一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法

摘要

本发明属于生物制药技术领域，具体地说，涉及一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法。该纯化方法包括一次柱层析、脱盐浓缩和二次柱层析，其中，一次柱层析和二次柱层析过程中均采用载体至少为两种交联葡聚糖凝胶的羧甲基阳离子交换树脂层析柱。本发明柱层析过程中，载体采用不同大小、不同筛分范围的交联葡聚糖凝胶进行混合，能够更好地去除HCG产品中的杂质，产品的存放稳定性提高，随着存放时间的延长，不会出现产品质量下降的问题，能在‑30℃下保存6个月，有效地避免了因单一型号葡聚糖凝胶的特异性不好、不能很好地去除HCG中的杂质而引起的产品储存稳定性不好、产品质量下降的问题。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体地说，涉及一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(HCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，由α和β两条多肽链及碳水化合物链构成。α链有92个氨基酸，β链有145个氨基酸。两条多肽链分别以共价键与碳水化合物链相结合。碳水化合物链约占HCG全分子量的30％，由甘露糖、半乳糖、岩藻糖和唾液酸等组成。HCG与来自脑垂体的一些糖蛋白激素如促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH)等结构相似，α链的氨基酸排列顺序基本相同，代表HCG特异性的仅是β链羧基末端的约30个氨基酸片段。在妊娠早期HCG的浓度迅速增高，检测尿中的HCG即可证实妊娠。有许多研究表明，在滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤病人的血和尿中有游离的HCG的β亚基存在。74种不同种类和起源的已建株的人肿瘤细胞系经流式细胞计数被证明发现有HCG或其片段。

HCG性状呈白色或类白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂，pH3.2-3.3，干品较稳定。临床上主要用于男性垂体机能不足所致的性机能过低的隐睾症，用于由黄体功能不全引起的功能性子宫出血病和习惯性流产，与HMG协同可诱发排卵和治疗不育症。HCG的另一种重要用途是制备妊娠试剂和放射免疫试剂，用以妊娠检验和绒毛膜癌的诊断。由于HCG在医学上有重要的用途，在医药市场上HCG的需要量还是很大的。

目前，HCG的制备多以孕妇尿液作为原料，通过苯甲酸钠吸附、酒精抽提等过程得到大于120IU/mg的HCG粗品。而国内多采用一步阳离子交换树脂进行纯化得到单位效价大于2500IU/mg的精品，这些方法收率一般都小于80％，同时精品的效价在3000IU/mg左右。

CN1302818A公开了一种人绒毛膜促性腺激素及其制备方法，该方法是从妊娠女性尿液中提取出的一种人绒毛膜促性腺激素的分离纯化技术。孕妇尿液中存在含有人绒毛膜促性腺激素(HCG)，通过苯甲酸钠或者高岭土，乙醇吸附制得HCG粗制品。本发明制备方法的特征是通过用醋酸钠的高盐抽提和低盐反抽技术得到HCG中间体，经过SP-葡聚糖凝胶的分离纯化技术制得一种高纯度的人绒毛膜促性腺激素，经过无菌无热原的处理制得医用的注射用HCG精品原料，本发明工艺技术的简化，产品收率从传统工艺的35-50％提高到80-90％，生产成本可降低50％。

CN102485752A公开了一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：(1)将人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于pH值为4-5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液后，加到载体为琼脂糖、葡聚糖凝胶或羟磷酸钙的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为4-5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2-0.5mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集270-290nm，优选为280nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液；(2)将洗脱液脱盐浓缩；(3)再加到羧甲基阳离子交换层析柱，以pH值为5.5-6.5的0.05-0.1mol/L醋酸钠缓冲液洗脱，收集270-290nm，优选为280nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液。该纯化方法制得人绒毛膜促性腺激素效价不低于7000iu/mg的HCG产品，总收率超过90％。

然而，上述方法虽然在一定程度上提高了产品的收率和纯度，但是随着存放时间的延长，会出现产品质量下降的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法。采用本发明方法制得的HCG产品存放稳定性好，随着存放时间的延长，不会出现产品质量下降的情况，能在-30℃下保存6个月，更有利于该药物的临床应用、运输和保存，有效地避免了因单一型号葡聚糖凝胶的特异性不好、不能很好地去除HCG中的杂质而引起的产品储存稳定性不好、出现产品质量下降的问题。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种人绒毛膜促性腺激素纯化方法，包括一次柱层析、脱盐浓缩和二次柱层析，其中，一次柱层析和二次柱层析过程中均采用载体至少为两种交联葡聚糖凝胶的羧甲基阳离子交换树脂层析柱。

目前，HCG的纯化方法虽然在一定程度上提高了产品的收率和纯度，但是随着存放时间的延长，会出现产品质量下降的问题。本发明人经大量的研究发现，现有方法中所采用的层析柱的载体通常为单一型号，如CN1302818A中使用的是SP葡聚糖凝胶c-50，由于使用单一型号的葡聚糖凝胶，特异性不好，并不能很好地去除HCG中的杂质，而这些杂质的存在将影响产品的存放稳定性，随着存放时间的延长，会出现产品质量下降的情况。

本发明柱层析过程中，载体采用不同大小、不同筛分范围的交联葡聚糖凝胶进行混合，能够更好地去除HCG产品中的杂质，产品的存放稳定性提高，随着存放时间的延长，不会出现产品质量下降的问题，能在-30℃下保存6个月，更有利于该药物的临床应用、运输和保存，有效地避免了因单一型号葡聚糖凝胶的特异性不好、不能很好地去除HCG中的杂质而引起的产品储存稳定性不好、产品质量下降的问题

进一步地，所述的交联葡聚糖凝胶为交联葡聚糖凝胶G-50、交联葡聚糖凝胶G-75或交联葡聚糖凝胶G-100中的至少两种。

进一步地，所述的交联葡聚糖凝胶至少含有交联葡聚糖凝胶G-50。

进一步地，所述的交联葡聚糖凝胶为交联葡聚糖凝胶G-50、交联葡聚糖凝胶G-75和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比2：1：1进行混合得到的葡聚糖凝胶混合物。

所述的交联葡聚糖凝胶为：

交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-75按照质量比2：1进行混合得到的葡聚糖凝胶混合物；

或者交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比1：1进行混合得到的葡聚糖凝胶混合物。

进一步地，一次柱层析和二次柱层析过程中所采用的载体相同。

进一步地，一次柱层析为：将人绒毛膜促性腺激素粗品溶解于pH值为4-5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液后，加到载体至少为两种葡聚糖凝胶的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为4-5的包含0.05mol/L醋酸钠和0.2-0.5mol/L氯化钠的缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集270-290nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液。

进一步地，二次柱层析为：脱盐浓缩的洗脱液再加到载体至少为两种葡聚糖凝胶的羧甲基阳离子交换层析柱上，以pH值为5.5-6.5的0.05-0.1mol/L醋酸钠缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集270-290nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液。

进一步地，脱盐浓缩为利用超滤膜进行。

本发明中，脱盐浓缩用截留分子量为1万的超滤膜对收集的洗脱液进行脱盐浓缩，至其电导值降至与pH值为4.5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液的电导值基本一致为止。

进一步地，所述纯化方法还包括：向二次柱层析获得的洗脱液中加入乙醇进行沉淀，将沉淀进行脱水、真空干燥和除热原。

本发明中，除热原采用磷酸钙除热原。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明柱层析过程中，载体采用不同大小、不同筛分范围的交联葡聚糖凝胶进行混合，能够更好地去除HCG产品中的杂质，产品的存放稳定性提高，随着存放时间的延长，不会出现产品质量下降的问题，能在-30℃下保存6个月，更有利于该药物的临床应用、运输和保存，有效地避免了因单一型号葡聚糖凝胶的特异性不好、不能很好地去除HCG中的杂质而引起的产品储存稳定性不好、产品质量下降的问题。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。

实施例1

1、一次柱层析

1.1、在0-15℃下，将HCG粗品(500g)溶解于pH值为4.5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液(40L)中，得到溶解好的上样液；

1.2、选用交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-75按照质量比2：1进行混合得到葡聚糖凝胶混合物，将该葡聚糖凝胶混合物作为固定相载体装填到羧甲基阳离子交换层析柱上，得到装填好的层析柱；

1.3、将溶解好的上样液按照2个柱体积/小时上样至装填好的层析柱上，上样结束后以pH值为4.5、包含0.05mol/L醋酸钠和0.3mol/L氯化钠的缓冲液作为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为3个柱体积/小时，收集280nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液；

2、脱盐浓缩

用截留分子量为1万的超滤膜对收集的洗脱液进行脱盐浓缩，至其电导值降至与pH值为4.5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液的电导值基本一致为止；

3、二次柱层析

3.1、选用交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-75按照质量比2：1进行混合得到葡聚糖凝胶混合物，将该葡聚糖凝胶混合物作为固定相载体装填到羧甲基阳离子交换层析柱上，得到装填好的层析柱；

3.2、将步骤2中经脱盐浓缩的洗脱液上样至装填好的层析柱上，上样速度3个柱体积/小时，上样结束后以pH值为6.0的0.08mol/L醋酸钠缓冲液作为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为3个柱体积/小时，收集280nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液。

4、沉淀、脱水、真空干燥

向步骤3收集的洗脱液中加入5倍量的-10℃的药用酒精进行沉淀，过夜后用离心机(4000转/分钟)进行离心，再用无水乙醇进行脱水，真空干燥制得HCG中间体36g；

5、除热原

将得到的HCG中间体通过磷酸钙除热原处理，得到30gHCG产品。

实施例2

1、一次柱层析

1.1、在0-15℃下，将HCG粗品(500g)溶解于pH值为4的0.05mol/L醋酸钠缓冲液(40L)中，得到溶解好的上样液；

1.2、选用交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比1：1进行混合得到葡聚糖凝胶混合物，将该葡聚糖凝胶混合物作为固定相载体装填到羧甲基阳离子交换层析柱上，得到装填好的层析柱；

1.3、将溶解好的上样液按照1个柱体积/小时上样至装填好的层析柱上，上样结束后以pH值为4、包含0.05mol/L醋酸钠和0.2mol/L氯化钠的缓冲液作为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为2个柱体积/小时，收集270nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液；

2、脱盐浓缩

用截留分子量为1万的超滤膜对收集的洗脱液进行脱盐浓缩，至其电导值降至与pH值为4的0.05mol/L醋酸钠缓冲液的电导值基本一致为止；

3、二次柱层析

3.1、选用交联葡聚糖凝胶G-50和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比1：1进行混合得到葡聚糖凝胶混合物，将该葡聚糖凝胶混合物作为固定相载体装填到羧甲基阳离子交换层析柱上，得到装填好的层析柱；

3.2、将步骤2中经脱盐浓缩的洗脱液上样至装填好的层析柱上，上样速度2个柱体积/小时，上样结束后以pH值为5.5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液作为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为2个柱体积/小时，收集270nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液。

4、沉淀、脱水、真空干燥

向步骤3收集的洗脱液中加入5倍量的-10℃的药用酒精进行沉淀，过夜后用离心机(4000转/分钟)进行离心，再用无水乙醇进行脱水，真空干燥制得HCG中间体34g；

5、除热原

将得到的HCG中间体通过磷酸钙除热原处理，得到28gHCG产品。

实施例3

1、一次柱层析

1.1、在0-15℃下，将HCG粗品(500g)溶解于pH值为5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液(40L)中，得到溶解好的上样液；

1.2、选用交联葡聚糖凝胶G-50、交联葡聚糖凝胶G-75和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比2：1：1进行混合得到葡聚糖凝胶混合物，将该葡聚糖凝胶混合物作为固定相载体装填到羧甲基阳离子交换层析柱上，得到装填好的层析柱；

1.3、将溶解好的上样液按照2个柱体积/小时上样至装填好的层析柱上，上样结束后以pH值为5、包含0.05mol/L醋酸钠和0.5mol/L氯化钠的缓冲液作为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为3个柱体积/小时，收集290nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液；

2、脱盐浓缩

用截留分子量为1万的超滤膜对收集的洗脱液进行脱盐浓缩，至其电导值降至与pH值为4-5的0.05mol/L醋酸钠缓冲液的电导值基本一致为止；

3、二次柱层析

3.1、选用交联葡聚糖凝胶G-50、交联葡聚糖凝胶G-75和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比2：1：1进行混合得到葡聚糖凝胶混合物，将该葡聚糖凝胶混合物作为固定相载体装填到羧甲基阳离子交换层析柱上，得到装填好的层析柱；

3.2、将步骤2中经脱盐浓缩的洗脱液上样至装填好的层析柱上，上样速度3个柱体积/小时，上样结束后以pH值为6.5的0.1mol/L醋酸钠缓冲液作为洗脱液进行洗脱，洗脱速度为3个柱体积/小时，收集290nm下光密度为0.6-0.7的洗脱液。

4、沉淀、脱水、真空干燥

向步骤3收集的洗脱液中加入5倍量的-10℃的药用酒精进行沉淀，过夜后用离心机(4000转/分钟)进行离心，再用无水乙醇进行脱水，真空干燥制得HCG中间体33g；

5、除热原

将得到的HCG中间体通过磷酸钙除热原处理，得到28gHCG产品。

对比例1

参照实施例1，与实施例1所不同的是一次柱层析和二次柱层析过程中固定相载体为交联葡聚糖凝胶G-50。

对比例2

参照实施例1，与实施例1所不同的是一次柱层析和二次柱层析过程中固定相载体为交联葡聚糖凝胶G-75。

对比例3

参照实施例1，与实施例1所不同的是一次柱层析和二次柱层析过程中固定相载体为交联葡聚糖凝胶G-100。

对比例4

参照实施例1，与实施例1所不同的是一次柱层析和二次柱层析过程中固定相载体为交联葡聚糖凝胶G-75和交联葡聚糖凝胶G-100按照质量比1：1进行混合得到的葡聚糖凝胶混合物。

试验例1

该试验例对本发明各实施例和对比例制得的人绒毛膜促性腺激素的生物效价进行了检测。

生物效价检测方法参照中国专利ZL201010566930.5中所述的方法。

试验结果见表1所示：

表1、生物效价检测结果

从表1的结果可以看出，通过本发明的纯化方法制备的最终产品生物效价达到12000iu/mg以上，均优于对比例制备的产品。

试验例2

该试验例对实施例1和对比例4制得的人绒毛膜促性腺激素的稳定性进行了考察。

从上述试验例1的结果可以看出，对比例4制备的产品的生物效价要高于其他对比例制备的产品，因此，本试验例以对比例4为例，将其与实施例1进行了对比。

试验方法：将实施例1和对比例4制得的人绒毛膜促性腺激素稀释制备低值和高值2种浓度，分装到1ml的分装管中，每支0.5mL，在-30℃下保存6个月，分别于第1、第3和第6月时采用Roche Cobas e601仪器及其配套试剂测定HCG含量，各测定10次，计算均值

试验结果见表2和表3所示：

表2、低值(mIU/mL)稳定性试验结果

表3、高值(mIU/mL)稳定性试验结果

从表2和表3的结果可以看出，与对比例4制得的HCG相比，本发明方法制得的HCG产品具有更好的稳定性，能在-30℃条件下保存6个月，而对比例4制得的HCG仅能在-30℃下存放3个月。