陆地棉GhMS20基因及其在创制棉花单显性雄性不育系的应用

摘要

本发明公开一种在陆地棉GhMS20基因及其编辑载体创制棉花单显性雄性不育系的应用，属于农业生物技术领域。本发明公开了一种培育棉花不育系的方法，针对棉花的MS20基因为靶标，创制单显性雄性不育系，步骤包括降低所述棉花植株中花粉发育相关的MS20的表达或活性的步骤。本发明可以产生新的棉花雄性不育系，用来生产杂交种子，开展新型二系杂交棉花、轮回选择和创造基因库，在农业生产上具有十分重要的应用。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种在棉花中表达的

背景技术

雄性不育是作物杂交制种和种质创新的重要遗传资源，雄性不育基因的定位、克隆与功能解析有重要的理论意义和应用价值。造成植物育性降低的因素有很多种，如绒毡层发育和降解异常、花粉发育异常、花药发育开裂异常和环境异常等。雄性不育通常是指雌雄同株植物保持完全正常的雌性功能，而不能产生正常功能雄性配子的一种生物学特征。该性状主要表现为花药无花粉、雄配子或花粉粒无活性和花药不开裂等，但雌蕊可接受外来的花粉而受精结实，这为研究花粉粒发育、细胞质、细胞核和核质互作遗传等基础研究提供重要实验材料，也成为开展农作物轮回选择、杂种优势、群体改良和种质资源创新的重要工具。因此，植物雄性不育机理和应用一直是生命科学领域研究的重点和热点。

棉花是重要的纤维作物，具有明显的杂种优势，棉花杂交制种途径包括人工去雄、化学杀雄、利用指示性状和雄性不育系等。目前，棉花育种生产杂交种主要通过人工去雄方法实现，但人工去雄生产杂交种具有成本高、效率低和育种周期长等缺点，因此，雄性不育在育种中的研究、应用和推广具有重要意义。然而，由于缺乏合适的雄性不育材料生产F

棉花雄性不育突变体研究主要集中于遗传学分析、细胞学和生理生化等方面。例如， 1355A是一个由单隐性突变引起的核不育突变体，其单核期花药的花粉壁增厚，没有刺突（Wu Y L, Min L, Wu Z, et al. Defective pollen wall contributes to malesterility in the male sterile line 1355A of cotton. Sci Rep, 2015, 5: 9608.）。随着基因组序列和分析基因功能工具逐步完善，转录组学研究也被用于研究不育突变体的发生机制，例如洞A不育突变体花药的转录组分析发现，差异基因主要参与激素信号传导、碳和能量代谢以及花粉壁发育（Wei M M, Song M Z, Fan S L, Yu S X. Transcriptomicanalysis of differentially expressed genes during anther development ingenetic male sterile and wild type cotton by digital gene-expressionprofiling. BMC Genomics, 2013, 14(1): 97.）。陆地棉光敏细胞核不育突变体CCRI9106和野生型对照在安阳长日照条件下花药转录组比较分析，揭示了CCRI9106潜在的雄性不育机制（Zhang M, Liu J, Ma Q, et al. Deficiencies in the formation andregulation of anther cuticle and tryphine contribute to male sterility incotton PGMS line. BMC Genomics, 2020, 21(1): 825）。尽管棉花中细胞质和细胞核雄性不育研究都取得了部分进展，但其应用并不广泛，而对显性核不育特别是单基因显性细胞核雄性不育的研究较少。因此迫切需要新的MS种质，尤其需要稳定的GMS种质来指导育种工作。

发明内容

本发明的目的在于提供棉花的

本发明提供花药发育相关的基因，命名为

本发明还提供含有所述的GhMS20基因的重组表达载体，优选地，所述载体是一种质粒。

本发明还提供含有所述基因或的所述重组有达载体的重组宿主细胞，优选为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或者植物细胞。

本发明的另一目的是提供针对编码棉花GhMS20蛋白的基因在创制棉花雄性不育系中的应用。

本发明进一步提供一种基于棉花花药发育相关的GhMS20基因培育棉花不育系的方法，其特征在于，包括步骤：降低所述棉花植株中花药发育相关的GhMS20基因的表达或活性。所述GhMS20基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示。所述降低棉花植株中花药发育相关的GhMS20基因活性的方法包括：使GhMS20基因的表达水平下降、和/或使其编码蛋白活性下降；所述的“降低”是指将所述棉花植株中在花药发育过程中GhMS20基因的表达水平降低满足以下条件：在棉花花药发育的减数分裂期，E1/E0 的比值≤30%；其中，E1 为所述GhMS20基因编辑植株中花药发育相关的GhMS20基因的表达水平；E0 为野生型同种类型植物正常的GhMS基因的表达水平。

优选地，所培育棉花不育系为单显性基因雄性不育系。

更优选地，通过基因同源重组或基因编辑的方法来实现GhMS20基因的表达或活性的降低。例如，在转基因棉花植株中knock out 棉花

所述的植物基因编辑载体为pCas9-

上述基因编辑重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在改良棉花育性中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，改变棉花性状具体为：1）导致棉花单显性雄性不育；2）棉花的其他农艺性状不受影响。

本发明还提供上述方法获得的棉花不育系在棉花育种的应用，其特征在于，包括：通过杂交、回交手段，恢复权利要求所述的不育系的育性。具体步骤包括：维持所述不育系的步骤；将植株由不育转为可育的步骤；维持植株可育并育种的步骤。

本发明人前期从引进的海岛棉（

附图说明

图1 GhMS20基因靶位点设计。其中，黑色方框代表外显子，灰色方框代表上下游非编码区，线条代表内含子。

图2 pRGEB32质粒载体示意图。

图3 Cas9-Gh MS20质粒载体示意图。

图 4农杆菌介导的下胚轴转化过程。其中，A. 下胚轴选择培养；B. 胚性愈伤组织分化培养；C. 胚状体生根培养；D. 炼苗；E. 再生植株。

图5 转基因植株的PCR鉴定。其中，M：DNA maker, 1-2: 基因编辑植株3：阳性对照；4：阴性对照。

图6 基因编辑植株GhMS20表达量检测。其中，基因编辑植株的MS20基因表达量显著下降：WT：对照植株；p-MS20：基因编辑植株。

图7 GhMS20基因编辑植株表型分析。其中，A，B，C：花药及柱头（野生型，GhMS20，GhMS20）；D，E，F：单个花药及花粉粒（野生型，GhMS20，GhMS20）

图8 GhMS20基因编辑植株花粉粒表型分析（I2-KI染色法检测花粉粒活性）。其中，A. 野生型可育植株花粉粒I2-KI染色；B和C基因编缉植株GhFAR2A-1，GhFAR2A-2花粉粒I2-KI染色。

图9 野生型植株花粉授粉后的恢复了基因编辑植株的育性。其中，A. 野生型植株花粉授粉后的基因编辑植株花朵；B. 杂交铃；C. 棉铃成熟吐絮。

具体的实施方式

实施例1

本发明人前期从引进的海岛棉（

为了进一步证实这一假设，本发明人将不育（SD98-6A或新海53A）和可育（BC

通过对可育株和不育株进行极端性状混池重测序（BSA-seq），定位到

(1)利用植物RNA提取试剂盒说明书提取棉花减数分裂期花药的RNA。使用ND1000核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和纯度，利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

(2)合成cDNA 第一条链；

(3) 设计上游引物（5'-CGC

(4)以步骤(2) 合成的cDNA第一条链为模板，以(3)中引物进行RT-PCR 扩增。RT-PCR反应程序为：94℃变性5min；35个循环（94℃1min，56℃ 1min，72℃ 1min）；72℃ 10min。反应体系（25 μL) ：10×

(5)PCR 产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收纯化目的片段。

(6)将步骤(5) 回收纯化的目标片段与pMD20-T 质粒相连接，反应体系如下：2×Buffer 5.0μl、pMD18-T Easy Vector 0.5μl、PCR 产物3.5μl、T

实施例2

根据陆地棉

将重组质粒p

实施例3 农杆菌介导的棉花遗传转化

含有重组质粒p

提取p

实施例4 基因编辑植株的鉴定及表达量分析

使用植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取转基因植株叶片总RNA，利用Easy Script® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒将总RNA反转录为cDNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。使用实时荧光定量PCR对所获得的编辑植株中的

实施例5 编辑植株靶位点测序及突变类型分析

分别在靶位点上下游100-200 bp设计引物，检测编辑类型。测序结果表明，编辑植株存在两种编辑类型。第一种编辑类型造成319 bp的片段缺失，缺失序列包含两个靶位点之间的序列，以及第一个靶位点上游34 bp和第二个靶位点下游7 bp。第二种编辑类型位于第一个靶位点，造成24 bp的片段缺失，缺失片段包含第一个靶序列的前6 bp及起始密码子上游非编码区1 bp。

实施例6 编辑植株的表型分析

编辑植株与野生型植株相比表现为雄性不育：野生型植株花药表面附着丰富的花粉粒，基因编辑植株花药异常萎缩，花药表面无花粉粒（图7）。对花粉粒进行I

<110>石河子大学

<120>陆地棉GhMS20基因及其在创制棉花单显性雄性不育系的应用

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<212>棉花

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<223>棉花FAR2A 基因

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<212>人工序列

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