一种提高家畜超数排卵效率的方法

摘要

本发明提供了一种提高家畜繁殖效率的方法。具体来讲，本发明提供了前列腺素F2α或其同系物在提高家畜的超数排卵效率中的应用，以及提高家畜的超数排卵效率的方法。

说明书

技术领域

本发明属于畜牧业或兽医领域，具体的说是涉及列腺素F2α在提高绵羊繁殖效率中的应用及方法。

背景技术

如今，国外优良种畜的引进过程比较繁琐，检验检疫时间过长，不仅费时费力，而且加大了疾病传播的风险。利用胚胎移植技术通过引进优良种畜的胚胎代替种畜的引进，可以减少保存活畜的费用，同时减少疾病传播的可能性。胚胎移植技术不但能够充分发挥优良母畜在家畜品种改良和种群扩繁中的潜力，而且使得优质种畜基因可以稳定遗传下去，还能够有效的缩短繁殖时间。

在胚胎移植过程中采集胚胎的质量会影响胚胎移植的整体效果。因此在手术冲胚后对收集到的胚胎通常要进行统计和分析，使用较高质量的胚胎来提高胚胎移植效率。

发明内容

本发明发现前列腺素F2α及其同系物能够提高种畜的胚胎回收率、可用胚胎数以及囊胚数，提高了胚胎移植效率，从而提高了种畜的繁殖效率。

根据一个方面，提供了前列腺素F2α或其同系物在提高家畜的繁殖效率中的应用。

根据一些实施方式，提供了所述前列腺素F2α及其同系物在提高家畜的超数排卵效率中的应用。根据一些实施方式，提供了所述前列腺素F2α及其同系物在提高家畜的胚胎移植效率中的应用。根据一些实施方式，所述前列腺素F2α及其同系物可提高胚胎移植中的回收胚胎数。根据一些实施方式，所述前列腺素F2α及其同系物可提高胚胎移植中的胚胎回收率。根据一些实施方式，根据一些实施方式，所述前列腺素F2α及其同系物可提高胚胎移植中的可用胚胎数。根据一些实施方式，所述前列腺素F2α及其同系物可提高胚胎移植中的囊胚数量。

根据一些实施方式，所述前列腺素F2α同系物可以包括，但并不限于，13,14-二氢-17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-异丙酯(拉坦前列素)、20-乙基前列腺素F2α-(+)-氟前列醇异丙酯(曲伏前列素)、17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-酰胺、13,14-二氢-17-苯基 -18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-乙基酰胺(比马前列素)、他氟前列腺素F2α-乙醇酰胺、比马前列素(游离酸)-d

根据一些实施方式，所述前列腺素F2α同系物可以选自拉坦前列素、曲伏前列素、17-苯基-18,19,20-三去甲基前列腺素F2α-酰胺、比马前列素、他氟前列腺素F2α-乙醇酰胺、比马前列素(游离酸)-d

根据一些实施方式，所述前列腺素F2α同系物可以选自氯前列醇和/或氨基丁三醇前列腺素F2α。

根据一些实施方式，所述家畜包括可进行胚胎移植的家畜，例如羊、牛、兔、鼠等。

根据一些实施方式，所述家畜可以包括，但不限于，绵羊、山羊、湖羊和岩羊。根据一些实施方式，所述羊为绵羊或山羊。根据一些实施方式，所述家畜为绵羊。

根据一些实施方式，所述羊可以包括，但并不限于，细毛羊(例如，高山美利奴细毛羊)、乌珠穆沁羊、波尔山羊、小尾寒羊、高腿小尾寒羊、杜泊羊、萨能奶山羊和南江黄羊。

根据另一方面，提供了一种提高家畜的繁殖效率的方法，具体提供了一种提高家畜的超数排卵效率的方法。根据一些实施方式，所述方法包括，在埋置阴道栓之前，向雌性家畜施用前列腺素F2α或其同系物进行预处理。

根据一些实施方式，在埋置阴道栓之前10～20天，优选在埋置阴道栓之前14天左右，向所述雌性家畜施用前列腺素F2α或其同系物。

根据一些实施方式，所述前列腺素F2α或其同系物通过肌肉注射施用。根据一些实施方式，所述前列腺素F2α或其同系物按照0.1～0.3mg/只的剂量进行施用，例如以0.2mg/只的剂量施用。

根据一些实施方式，所述方法还包括，对所述雌性家畜进行超数排卵处理。根据一些实施方式，所述超数排卵处理采用卵泡刺激素和孕马血清促性腺激素进行处理。

根据一些实施方式，所述方法包括：向雌性家畜施用前列腺素F2α或其同系物；10～20天之后，对所述家畜埋置阴道栓，并施用卵泡刺激素和孕马血清促性腺激素对所述家畜进行超数排卵处理。

根据一些实施方式，所述雌性家畜为供体家畜，用于为受体家畜提供胚胎，以进行胚胎移植。根据一些实施方式，所述方法能够提高超数排卵的效率，例如提高胚胎移植效率。

通常理解前列腺素F2α直接作用于子宫肌层，刺激妊娠子宫使子宫肌收缩，这种收缩与足月妊娠分娩时宫缩相似，足以导致流产。本发明出乎意料地发现在埋栓处理前施用前列腺素F2α或其同系物，能够显著提高回收胚胎数、胚胎回收率、可用胚胎数以及囊胚数，从而有利于改善畜牧业生产。另外，与饲喂前列腺素相比，本发明的方法还具有在剂量上更加精确、对家畜的应激性更小、周期更容易控制等优点。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。

本文所用的术语“前列腺素”或“PG”是存在于动物和人体中的一类不饱和脂肪酸组成的具有多种生理活性的类激素脂质化合物，其基本结构具有前列腺烷酸骨架。PG在体内由花生四烯酸(AA1)所合成，结构上为一个五元脂肪环和两条侧链(上侧链7个碳原子，下侧链 8个碳原子)构成的二十碳不饱和脂肪酸。根据五元脂肪环上取代基(主要是羟基和氢)的不同，将PG分为A、B、C、D、E、F等类型，分别用PGA、PGB、PGC、PGD、PGE、PGF 等表示。

本文所用的术语“前列腺素F2α”或“PGF2α”是在许多动物物种中广泛存在的一种前列腺素，也是一种主要的子宫溶黄体前列腺素，可引起血管、支气管、肠及子宫平滑肌的收缩，且能抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化。已知前列腺素F2α可直接作用于子宫肌层，刺激妊娠子宫使子宫肌收缩，这种收缩与足月妊娠分娩时宫缩相似，足以导致流产。

本文所用的术语“同期发情处理”是指用某种或某些激素控制并调整一群母畜发情的过程，使之在预定的时间内发情，以便进行规模化人工授精和胚胎移植。

本文所用的术语“胚胎移植”是指，在畜牧业中，将良种雌性动物配种后的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育成为新个体。其中，提供胚胎的个体为供体，接受胚胎的个体为受体。

本文所用的术语“超数排卵”是指，在母畜发情周期的适当时间，施以外源性促性腺激素，使卵巢中比自然情况下有较多的卵泡发育并排卵的技术。对母畜进行超数排卵处理，可用于配种、人工授精、早期胚胎培养或胚胎移植。

本文所用的术语“桑葚胚”是指一个受精卵经过多次分裂，形成由32个左右细胞组成的细胞团。其属于动物胚胎发育的早期阶段，里面的细胞还是全能细胞。

本文所用的术语“囊胚”是指经过卵裂，受精卵被分割成很多小细胞，这些由小细胞组成的中空球形体，内部具有囊胚液、囊胚腔的胚胎。囊胚中所有细胞都没有开始分化，这个阶段之后胚胎开始出现分化。使用处于囊胚期的胚胎进行移植时，胚胎存活率较高。

下面提供实施例以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。

以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。

实施例

于羊场选用内蒙古自治区赤峰市草原金峰畜牧有限公司的甘肃高山美利奴细毛羊作为供体，平均体重在45～76kg之间，年龄2～3岁，体况良好，无繁殖疾病。膘情良好，无繁殖疾病的2～3岁乌珠穆沁羊，供受体胎次均为3～5胎次。采精公羊性欲旺盛，精液品质检查优良，精子活力0.6以上。自由采食和饮水，自然光照和补光(光照16h/d)，羊舍内温度为10～25℃，日粮为草料和预混料。埋栓后，每只实验羊每天饲喂至少0.5kg的胡萝卜，以补充足够的维生素。

选取埋栓(CIDR)前14天的供体绵羊，作为注射氯前列醇(宁波三生，谱诺)的实验组供体绵羊，与对照组供体绵羊进行同样的超数排卵处理。氯前列醇的注射剂量为0.2mg/只，肌肉注射绵羊臀大肌。

具体来讲，使用以下步骤来进行超数排卵和胚胎检测。

(1)供体羊超数排卵：采用孕酮阴道硅胶栓(CIDR)+卵泡刺激素(FSH)+孕马血清促性腺激素(PMSG)法进行超数排卵。实验组供体羊肌肉注射1mL氯前列醇(剂量：0.2mg/ 只)，注射后第14天将实验组供体羊埋置CIDR栓，同时肌肉注射3～5mL维生素AD。埋栓后第10天开始注射FSH，根据体重和手术次数调控剂量，总剂量区间为300～500IU/只，4天 8针注射法依次递减，第13d注射最后一针(第7针)FSH时同时取出CIDR栓，取栓后第12 h注射PMSG，剂量330～450IU/只。对照组供体绵羊除了未注射氯前列醇之外，其他操作同实验组供体羊。

(2)供体羊配种：供体羊在取栓后的第48～54h进行内窥镜人工输精。

(3)胚胎收集和质量检测：内窥镜输精后第5～6d手术法从子宫角冲胚，回收胚胎。在 40倍体视显微镜下捡出胚胎，剔除未受精卵，观察受精卵状态、色泽、大小、数量、饱满度以及发育期和发育阶段。

(4)受体羊的处理和腹腔镜胚胎移植，采用CIDR+PMSG法处理，与供体同步埋栓，且同时撤栓，撤栓时肌肉注射PMSG，剂量330～450IU/只，撤栓后24～36h试情，记录发情时间。供体在5～6天进行冲胚，受体通过腹部微创手术法进行移植，采用腹腔镜观察子宫两侧，单侧发现1～3个黄体则可进行移植，术后注射抗生素进行消炎。

(5)供受体羊术后管理：供受体羊术后要分栏喂养，供体受体羊保持足够饮水和饲料，圈舍内保持干燥整洁，防止术后感染，观察1～2d，在胚胎移植后45d，采用B超方法检查受体母羊妊娠情况进行妊娠检查。

通过上述操作，记录了注射实验组和对照组供体羊的冲胚数量、冲胚质量、移植情况以及母羊妊娠情况。统计结果见下文。

1.注射前列腺素F2α对甘肃高山美利奴细毛羊发情率和胚胎回收率的影响

由表1可知，实验组发情率约为100％，高于对照组发情率83.33％，但差异不显著(P>0.05)；实验组的黄体数总数约为18.50枚，高于对照组14.66枚(P>0.05)；对于超数排卵后所得的所有胚胎(即，回收胚胎总数)，实验组的回收胚胎总数约为17.00枚，显著高于对照组的8.00 枚(P<0.05)；实验组的胚胎回收率约为92％，也显著高于对照组57％(P<0.05)。这些结果表明，注射前列腺素F2α能够显著提高胚胎移植中获得的总回收胚胎数和胚胎回收率，但对发情率、黄体总数没有显著影响。

表1.注射前列腺素F2α对甘肃高山美利奴细毛羊发情率和胚胎回收率的影响。

注:1)同行数据肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)；

2)胚胎回收率＝回收胚胎数/黄体总数。

2.注射前列腺素F2α对甘肃高山美利奴细毛羊黄体数和可用胚胎数的影响

由表2可知，实验组的左侧黄体数约9.17枚，高于对照组的7.33枚，但差异不显著(P>0.05)；实验组的右侧黄体数约7.63枚，高于对照组7.33枚，差异不显著(P>0.05)；实验组的能用于移植的胚胎(即，可用胚胎数)约15.50枚，高于对照组6.83枚，差异显著 (P<0.05)。这些结果表明，注射前列腺素F2α能够显著提高胚胎移植中获得可用胚胎数，同时对左侧黄体数和右侧黄体数没有显著影响。

表2.注射前列腺素F2α对甘肃高山美利奴细毛羊黄体数和可用胚胎数的影响

注:同行数据肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。

3.注射前列腺素F2α对甘肃高山美利奴细毛羊受精率和胚胎质量的影响

由表3可知，实验组的受精率约91.18％，高于对照组的89.36％，差异不显著(P>0.05)；实验组的桑椹胚数约5.33枚，高于对照组的3.83枚，差异不显著(P>0.05)；实验组的囊胚数约10.00枚，高于对照组3.00枚，差异显著(P<0.05)。这些结果表明，注射前列腺素F2α能显著提高胚胎移植中的囊胚数。

表3.注射前列腺素F2α对甘肃高山美利奴细毛羊受精率和胚胎质量的影响

注:同行数据肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。

4.注射前列腺素F2α对甘肃高山美利奴细毛羊受胎率的影响

48h进行腹腔镜输精后，在第5～6天进行胚胎回收，然后进行腹腔镜移植。在移植后45 天进行妊娠检测，对妊娠率进行统计分析，结果示于表4中。结果显示，实验组和对照组的娠率分别为85.06％和81.58％，实验组高于对照组3.84个百分点，但差异不显著(P>0.05)。

表4.注射前列腺素对甘肃高山美利奴细毛羊受胎率的影响

以上所述，仅是对本发明的一般性说明及具体实施方案的描述而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。