抗A型肉毒毒素的抗体及其应用

摘要

本发明涉及抗A型肉毒毒素的抗体或其抗原结合片段，及其应用。

说明书

技术领域

本发明生物制药技术领域，具体地，本发明涉及抗A型肉毒毒素的抗体或其抗原结合片段，及其应用。

背景技术

肉毒杆菌神经毒素（Botulinum toxin，BoNT）是已知的最强的毒素之一，由严格厌氧的革兰氏阳性肉毒杆菌（Clostridium botulinum）产生，包括A、B、C、D、E、F和G，7个血清型。其中A、B、E型是引起人类肉毒中毒的主要类型。

各血清型BoNT结构都是由一条重链和一条轻链通过二硫键连接。轻链（L链）N端结构域是毒性结构域；重链（H链）由2个结构域组成。H链的N端H

由于BoNT具有毒性大，性质稳定，制备、运输及释放相对其他毒素更为容易的特点，并且能够以气溶胶的形式散布，污染食物和水源。因此，美国疾病控制中心将其列为A类生物威胁。鉴于此，开发高度灵敏、简单和快速检测食品和患者样本中的BoNT的方法变得极为迫切。

发明内容

本发明的目的在于提供抗A型肉毒毒素的抗体或其抗原结合片段，及其应用，以检测A型肉毒毒素，为人类的健康和食品安全提供保障。

第一方面，本发明提供了抗A型肉毒毒素的抗体或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包括：分别如SEQ ID NO: 7、8和9所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者，分别如SEQ ID NO: 17、18和19所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

所述轻链可变区包括：分别如SEQ ID NO: 12、13和14所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者，分别如SEQ ID NO: 22、23和24所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

本文所提及的“其抗原结合片段”是指“抗A型肉毒毒素的抗体的结合片段”，该结合片段能够特异性的结合A型肉毒毒素，优选为其抗原结合区或可变区，包括Fab，Fab'，F(ab')

(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。

在一些实施方式中，所述重链可变区包括：

与如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或

与如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述重链可变区包括：如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述轻链可变区包括：

与如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；或

与如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述轻链可变区包括：如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：

分别如SEQ ID NO: 7、8和9所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和，分别如SEQ ID NO: 12、13和14所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者

分别如SEQ ID NO: 17、18和19所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和，分别如SEQ ID NO: 22、23和24所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包括：

与如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，优选为如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列；和，与如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，优选为如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列；或者

与如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，优选为如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列；和，与如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，优选为如SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供了分离的核酸分子。所述核酸分子编码本发明第一方面提供的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方式中，所述核酸分子编码以下氨基酸序列：

（a）如SEQ ID NO: 5、或7-9所示的氨基酸序列；

（b）如SEQ ID NO: 10、或12-14所示的氨基酸序列；

或

（c）如SEQ ID NO: 15、或17-19所示的氨基酸序列；

（d）如SEQ ID NO: 20、或22-24所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述核酸分子包括：

（a）如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；

（b）如SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列；

或

（c）如SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列；

（d）如SEQ ID NO: 21所示的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了表达载体。所述表达载体包括本发明第二方面提供的核酸分子。根据本发明公开的一些实施方式，表达载体可在宿主细胞中进行转录和翻译，以表达本发明的第一方面提供的抗体或其抗原结合片段。

第四方面，本发明提供了宿主细胞。所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的核酸分子，或本发明第三方面提供的表达载体。

第五方面，本发明提供了检测A型肉毒毒素的试剂。所述试剂包括本发明第一方面提供的抗体、本发明第二方面提供的核酸分子、或本发明第三方面提供的表达载体，以及药学上可接受的载剂。

第六方面，本发明提供了检测A型肉毒毒素的试剂盒。所述试剂盒包括：具有检测标记物的本发明第一方面提供的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包被在固相载体上。

在一些实施方式中，所述检测标记物选自荧光团、染料、放射性标记物、酶标签和胶体金，优选为胶体金。

在一些实施方式中，所述质控条带选自具有所述检测标记物胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体。

在一些实施方式中，所述质控条带为胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括套装所述固相载体的卡壳；

所述卡壳具有加样孔，和对应于所述检测条带和所述质控条带的视窗；

所述加样孔设置在靠近所述检测条带端。

在一些实施方式中，所述固相载体包括背板、位于所述背板上的结合垫、位于所述结合垫上的硝酸纤维素膜、以及位于所述硝酸纤维素膜上的吸水垫；

所述第一抗体包被在所述结合垫上；

所述第二抗体包被在所述硝酸纤维素膜上；

所述质控条带包被在所述硝酸纤维素膜上。

第七方面，本发明提供了本发明第一方面提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测A型肉毒毒素的试剂中的应用。

在一些实施方式中，检测的样品包括食物或水源。

本发明针对肉毒杆菌（Clostridium botulinum）的A型肉毒毒素（BoNT/AHc）蛋白，提供了抗AHc的单克隆抗体或其抗原结合片段，能够快速灵敏地检测食品、水源、环境等中是否含有肉毒杆菌，为人类的健康和食品安全提供保障。并且本发明提供了检测A型肉毒毒素的试纸。该试纸利用胶体金侧向免疫层析检测BoNT的方法，使用方便，快速灵敏地检测A型肉毒毒素，为人类的健康和食品安全提供保障。

附图说明

图1显示了纯化后的BoNT/AHc蛋白样品的SDS⁃PAGE检测结果。在图中，M代表蛋白Marker；1代表BoNT/AHc蛋白。

图2显示了胶体金免疫侧向层析检测卡的检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

除非另外定义，否则在此使用的所有术语（包括技术和科学术语）具有本领域技术人员通常所理解的含义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。

本文所使用的表述“约”是如本领域的普通技术人员所理解的，并且根据其使用的背景而在一定范围内变化。如果本领域的普通技术人员根据其使用的上下文对该术语的使用不了解，则“约”将意味着特定值至多加上或减去10％。

肉毒杆菌神经毒素（Botulinum toxin，BoNT）也被称为肉毒毒素或肉毒杆菌素，是由肉毒杆菌在繁殖过程中所产生的一种神经毒素蛋白。肉毒毒素是150kD的多肽，它由100kD的重(H)链和50kD轻(L)链通过一个双硫链连接起来。依其毒性和抗原性不同，分为A、B、C、D、E、F、G8个类型，其中C类型又分为Ca和Cb。

BoNT/AHc为botulinum neurotoxin sero type A heavy chain的缩写，译为肉毒杆菌神经毒素血清A型重链。

BoNT/AHc的氨基酸序列为MEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPLLE（SEQ ID NO: 25）。

本文所使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。

本文所使用的“表达载体”和“表达构建体”可互换使用，在将上述分离的核酸分子连接到载体上时，可以将核酸序列与载体上的调控元件直接或者间接相连，只要这些调控元件能够调控该核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些调控元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。也就是说，核酸分子与调控元件可操作地连接。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的调控元件，例如转录调控序列和翻译调控序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。

本文所用的术语“胶体金免疫层析试验”是指以微孔膜为固相载体，借助毛细管虹吸引力（层析作用）使液体样品在条状膜上泳动。

相比于一条序列，本文所使用的与该序列具有“至少90%序列同一性”可以包括与该序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。

本文所使用的“药学上可接受的载剂”可以包括生理学上相容的任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合中的一种或多种。有许多情况下，药学上可接受的载剂可以包括等渗剂，例如糖类、多元醇（如甘露醇、山梨醇）或氯化钠等。当然药学上可接受的载剂还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）。

复溶液的配方：15w/v%海藻糖溶液（溶剂为pH 7.4的PBS缓冲液）。

包被缓冲液的配方3w/v%苯丙氨酸、2w/v%牛血清白蛋白、3w/v%海藻糖溶液（溶剂为pH 7.4的PBS缓冲液）。

实施例

实施例1：BoNT/AHc蛋白的制备

1. BoNT/AHc蛋白的表达

将构建好的pTIG-Trx-AHc载体转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，挑取饱满的单克隆接种于含100μg/mL氨苄西林的2×YT培养基中，37℃、220 r/min摇床上培养至菌液的OD

2. BoNT/AHc蛋白的纯化

首先将HisTrap™ HP纯化柱安装于AKTA Pure蛋白纯化仪上，用蒸馏水冲洗管道，然后用结合缓冲液冲至平衡。

将制备的蛋白上清液装载到HisTrap™ HP纯化柱内，然后用洗脱缓冲液pH 7.5（含有20 mmol/L PB，0.5 mol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）进行线性洗脱。

按照每管2 mL收集纯化后的BoNT/AHc蛋白样品。并通过SDS⁃PAGE检测纯化结果。纯化结果如图1所示。由图1所示的电泳图谱可知，通过以上实验步骤得到了电泳纯的BoNT/AHc蛋白。将纯化后的BoNT/AHc蛋白样品进行浓缩，用BCA法测定BoNT/AHC蛋白样品中BoNT/AHC蛋白的浓度在1.5 mg/mL以上。

实施例2：BoNT/AHc单克隆抗体的制备

挑选5只约8~10周龄的Balb/c健康雌性小鼠。将实施例1得到的电泳纯的BoNT/AHc蛋白，经背部皮下免疫小鼠。初次免疫将100 μg BoNT/AHC蛋白作为BoNT/AHc抗原与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，后续免疫与等体积弗氏不完全佐剂乳化的BoNT/AHc抗原，免疫剂量同初次免疫，免疫间隔为2周；免疫3次后对小鼠进行眼眶采血，测定效价。

取抗体效价大于100000的小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞按照10:1比例混合，采用PEG介导的动物细胞融合技术进行细胞融合，再用含10%胎牛血清的HAT选择培养基培养1周，更换为10% HA培养液，2周后更换为10%胎牛血清的DMEM普通培养液。当细胞铺满96孔板底的孔底至少90%面积时，收集细胞培养上清。采用非竞争ELISA法筛选阳性细胞株，选出生长状态良好、效价高的杂交瘤细胞继续培养至细胞长满96孔板的孔底至少90%面积时，采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化，最终筛选出两株细胞株401和1103。细胞株401和1103抗体的效价详见表1。

表1 细胞株401和1103抗体的效价

实施例3：BoNT/AHc单克隆抗体可变区序列分析

1. 可变区序列扩增及测定

杂交瘤细胞株401和1103培养至最佳状态，收集约1×10

用表2所示的引物对，以反转录的cDNA为模板，PCR扩增单克隆抗体轻链、重链的可变区核苷酸序列。将扩增的核酸片段按照pMD™ 19-T Vector Cloning Kit（Takara6013）说明书连接到pMDTM19-T载体后，再转化至TOP10感受态细胞中。经PCR做菌液鉴定后，选取阳性菌落进行扩大培养（培养条件为1:1000接种于LB培养基后，加入氨苄青霉素，终浓度100ug/ml；37度培养过夜），之后按照质粒小提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）说明书提取连接有单克隆抗体可变区序列的pMD19-T质粒，进行测序。

表2可变区引物序列

2. BoNT/AHc单克隆抗体可变区序列比对分析

将杂交瘤细胞株401和1103的单克隆抗体可变区核酸序列的测序结果在GeneBank数据库中进行Blast比对分析，结果显示所扩增的序列与Balb/c小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列同源性最高，说明测序得到的基因序列为小鼠单克隆抗体序列。利用ABYSIS或IgBLAST软件分析序列的互补决定区（Complementarity determining region，CDR）划分，结果如下：

（1）BoNT/AHc单克隆抗体细胞株401可变区重链测序结果如下：

细胞株401可变区重链的氨基酸序列：LTMDFGLSLVFLVLTLKGVKCEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSTSDMSWVRQTPEKRLEWVTYITSGAGNTNYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYVQMSSLKSEDTAMYYCARQSRWSLALDYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPVCGG（SEQ ID NO: 5）。

细胞株401可变区重链的核苷酸序列（共471 bp）：CTCACCATGGACTTCGGGCTGAGCTTGGTTTTCCTTGTCCTTACTTTAAAAGGTGTGAAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTACCTCTGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCACATACATTACTAGTGGTGCTGGTAACACGAACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTATGTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCCAGACAGAGTCGGTGGTCACTGGCGTTAGATTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTAACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGGT（ SEQ ID NO:6）。

细胞株401可变区重链的互补决定区的氨基酸序列（依据Kabat编号系统）如表3所示：

表3细胞株401可变区重链的互补决定区的氨基酸序列

（2）BoNT/AHc单克隆抗体细胞株401可变区轻链测序结果如下：

细胞株401可变区轻链的氨基酸序列：LTMETDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRGSNSVSISAYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVWNQESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHITELTRSEGGPSWKSNGLMLHQLYPSPTIQ（SEQ ID NO: 10）。

细胞株401可变区轻链的核苷酸序列（共438 bp）：CTCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGGCAGCAATAGTGTCAGTATATCTGCCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATGGAACCAAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATAACGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTCCCACCATCCAG（SEQ ID NO: 11）。

细胞株401可变区轻链的互补决定区的氨基酸序列（依据IMGT编号系统）如表4所示：

表4细胞株401可变区轻链的互补决定区的氨基酸序列

（3）BoNT/AHc单克隆抗体细胞株1103可变区重链测序结果如下：

细胞株1103可变区重链的氨基酸序列：LTMNFGLSWVFLLTLLHGFQCEVKLVKSGGGSVQPGGSLRLSCTTSGFTFSDSYMQWVRQPLGKRLEWITAGRHKANEYTTEWSASTRGRFIVSRDTSQSILNLQMNALRTEDPAISYCARDDCPHFILPRSYYFFDIWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPVCGG（SEQ ID NO: 15）。

细胞株1103可变区重链的核苷酸序列（共498 bp）：CTCACCATGAACTTCGGGCTGAGCTGGGTTTTTCTTTTAACACTTTTACATGGTTTCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGAAATCTGGAGGAGGCTCGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTACAACTTCTGGATTCACCTTTAGTGATTCCTACATGCAGTGGGTCCGCCAGCCTCTAGGGAAGAGACTGGAGTGGATTACTGCAGGTCGACATAAAGCTAATGAATATACAACAGAGTGGAGTGCTTCAACGAGGGGTCGCTTCATCGTCTCCAGAGACACTTCCCAAAGCATCCTCAACCTTCAGATGAATGCCCTGAGAACTGAGGATCCTGCCATTTCTTACTGTGCACGAGATGACTGCCCTCACTTTATACTACCGAGGTCCTACTATTTCTTCGATATCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGTGTGTGGAGGT（SEQ ID NO: 16）。

细胞株1103可变区重链的互补决定区的氨基酸序列（依据Kabat编号系统）如表5所示：

表5 细胞株1103可变区重链的互补决定区的氨基酸序列

（4）BoNT/AHc单克隆抗体细胞株1103可变区轻链测序结果如下：

细胞株1103可变区轻链的氨基酸序列：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRPSKSVSTSRYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLESNLASGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQLITELTRSEGGPSWKYNGLMLHQLYP（SEQ ID NO: 20）。

细胞株1103可变区轻链的核苷酸序列（共357 bp）：GACATTGTGCTGACCCAATCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGCCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTCGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGAATCCAACCTAGCATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCTCATTACGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATACAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCA（SEQ ID NO: 21）。

细胞株1103可变区轻链的互补决定区的氨基酸序列（依据IMGT编号系统）如表6所示：

表6 细胞株1103可变区轻链的互补决定区的氨基酸序列

实施例4：BoNT/AHc胶体金侧向免疫层析检测试剂盒

将从杂交瘤细胞株401对应腹水中纯化出的抗体，与粒径40 nm的胶体金偶联，溶于复溶液中，使用金标三维划膜喷点仪喷于预处理好的结合垫上。

将杂交瘤细胞株1103对应腹水中纯化出的抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素（NC）膜的TEST线（T线）上。

将外购的羊抗鼠IgG抗体，用包被缓冲液溶解后，使用金标三维划膜喷点仪包被于预处理好的硝酸纤维素膜的CONTROL线（C线）上。

将喷金处理的结合垫、包被处理的NC膜、预处理的结合垫组装于背板上，制成半成品板。使用切条机将上一步制作的半成品板裁成宽度为4 mm的裸条，组装于配套的卡壳中，制备成可用于检测A型肉毒毒素的胶体金检测试剂。

分别配制0ng/mL、20ng/mL和200ng/mL的A型肉毒毒素样品液（溶剂为pH7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液），用移液器分别移取各浓度的A型肉毒毒素样品液80 μL，平行滴加于胶体金检测试剂的加样孔（0ng/mL的A型肉毒毒素样品液作为阴性对照），观察10 min时，T线和C线的显色情况，如果T线与C线均显红色，为阳性；C线为红色，T线不显色为阴性；C线不显色，检测试剂失效。如图2所示。由图2所示的检测结果可知，该A型肉毒毒素胶体金检测试剂检测限为20 ng/mL。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 北京弘进久安生物科技有限公司

<120> 抗A型肉毒毒素的抗体及其应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttagatctc cagcttggtc cc 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacattcagc tgacccagtc tcca 24

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcaccatgr acttcgggyt gagctkggtt tt 32

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ayctccacac acaggrrcca gtggatagac 30

<210> 5

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Thr Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Gly Val Lys Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Ala Phe Ser Thr Ser Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Trp Val Thr Tyr Ile Thr Ser Gly Ala Gly Asn Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Val Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ser Arg Trp Ser Leu Ala Leu Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr

130 135 140

Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly

145 150 155

<210> 6

<211> 471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcaccatgg acttcgggct gagcttggtt ttccttgtcc ttactttaaa aggtgtgaag 60

tgtgaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttagtga agcctggagg gtccctgaaa 120

ctctcctgtg cagcctctgg attcgctttc agtacctctg acatgtcttg ggttcgccag 180

actccggaga agaggctgga gtgggtcaca tacattacta gtggtgctgg taacacgaac 240

tatccagaca ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg 300

tatgtgcaaa tgagcagtct gaagtctgag gacacagcca tgtattactg tgccagacag 360

agtcggtggt cactggcgtt agattactgg ggccaaggga ctctggtaac tgtctctgca 420

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg tgtgtggagg t 471

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Thr Ser Asp Met Ser

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Ile Thr Ser Gly Ala Gly Asn Thr Asn Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Ser Arg Trp Ser Leu Ala Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Leu Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

20 25 30

Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Gly Ser

35 40 45

Asn Ser Val Ser Ile Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Trp Asn Gln

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln His Ile Thr Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser

115 120 125

Trp Lys Ser Asn Gly Leu Met Leu His Gln Leu Tyr Pro Ser Pro Thr

130 135 140

Ile Gln

145

<210> 11

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcaccatgg agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc 60

actggtgaca ttgtgctgac acagtctcct gcttccttag ctgtatctct ggggcagagg 120

gccaccatct catacagggg cagcaatagt gtcagtatat ctgcctatag ttatatgcac 180

tggaaccaac agaaaccagg acagccaccc agactcctca tctatcttgt atggaaccaa 240

gaatctgggg tccctgccag gttcagtggc agtgggtctg ggacagactt caccctcaac 300

atccatcctg tggaggagga ggatgctgca acctattact gtcagcacat aacggagctt 360

acacgttcgg aggggggacc aagctggaaa tcaaacgggc tgatgctgca ccaactgtat 420

ccatctccca ccatccag 438

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Gly Ser Asn Ser Val Ser Ile Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Leu Val Trp Asn Gln Glu Ser

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gln His Ile Thr Glu Leu

1 5

<210> 15

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Leu Thr Met Asn Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Leu Thr Leu Leu

1 5 10 15

His Gly Phe Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Asp Ser Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Pro Leu Gly Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Trp Ile Thr Ala Gly Arg His Lys Ala Asn Glu Tyr Thr

65 70 75 80

Thr Glu Trp Ser Ala Ser Thr Arg Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp

85 90 95

Thr Ser Gln Ser Ile Leu Asn Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Thr Glu

100 105 110

Asp Pro Ala Ile Ser Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Cys Pro His Phe Ile

115 120 125

Leu Pro Arg Ser Tyr Tyr Phe Phe Asp Ile Trp Gly Ala Gly Thr Thr

130 135 140

Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu

145 150 155 160

Ala Pro Val Cys Gly Gly

165

<210> 16

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcaccatga acttcgggct gagctgggtt tttcttttaa cacttttaca tggtttccag 60

tgtgaggtga agctggtgaa atctggagga ggctcggtac agcctggggg ttctctgaga 120

ctctcctgta caacttctgg attcaccttt agtgattcct acatgcagtg ggtccgccag 180

cctctaggga agagactgga gtggattact gcaggtcgac ataaagctaa tgaatataca 240

acagagtgga gtgcttcaac gaggggtcgc ttcatcgtct ccagagacac ttcccaaagc 300

atcctcaacc ttcagatgaa tgccctgaga actgaggatc ctgccatttc ttactgtgca 360

cgagatgact gccctcactt tatactaccg aggtcctact atttcttcga tatctggggc 420

gcagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg 480

gctcctgtgt gtggaggt 498

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ser Tyr Met Gln

1 5

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Ala Gly Arg His Lys Ala Asn Glu Tyr Thr Thr Glu Trp Ser Ala Ser

1 5 10 15

Thr Arg Gly

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Asp Asp Cys Pro His Phe Ile Leu Pro Arg Ser Tyr Tyr Phe Phe Asp

1 5 10 15

Ile

<210> 20

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Pro Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Arg Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Glu Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Ile Thr

85 90 95

Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Tyr Asn Gly Leu

100 105 110

Met Leu His Gln Leu Tyr Pro

115

<210> 21

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gacattgtgc tgacccaatc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcataca ggcccagcaa aagtgtcagt acatctcgct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgaatccaa cctagcatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc tcattacgga gcttacacgt 300

tcggaggggg gaccaagctg gaaatacaac gggctgatgc tgcaccaact gtatcca 357

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Arg Pro Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Arg Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Leu Glu Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Gln Leu Ile Thr Glu Leu Thr Arg

1 5

<210> 25

<211> 432

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Met Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg

1 5 10 15

Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile

20 25 30

Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile

35 40 45

Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn

50 55 60

Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp

65 70 75 80

Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr

85 90 95

Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu

100 105 110

Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys

115 120 125

Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr

130 135 140

Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn

145 150 155 160

Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser

165 170 175

Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp

180 185 190

Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu

195 200 205

Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn

210 215 220

Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln

225 230 235 240

Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr

245 250 255

Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly

260 265 270

Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu

275 280 285

Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys

290 295 300

Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val

305 310 315 320

Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val

325 330 335

Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

340 345 350

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn Lys

355 360 365

Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile

370 375 380

Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp

385 390 395 400

Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys Ser Trp

405 410 415

Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu Leu Glu

420 425 430