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法律状态信息
法律状态
2022-06-03
公开
发明专利申请公布
技术领域
本申请涉及中医药及药物制剂技术领域，尤其涉及一种脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒的制备方法及其应用。
背景技术
脑卒中是全球第二大死亡原因和第三大致残原因，其中缺血性脑卒中占脑卒中的87％以上。大脑动脉阻塞导致的氧气、葡萄糖等缺乏会导致缺血性脑卒中发生。目前，重组组织纤溶酶原激活剂是美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的治疗缺血性脑卒中唯一的药物，它可以快速溶解血栓并恢复脑血流。脑血流恢复导致的再灌注损伤是溶栓治疗后神经功能恢复的主要障碍。毫无疑问，神经保护对于缺血性脑卒中的治疗非常重要。由于脑卒中病理机制的复杂性、血脑屏障(Blood Brain Barrier，BBB)的限制、药物缺乏特异性靶向性等原因，FDA尚未批准任何神经保护剂用于治疗缺血性脑卒中治疗。
丹酚酸B(Salvianolic acid B，SAB)是一种从中药丹参中提取的水溶性酚酸，可通过激活SIRT1信号通路清除自由基、改善能量代谢、减少细胞凋亡和炎症，发挥抗脑缺血/再灌注损伤作用。同时，SAB可以通过PI3K/Akt信号通路促进神经干/祖细胞增殖，从而改善短暂性全脑缺血模型大鼠的认知功能障碍。然而，SAB在血浆中的稳定性差以及BBB的存在阻碍了丹酚酸B在临床上的应用效果。因此，如何提高SAB在体内的生物利用度和缺血脑部的靶向性，对于SAB治疗缺血性脑卒中临床应用至关重要。
有研究构建了转铁蛋白受体单克隆抗体OX26修饰的脂质载体(OX26-BA/Sal B-NLC)促进SAB递送到脑内。然而，纳米粒在体内的循环时间受到网状内皮系统(Reticuloendothelial system reticuloendothelial system，RES)的限制，导致大部分纳米粒分布在肝脏和脾脏，而不是疾病部位。在体内循环时间过短也不利于纳米粒在疾病靶部位的聚集。聚乙二醇化(PEG修饰)是延长纳米粒在体内循环时间的常用策略，而亲水性材料包裹纳米粒也减少了与靶细胞的相互作用。因此，建立“不要吃我们”的策略来拦截RES以延长纳米粒的体内循环时间。红细胞膜(Red blood cell membrane，RBCM)因其免疫逃逸能力而被广泛应用于纳米给药系统。CD47，一种红细胞膜蛋白，可与吞噬细胞相互作用，并释放“不要吃我”的信号。同时，其他膜蛋白也有助于药物纳米载体以“自我”的形式呈现给免疫系统，免受清除。因此，红细胞膜包裹可以延长纳米粒的循环时间，减少RES对纳米粒的清除，从而促进纳米粒的脑部递送。
本发明设计了一种仿生给药系统(RR@SABNPs)，它由两部分组成：1)以丹酚酸B负载的牛血清白蛋白(BSA)纳米粒(SABNP)为内核。牛血清白蛋白具有生物相容性、生物可降解性、无毒性和非免疫原性，是纳米给药系统中最有潜力的材料之一。2)Arg-Gly-Asp(RGD)修饰的红细胞膜为外壳，RGD-RBCM与靶向配体一起充当生物模拟伪装物，不仅有助于延长纳米粒循环时间，还可以主动靶向缺血的BBB，提高丹酚酸B的生物利用度和在缺血脑部的聚集。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒的制备方法及其应用。本发明构建脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒能够延长丹酚酸B体内循环时间、增加丹酚酸B透过缺血侧BBB的能力，同时增加了丹酚酸B在缺血脑部聚集，提高了丹酚酸B治疗急性缺血性脑卒中的作用。与传统用于治疗缺血性脑卒中的丹酚酸B相比，本发明提高了丹酚酸B的生物利用度和治疗脑卒中效果。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，一种脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照5-20：1的重量比例将BSA和丹酚酸B溶于2-10倍体积水中，调pH至8.0，以1.0mL/min加入6倍水体积的乙醇，搅拌30min后，加入0.021倍水体积的2％戊二醛，持续搅拌12h，过滤获得丹酚酸B白蛋白纳米粒SABNPs；
(2)取1-5：1体积份的10mg/mL的SABNPs PBS溶液和红细胞膜放入1体积份的PBS中充分混合并挤出，制备获得红细胞膜包裹丹酚酸B白蛋白纳米粒(R@SABNPs)。
进一步地，所述步骤(2)中，红细胞膜通过如下方法制备获得：
取小鼠全血，4℃离心(2000rpm，10min)弃去血清及分界处的白色物质；加入预冷的1×PBS缓冲液，离心清洗多次，最后弃去上清，即得游离红细胞；按1：10的体积比例加入预冷的0.25×PBS缓冲液，于4℃冰箱中涨破30min；4℃离心(12000rpm，30min)弃去上清，重复以上步骤，直至上清液无色，即得红细胞膜(粉色果冻状)。
进一步地，还包括：收集的红细胞膜超声3分钟，然后使用迷你挤出机将无色的上清液分别通过800nm和400nm聚碳酸酯膜多次。
进一步地，所述红细胞膜为RGD修饰的红细胞膜。
进一步地，所述RGD修饰的红细胞膜通过如下方法制备获得：
将1：1-10(重量份μg：体积份μl)的线肽RGD-聚乙二醇-磷脂RGD-PEG-DSPE与红细胞膜混合，37℃孵育30min，离心去上清，沉淀复溶，得到脑靶向的红细胞膜。
进一步地，所述红细胞膜包裹丹酚酸B白蛋白纳米粒为RGD修饰，具有脑靶向性。
第二方面，一种根据第一方面所述制备方法制得的脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒。
第三方面，一种根据第二方面所述的脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒在制备治疗脑卒中药物的用途。
在一些实施例中，所述脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。
第四方面，一种脑卒中治疗药物，包括有效量的第一方面所述的脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒。
本发明的有益效果是：本发明的脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒能够延长丹酚酸B体内循环时间、增加丹酚酸B透过缺血侧BBB的能力，同时增加了丹酚酸B在缺血脑部聚集，提高了丹酚酸B治疗急性缺血性脑卒中的作用。与传统用于治疗缺血性脑卒中的丹酚酸B相比，本发明提高了丹酚酸B的生物利用度和治疗脑卒中效果。并且制备方法简单，工艺条件温和，制造成本低廉，对于脑卒中治疗具有药物经济学优势，适宜临床应用和市场推广。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
图1.RR@SABNPs的表征。(A)红细胞和RBCM的SDS-PAGE电泳蛋白分析结果图；(B)SABNPs、R@SABNPs、RR@SABNPs的大小分布和zeta电位结果图；(C)RR@SABNPs激光扫描共焦图像；(D)SABNPs、(E)R@SABNPs及(F)RR@SABNPs的TEM图像。
图2.RR@SABNPs的稳定性和生物相容性。(A)RR@SABNPs的放置稳定性结果图；(B)SAB溶液和RR@SABNPs在37℃下的血浆稳定性结果图；(C)SAB溶液和RR@SABNPs在37℃的PBS溶液中的释放曲线；(D)RR@SABNPs的溶血性统计结果图。
图3.SABNPs、R@SABNPs和RR@SABNPs对(A)bEnd.3细胞,(B)RAW 264.7细胞,及(C)PC12细胞活力的影响结果图。
图4.RR@SABNPs的长循环作用。(A)载FITC的SABNPs和RR@SABNPs在RAW 264.7细胞中摄取的荧光图像；比例尺，50μm；(B)RAW 264.7细胞摄取的流式细胞直方图；(C)流式细胞仪平均荧光强度的定量分析(n＝3)结果图；(D)大鼠静脉给药后SAB在SAB溶液、SABNPs和RR@SABNPs中的药代动力学结果图(n＝6)。***P<0.001。
图5.bEnd.3细胞对RR@SABNPs的摄取。(A)bEnd.3细胞摄取不同制剂的代表性荧光图像。比例尺，50μm；(B)bEnd.3细胞摄取的流式细胞直方图(从左至右依次为Control、SABNPs、R@SABNPs和RR@SABNPs)；(C)流式细胞仪平均荧光强度的定量分析结果图(n＝3)；***P<0.001。
图6.RR@SABNPs靶向缺血脑组织的能力。(A)MCAO/R小鼠静脉注射PBS、载Dir的SABNPs或RR@SABNPs后不同时间点的活体实时图像；(B)小鼠解剖器官的代表性荧光图像；(C)不同器官荧光强度的定量分析结果图；(D)MCAO/R小鼠代表性的TTC染色脑切片及具有代表性的脑切片荧光图像；(E)脑内荧光强度定量结果图；(F)脑切片缺血侧/正常侧荧光强度对比结果图(n＝3)；***P<0.001。
图7.RR@SABNPs对MCAO/R模型小鼠脑梗死体积及神经功能的影响。(A)实验方案流程图；(B)TTC染色脑组织切片；(C)脑梗死体积定量分析结果图(n＝10)；(D)mNSS评价结果图；(E)足误检测评价(n＝12)结果图；(F)MCAO/R模型小鼠脑切片图像；(G)H&E染色分析结果图；比例尺，50μm；(H)尼氏染色分析结果图；比例尺，250μm。*P<0.05,**P<0.01,or***P<0.001。
图8.RR@SABNPs对OGD/R损伤PC12细胞的神经保护作用。(A)OGD/R损伤PC12细胞的LDH释放结果图；(B)OGD/R损伤的PC12细胞内ROS的代表性荧光图像；比例尺,250μm；(C)OGD/R损伤PC12细胞中MMP的代表性荧光图像；比例尺,250μm。**P<0.01,***P<0.001。
图9.RR@SABNPs对H
图10.RR@SABNPs体内的安全性；H&E染色分析结果图；比例尺，50μm。
具体实施方式
本发明提供了一种脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒，主料为：丹酚酸B，脑靶向红细胞膜的纳米系统包括BSA、红细胞膜和RGD-PEG-DSPE。
本发明制备方法，包括如下步骤：
(1)丹酚酸B白蛋白纳米粒(SABNPs)的制备
按照5-20：1的重量比例将BSA和丹酚酸B溶于2-10倍溶质体积的水中，调pH至8.0，以1.0mL/min加入6倍水体积的乙醇，搅拌30min后，加入0.021倍水体积的2％戊二醛(体积分数)，持续搅拌12h，旋蒸除乙醇，过0.8μm滤膜。
(2)红细胞膜包裹丹酚酸B白蛋白纳米粒(R@SABNPs)的制备
取小鼠全血，4℃离心(2000rpm，10min)，小心弃去血清及分界处的白色物质。加入预冷的1×PBS缓冲液，离心清洗3次，最后弃去上清，即得游离红细胞。按1：10的比例加入预冷的0.25×PBS缓冲液，于4℃冰箱中涨破30min。4℃离心(12000rpm，30min)，弃去上清，重复以上步骤，直至上清液几乎无色，即得红细胞膜(粉色果冻状)。收集的红细胞膜超声3分钟。然后将得到的红细胞膜源性囊泡，使用迷你挤出机通过800nm和400nm聚碳酸酯膜(各20次)挤出获得红细胞膜。
取1-5：1体积份的10mg/mL的SABNPs和提取的红细胞膜放入PBS中混合，并使用迷你挤出机通过800nm聚碳酸酯膜混合挤压10次后，过0.8μm滤膜，制备获得R@SABNPs。
(3)RGD修饰红细胞膜包裹丹酚酸B白蛋白纳米粒(RR@SABNPs)的制备
将1：1-10(重量份：体积份)的RGD-PEG-DSPE与红细胞膜混合，37℃孵育30min，离心去上清，沉淀复溶，按上述(2)方式对红细胞膜进行处理，得到脑靶向的红细胞膜，以同样方法与SABNPs混合挤出，制备得到RR@SABNPs。
实施例1：
脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒的制备及表征
1.SABNPs的制备
精密称取20mg BSA溶于1mL水中，加入2.0mg丹酚酸B，调pH至8.0，以1.0mL/min加入6mL乙醇，搅拌30min后，加入21μl 2％戊二醛，持续搅拌12h，旋蒸除乙醇，过0.8μm滤膜，获得SABNPs。
2.R@SABNPs的制备
红细胞膜的提取：取小鼠全血，4℃离心(2000rpm，10min)，小心弃去血清及分界处的白色物质。加入预冷的1×PBS缓冲液，离心清洗3次，最后弃去上清，即得游离红细胞。按1：10的比例加入预冷的0.25×PBS缓冲液，于4℃冰箱中涨破30min。4℃离心(12 000rpm，30min)，弃去上清，重复以上步骤，直至上清液几乎无色，即得红细胞膜(粉色果冻状)，收集的红细胞膜超声3分钟。然后将得到的红细胞膜源性囊泡，使用迷你挤出机通过800nm和400nm聚碳酸酯膜(各20次)挤出得到红细胞膜。
鉴定：将游离红细胞及红细胞膜加到离心管中，向其中加入适量蛋白裂解液(RIPA：PMSF＝100：1)，冰上裂解30min，随后100W超声使其充分裂解，4℃离心(10000rpm，10min)，取上清液备用。按BCA蛋白定量试剂盒说明测定样品的蛋白总浓度。向样品中加入SDS上样缓冲液，煮沸10min即得上样样品。配置好浓缩胶和10％的分离胶后，按每孔30μg蛋白上样，先用80V，30min压线，然后换成120V，90min进行蛋白的分离。电泳结束后取出凝胶，用考马斯亮蓝染色30min，然后用洗脱液洗涤凝胶至蛋白条带清晰，最后于凝胶成像系统中成像。结果如图1A所示，红细胞和RBCM的蛋白带相似，说明RBCM的提取并没有破坏红细胞膜蛋白的完整性，这有利于膜包被的纳米颗粒获得红细胞的固有功能。
R@SABNPs的制备：0.5mL 10mg/mL的SABNPs分别加入0.25mL红细胞提取的细胞膜，0.25mL PBS混合，并使用迷你挤出机通过800nm聚碳酸酯膜混合挤压10次后，过0.8μm滤膜，备用。
3.RR@SABNPs的制备及鉴定
制备：将50μg RGD-PEG-DSPE与100μl的RBCM混合，37℃孵育30min，离心去上清，沉淀复溶，得到脑靶向的红细胞膜，以同样方法与SABNPs混合挤出，得到RR@SABNPs。
为了表征RBCM的完整涂层和RGD的成功修饰，将RGD-PEG-DSPE替换为FITC-PEG2000-DSPE，按上述方法制备FITC-R@SABNPs,离心去游离FITC，清洗2次，沉淀复溶后用激光共聚焦拍摄。结果如图1C所示，SABNPs周围出现绿色荧光，说明DSPE能插入细胞膜且SABNPs被RBCM完全覆盖，FITC-PEG2000-DSPE成功插入，同理说明RGD可通过这种方式修饰。
4.RR@SABNPs的理化性质表征
粒径、多分散系数及电位：采用动态光散射法测定了不同纳米粒的粒径、多分散性指数(PDI)和zeta电位。
如图1B所示，与R@SABNPs相比，RR@SABNPs的粒径和zeta电位分别略有增加。具体参数包括粒径、多分散性指数、zeta电位、EE和DL如表1所示。
表1.不同纳米颗粒的特性
包封效率(EE)与载药量(DL)：将100μL的SABNPs、R@SABNPs和RR@SABNPs纳米粒用乙腈稀释，超声10min，然后离心(12000rpm,10min)。采用高效液相色谱法测定上清液中SAB的含量。流动相为甲醇-乙腈(v/v,1：1)：0.2％磷酸溶液，比例为60：40(v/v)，流速为1ml/min。固定相为C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)。进样量为30μL，检测波长为280nm。纳米粒的DL和EE的计算公式如下：
EE(％)＝在SABNPs中SAB的重量/SAB投药量×100
DL(％)＝在SABNPs中SAB的重量/纳米粒的重量×100
结果如表1所示，与R@SABNPs相比，RR@SABNPs的EE和DL未有明显改变。
透射电子显微镜(TEM)分析：将纳米粒子滴在碳膜涂层的铜栅格上，然后浸入几滴磷钨酸溶液中。用TEM观察纳米粒的形貌。结果如图1D、1E及1F所示，TEM图像中SABNPs呈现均一的球型，而R@SABNPs及RR@SABNPs明显的核壳结构也表明SABNPs表面存在RBCM涂层。
体外药物释放：采用动态透析技术测定RR@SABNPs或SAB溶液剂中SAB的体外释放量。使用含5％(5g维生素C/100mL生理盐水)维生素C的生理盐水作为透析液以模拟血浆环境。将1ml含RR@SABNPs或SAB的血浆溶液剂(制剂中SAB的含量为1mg/mL)置于透析袋(3.5KDa MWCO)中，并置于50ml释放介质中，37℃持续搅拌(400rpm)。每隔一定时间取0.5ml样品，用预热至37℃的等量透析液替换。离心(12000rpm,5min)后，收集抽提样品上清，用HPLC分析。与SAB溶液相比，RR@SABNPs对SAB的降解具有明显的保护作用(图2B)。同时SAB释放曲线表明，RR@SABNPs比SAB溶液具有更好的缓释特性(图2C)，这可以保证SAB在循环中最小的泄漏，保护SAB不降解。
稳定性研究：①SAB在血浆中的稳定性：0.2ml大鼠血浆与1.8ml RR@SABNPs或SAB溶液混合(制剂中SAB的含量为1mg/mL)，37℃孵育。按预定时间间隔抽取0.1ml样品，与乙腈混合沉淀蛋白。离心(12000rpm,10min)，HPLC测定上清液中SAB的浓度。②放置稳定性：将SABNPs和RR@SABNPs置于4℃下，在预定的时间间隔内测量粒径和PDI。由图2A所示，在4℃下72h,纳米粒的粒径变化很小，表明其随时间的稳定性很好。
体外溶血试验：收集离心(3000rpm,5min)后红细胞，悬于生理盐水中，获得2vol％的红细胞悬液。将10mg/mL的SABNPs，R@SABNPs或RR@SABNPs与2vol％的按体积比1：1红细胞悬液混合，在37℃下孵育4h。阴性对照为生理盐水，阳性对照为Trizol。将混合物离心(3000rpm,5min)，用酶标仪在570nm波长下测定上清液吸光度。如图2D所示，纳米粒均未出现明显的溶血现象。
体外细胞毒性试验：将bEnd.3、PC12或RAW 264.7细胞(购自中国科学院细胞库)以1×10
实施例2
脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B药代动力学及体外细胞吞噬摄取研究
1.药代动力学研究
健康SD大鼠随机分为3组(每组6只)。通过尾静脉给予SABNPs、RR@SABNPs(制剂中SAB的含量为40mg/mL)和SAB溶液(40mg/kg SAB)。在给药后指定的时间，血样收集到0.5ml肝素化管中，离心(4000rpm,10min)获得血浆。将收集的血浆与等体积的乙腈(HCl 1vol％)混合，离心(12000rpm,10min)。采用高效液相色谱法测定上清液中SAB的浓度。药代动力学参数采用PK solver 2.0进行分析。SAB在血浆中的浓度-时间分布如图4D所示，参数如表2所示。静脉注射40mg/kg SAB后，血浆中SAB浓度在10min内由33.51μg/ml急剧下降至3.8μg/ml，在6h内逐渐下降至0.25μg/ml。与SAB溶液相比，纳米粒中SAB的血浆浓度显著升高，这主要归因于纳米粒对SAB蛋白酶降解的保护作用。SABNPs和RR@SABNPs的t
表2.溶液剂、SABNPs和RR@SABNPs的药动学参数(n＝6).
Notes：*P<0.05compared with SAB solution；#P<0.05compared withSABNPs.Data presented as mean±SD.
2.体外抗吞噬实验研究
RAW 264.3细胞以5×10
3.体外细胞摄取研究
bEnd.3细胞以5×10
如图5A所示，RR@SABNPs组的荧光高于SABNPs和R@SABNPs组，说明RR@SABNPs能更有效地进入bEnd.3细胞。流式细胞术分析也显示出相似的摄取情况，RR@SABNPs组bEnd.3平均荧光强度比SABNPs组的高出近1.4倍(图5B和5C)。这些结果表明，RR@SABNPs对整合素αvβ3表达的细胞具有较高的亲和力，这有助于RR@SABNPs特异性地将SAB输送到整合素αvβ3高表达的缺血脑区。
实施例3
本发明的脑靶向红细胞膜包裹丹酚酸B纳米粒对脑缺血再灌注损伤药效学评价实验
1.小鼠MCAO/R模型的建立
成年雄性C57BL/6J小鼠(体重23-25g)用3％异氟烷诱导麻醉，然后用1.0-1.5％异氟烷维持麻醉。术中使用加热垫将体温维持在36.5-37℃。颈部正中切开皮肤及皮下组织，显微镜下钝性分离肌肉，暴露左颈总动脉(CCA)、左颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。结扎CCA和ECA，并使用微血管动脉瘤夹夹住ICA。在ECA远心端剪一V型小切口，将涂有硅胶的6-0线栓轻轻插入ICA以阻断大脑中动脉。使用激光多普勒血流监测系统(MoorVMS-LDF2)监测脑血流变化。血流下降超过70％被认为是MCAO模型构建成功。缺血1.5小时后，通过拔出线栓实现再灌注。假手术小鼠行动脉暴露术，不进行动脉结扎和线栓栓塞。所有存活到终点的小鼠都被纳入实验。
2.活体成像
MCAO/R模型小鼠在再灌注16h后静脉给予PBS、DiR负载的SABNPs和RR@SABNPs(Dir10μg/mL)，并使用IVIS光谱体内成像系统(PerkinElmer，美国)对不同时间点(2、4和6h)进行成像。6h后经心脏灌流生理盐水，处死小鼠。收集主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)并成像。此外，大脑被切成5个切片，并由IVIS光谱体内成像系统检测。如图6A所示，与对照组相比，RR@SABNPs和SABNPs组有明显的荧光，说明纳米颗粒在脑内积累。纳米颗粒在脑内的分布随时间显著增加，在给药后6h(再灌注后22h)荧光最强。同时，与SABNPs组相比，RR@SABNPs组小鼠的脑区荧光增强，说明修饰有RGD的RBCM的包裹有利于RR@SABNPs在大脑中的聚集。6h后，解剖小鼠，收集主要器官，通过成像系统成像(图6B)。图6C为主要器官的荧光定量图，结果表明，SABNPs组的肝脏荧光最强。尽管肝脏中表达了高水平的整合素αvβ3，而RR@SABNPs中RGD的修饰并没有增加其在肝脏中的分布，反而降低，这归因于RBCM固有的免疫逃逸能力。
为了更直观地评价RR@SABNPs是否能靶向缺血脑组织，将采集的脑组织进行解剖分析。如图6D所示，缺血区和非缺血区均有荧光分布。RR@SABNPs组的荧光强度远远高于SABNPs组(近4倍)(图5D和5E)。此外，RR@SABNPs组缺血区荧光强度明显高于SABNPs组，提示缺血区SAB积累较多(图6D)。具体来说，在RR@SABNPs注射后，缺血侧与正常侧的荧光比率增加到高达1.5(图6F)，表明RGD修饰后RR@SABNPs脑缺血靶区明显增强，这可能与整合素αvβ3有关。
3.药效学评价
3.1实验分组及给药
成年雄性C57BL/6J小鼠(体重23-25g)随机分为假手术组、模型组、SAB溶液组和RR@SABNPs组。除假手术组外，所有组均接受MCAO/R手术，在再灌注后立即尾静脉给予生理盐水、SAB溶液(10mg/kg)和RR@SABNPs(10.6mg/kg)连续给药3天。
3.2行为学评价
MCAO/R模型术前和术后小鼠的神经功能和感觉运动功能分别使用改良神经功能缺损评分(mNSS)和足误试验进行评价。具体而言，mNSS评分从运动、感觉、平衡及反射四个方面整体评估小鼠神经功能损伤程度。足误试验用于评估前爪在网格上放置的准确性，即脑卒中受损前爪掉落的步数占总步数的百分比。小鼠将爪子放在网格表面(30×35×31cm)上，网格开口为2.5cm
3.3TTC染色及脑梗死体积定量分析
如图7A所示，最后一次给药后24小时小鼠进行心脏灌注，冰上取脑，并将其切割成7个1mm厚的冠状切片。然后用1.5％的TTC对脑片进行染色。TTC染色后，拍摄脑切片，并用ImageJ软件(NIH)分析梗死体积。使用以下公式计算梗死体积：梗死体积(％)＝[(对侧半球体积)-(非缺血同侧半球体积)]×100/对侧半球体积。与假手术组相比，MCAO/R后的脑梗死体积显著增加，表明MCAO/R模型的成功(图7B)。与MCAO/R模型组相比，RR@SABNPs梗死体积明显降低，从48％显著减少至38％(图7B、7C)。
3.4HE染色和Nissl染色
在再灌注72h后小鼠进行心脏灌注，待液体澄清后，用4％多聚甲醛灌注固定，收集小鼠大脑，并在室温下4％多聚甲醛中固定24小时，蔗糖溶液中脱水，制作冰冻切片。然后使用切片机将其切成5μm厚连续冠状位切片。在室温下用苏木精和伊红(H&E)对脑切片进行5分钟染色。在光学显微镜下进行组织学观察。此外，用Nissl染色液对上述脑切片进行20分钟的染色。将切片在70％、95％和100％乙醇中脱水，在二甲苯中清除，然后用中性树脂覆盖。然后对切片进行扫描，并通过理化扫描仪进行组织学观察。
图7F是MCAO/R模型小鼠脑切片的代表性图像，选择梗死周围区域(皮质(Cortex)和齿状回(DG))评估治疗后的病理特征。如图7G H&E染色显示，MCAO/R组小鼠缺血DG和Cortex区域的细胞数量严重减少，而RR@SABNPs组小鼠缺血DG和Cortex区域的细胞密度显著增加。与假手术组相比，MCAO/R组缺血区可见明显空洞，尼氏小体缺失较为明显(图7H)。RR@SABNPs处理后，空洞缩小，缺血半暗带的尼氏小体数量增加(图7H)。结果显示RR@SABNPs能有效抑制MCAO/R小鼠大脑神经元的丢失。
4.RR@SABNPs的体外神经细胞保护作用
4.1RR@SABNPs对OGD/R损伤PC12细胞的神经保护作用
LDH含量检测：将PC12细胞以1×10
胞内ROS水平和线粒体膜电位(MMP)的测定：建立上述OGD/R损伤PC12细胞模型。OGD/R实验结束后，分别用DHE和JC-1染色检测PC12细胞的ROS和MMP。倒置荧光显微镜检测DHE和JC-1的细胞荧光，用红绿荧光强度比值表示MMP。如图8B所示，与对照组相比，OGD/R显著提高了PC12细胞的荧光强度。这一荧光强度的增加被RR@SABNPs逆转，说明RR@SABNPs可以降低OGD/R诱导的细胞内ROS水平升高。使用JC-1荧光探针评估RR@SABNPs是否可以通过增加OGD/R损伤后的线粒体膜电位来抑制线粒体功能障碍。如图8C所示，对照组JC-1发出较强的红色荧光，说明JC-1在正常线粒体中以聚集状态存在。OGD/R损伤后，红色荧光减少，绿色荧光增加，说明PC12细胞MMP降低。与OGD/R组相比，RR@SABNPs组的MMP明显升高。
4.2RR@SABNPs对H
过量ROS的产生与线粒体功能受损和细胞损伤有关。为了进一步研究RR@SABNPs降低细胞内ROS水平和维持MMP的能力，建立了H
结果如图9所示，RR@SABNPs对H
5.RR@SABNPs体内安全性评价
为了阐明纳米粒的生物安全性，对雄性C57BL/6J小鼠连续静脉注射给药3天后(制剂中SAB含量为10mg/kg)，小鼠进行心脏灌注，待液体澄清后，用4％多聚甲醛灌注固定，解剖小鼠后，收集小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾、脑)，并在室温下4％多聚甲醛中固定24小时，蔗糖溶液中脱水，制作冰冻切片。然后使用切片机将其切成5μm厚切片。在室温下用苏木精和伊红(H&E)对心、肝、脾、肺、肾、脑等器官切片进行5分钟染色。在光学显微镜下进行组织学观察H&E染色分析。如图10所示，RR@SABNPs组与对照组相比无明显组织学改变。这些结果表明RR@SABNPs在体内具有良好的生物相容性和安全性。
以上实施例用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
