在治疗缺血性脑卒中的应用，其目的在于将β-谷甾醇引入到缺血性脑卒中的治疗中，采用β-谷甾醇对OGD/R原代神经元细胞进行干预，发现β-谷甾醇可以显著抑制神经细胞内胆固醇蓄积，并且动物模型小鼠腹腔注射后可以显著抑制缺血性脑卒中模型动物神经元凋亡，改善模型动物的神经行为等。本发明为治疗缺血性脑卒中提供了新的药效物质，这为β-谷甾醇在医药上的新应用提供可靠的依据。

附图说明

图1是β-谷甾醇通过直接作用于NPC1L1靶点产生抑制神经元细胞内胆固醇蓄积的作用图；图A：不同处理组原代神经元细胞内胆固醇染色的情况；图B：试验小鼠皮层脑组织中的NPC1L1表达水平；图C：β-谷甾醇与NPC1L1分子对接图。

图2是β-谷甾醇抑制MCAO/R诱导的内质网应激/神经元凋亡基因的蛋白表达图。

图3是β-谷甾醇对动物模型小鼠脑梗死情况的改善及神经行为的改善图；图A：试验小鼠大脑切片的TTC染色图；图B：试验小鼠的神经功能评分图；图C：试验小鼠大脑的脑含水量情况图。

具体实施方式

以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1：β-谷甾醇对神经元细胞内胆固醇转运及转运受体NPC1L1的影响

1、实验方法

(1)神经元的原代培养：在超净台外将孕鼠(E14-15d)过量麻醉处死，置于解剖盘中，75％酒精喷洒消毒，迅速剖开腹部取出胎珠，置于盛有预冷(冰浴)D-Hank’s平衡液的玻璃皿中。无菌条件下分离单个胚胎，剥离脑壳迅速取出双侧大脑(冰上操作)。解剖显微镜下剥去血管膜，取大脑皮层组织，置于预冷的D-Hank’s液中，剪碎成1-2mm3小块，转移至0.25％胰蛋白酶溶液，37℃消化20min。用含20％胎牛血清的DMEM溶液(含0.5mM谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100U/mL 链霉素)漂洗组织3次，终止消化。用经火抛光打磨的玻璃移液管反复吹打成浑浊液(动作轻缓，避免产生气泡)，至无明显可见组织块，过200目筛网，制备单细胞悬液，细胞计数板及显微镜下计细胞个数。DMEM培养基将单细胞悬液稀释重悬到适宜密度，接种于预先包被多聚赖氨酸(PLL,25μg/mL)的细胞培养板内。将细胞培养板移入CO2培养箱培养，24h后全量换Neurobasal培养液(含2％B27，0.5mM谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，此后每隔2d半量换液一次，每次换液前在倒置显微镜下观察细胞生长情况。根据细胞生长情况，培养7-14d可用于实验。

(2)糖氧剥夺(OGD/R)细胞模型的建立：正常培养原代皮层神经元细胞7-14d(视细胞生长状况而定)。在超净工作台上，将正常皮层神经元细胞培养基吸除，PBS液反复洗涤3次，随后加入glucose-free DMEM培养基，以5％CO2、95％N2、37℃缺氧孵育2h，然后吸净无糖培养液，PBS液再洗涤3次，加入Neruobasal(含2％B27，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)培养基，并再置入培养箱再灌注(复氧、复糖)培养(复氧条件：37℃、饱和湿度、5％CO

(3)细胞内胆固醇染色实验：将原代神经元细胞铺板至96孔板中，密度为2-3×10

(4)MCAO/R动物模型的建立：实验用小鼠麻醉成功后以仰卧位固定于手术台，常规备皮、消毒，取颈部正中切口，钝性分离颈部腺体组织、筋膜，暴露并分离结扎颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。在颈外动脉残端用眼科剪剪开一“V”型小口(剪口之前用微动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉)。将预处理过(浸泡肝素)的长15mm的8-0尼龙线栓小心地从颈外动脉插入；去除颈内动脉的微动脉夹后，插入处理过的尼龙线栓直至刚好进入颅内的大脑前动脉(线栓插入颈内动脉10±0.5mm，以遇到轻微的阻力为准)，阻塞大脑中动脉的开口；缺血2h后拔除线栓，使头端退到颈外动脉，颈总动脉的血流既可以再灌注到大脑中动脉；手术过程中应用经颅多普勒超声检测大脑中动脉血流(探头固定于前囟后2mm，中线旁开2mm)，以血流下降至术前的70％-80％为MCAO模型制备成功的标志；结扎消毒后逐层缝合皮下组织和皮肤，等动物麻醉苏醒后放回笼中即可；假手术模型的制作步骤同前，但血管分离后不插入线栓，结扎消毒后缝合皮下组织及皮肤即可。

(5)Western blot检测总蛋白水平：处理好的组织加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和PMSF)于冰上用超声波细胞粉碎仪匀浆3次(25Hz，3s/次)。4℃，12000rpm离心20min，收集上清液置于冰上。取一定量上清用于BCA试剂盒定量，剩余上清加入1/4体积的5×loading buffer沸水煮10min，待上样。样本用12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离，80V，2h，根据具体情况设定跑胶时间；之后100V转膜100min，再用5％脱脂奶粉封闭2-4h，加入一抗，4℃孵育过夜。TBST(10mM Tris,150mM NaCl,and 0.1％Tween-20)漂洗3次后，加羊抗鼠/兔二抗，室温孵育2h。TBST漂洗3次后，化学发光。

2、实验结果

如图1所示，细胞内胆固醇染色试验结果发现，OGD/R模型的神经元细胞内的胆固醇明显增多；β-谷甾醇(10μM)能够明显抑制OGD/R模型造成细胞内胆固醇蓄积，同时β-谷甾醇对正常培养的原代神经元细胞内的胆固醇没有影响。进一步的Western blot实验结果显示β-谷甾醇能够有效扭转MCAO模型造成的小鼠皮层组织内的NPC1L1蛋白表达量异常升高。同样地，分子对接实验结果表明β-谷甾醇分子能与NPC1L1蛋白有效结合。这些结果表明缺血性脑卒中小鼠神经细胞内胆固醇蓄积，β-谷甾醇通过直接作用于胆固醇转运蛋白NPC1L1而抑制神经细胞内胆固醇过度积累。

实施例2：β-谷甾醇对神经元中凋亡基因的影响

1、实验方法：

(1)Western blot检测总蛋白水平：同上

2、实验结果

如图2所示，与正常组相比，MCAO模型小鼠皮层组织内的凋亡基因caspase3，caspase 9，Bax的蛋白表达量显著升高；同时检测到内质网应激标志蛋白GRP78/Bip及caspase12都明显高表达；并且β-谷甾醇处理组逆转了这一效应。这表明β-谷甾醇能够抑制缺血性脑卒中神经细胞的内质网应激导致的细胞凋亡。

实施例3：β-谷甾醇对动物模型小鼠神经功能行为及脑梗死情况的影响

1、实验方法：

(1)氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测定脑梗死面积：各组动物于再灌注24h后，10％水合氯醛腹腔注射，麻醉后断头取脑，采用-20℃冰箱中速冻15min，切取2mm厚度的冠状位切片5片。切片时要小心，因为脑组织容易黏在刀片上，为了防止损失，刀片先浸入2％TTC溶液中。切好的脑片迅速放入TTC溶液中进行染色，脑片压上盖玻片使脑组织平整，7℃恒温箱中避光孵育30min，4％多聚甲醛固定，持续观察颜色的改变。当脑片表面开始变成粉红色，反转脑片。染上色的表面具有活性脑组织；梗死的部分由于线粒体失活不能被染色，仍然为白色。当脑片表面颜色由浅红色变为深红色，结束反应，用PBS洗去TTC溶液。数码相机拍照后应用图像分析软件计算脑梗死体积百分比。脑梗死体积百分比(％)＝左侧脑梗死面积×切片厚度/右侧脑组织总体积×100％。

(2)脑含水量检测：各实验组小鼠给药造模结束后，小鼠进行过量麻醉，直接断头后取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，分离左右大脑半球，立即称湿重，然后放入110℃电烤箱中24h烤干至恒重，再迅速称脑组织干重。计算脑含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

2、实验结果：

如图3所示，MCAO模型明显造成实验小鼠脑部大面积梗死。而与模型组相比，β-谷甾醇处理组小鼠的脑梗死面积明显缩小；同时腹腔注射β-谷甾醇能够显著改善模型小鼠的神经功能损伤以及脑水肿情况。这些结果表明，β-谷甾醇可以显著改善缺血性脑卒中小鼠的大脑梗死程度及神经功能损伤。

综上所述，我们提出β-谷甾醇通过直接作用于胆固醇转运蛋白NPC1L1，减少了缺血性脑卒中神经细胞内胆固醇的量，抑制了胆固醇蓄积造成的神经细胞凋亡，进而减少了缺血性脑卒中后的脑梗死、脑水肿，从而起到神经保护作用。通过合理开发β-谷甾醇，制成适当剂型，可望在临床治疗缺血性脑卒中提供新的药物。