一种甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法

摘要

本发明公开了一种甜叶菊品质育种亲本选配方法，属于作物品质育种领域。该方法包括育种材料叶片所含化合物的检测及定性和定量信息提取、基于目标化合物含量改良方向的育种材料利用潜力评估，建立了一种可计算的、更精准的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法。依照本发明的甜叶菊品质育种亲本精准选配策略，可提高甜叶菊品质育种效率。

说明书

技术领域

本发明属于作物品质育种领域，具体涉及改良甜叶菊叶内相关化合物含量的品质育种亲本选配方法。

背景技术

甜叶菊(又称“甜菊”，Stevia rebaudiana Bertoni)为原产于南美洲阿曼山脉的菊科Stevia属宿根性多年生草本植物，因其叶内富含一类口味不同程度地接近蔗糖、甜度为蔗糖150-300倍、热量为蔗糖1/300的四环二萜类化合物——甜菊糖苷而被广为种植加工。自上世纪七十年代引入以来，我国已发展为世界最主要的甜叶菊种植、加工基地。

随着消费水平的提高，糖尿病患者和体重控制人群越来越多，市场对天然来源的甜菊糖苷需求量越来越大，甜叶菊新品种选育直接关系到整个甜叶菊产业的可持续发展。

上世纪八十年代种植的甜叶菊叶片所含甜菊糖苷类化合物主要为具青草味的STV(Steviolside,甜菊苷)。随着人们对甜菊糖苷口感要求的提高，进入本世纪以来，甜叶菊叶片所含主要甜菊糖苷类化合物由具有青草味的STV逐渐转变为口感更加接近蔗糖的RA(Rebaudioside A,莱鲍迪苷A)。2010年以来，随着科研人员对甜叶菊叶片所含甜菊糖苷的开发，人们开始关注的甜菊糖苷种类越来越多：具增甜作用、可作为芳香剂使用的RC(Rebaudioside C,莱鲍迪苷C)；口感更接近蔗糖、后味更小的RD(Rebaudioside D,莱鲍迪苷D)和RM(Rebaudioside M,莱鲍迪苷M)；在味蕾上停留时间更短的莱鲍迪苷B(Rebaudioside B,RB)；水溶性好、稳定性高、口感纯正的莱鲍迪苷E(Rebaudioside E,RE)等。

在甜菊糖苷应用中，下游应用企业多以纯化至95-97％的高纯度RA、RD和RM、RB等进行复配应用。由于资金及技术门槛高、纯化效率低、纯化后的甜菊糖苷水溶性降低且同时留下大量口感差、需用β-环糊精葡萄糖基转移酶等酶改质后才可应用的低品位甜菊糖苷混合物。这增多了加工环节、提高了甜菊糖苷应用成本、制约了天然甜菊糖苷对三氯蔗糖等合成甜味剂的替代和市场拓展。

随着甜菊糖苷应用市场的扩大，包括可口可乐等在内的应用企业对甜菊糖苷的应用成本控制要求也越来越高，提出了不先对各甜菊糖苷组分进行纯化后再复配应用，而直接利用甜菊糖苷初提物进行添加应用的方案，这可极大地降低提取甜菊糖苷加工成本，促进甜菊糖苷对化学合成甜味剂的替换，同时也避免产生一些需利用β-环糊精葡萄糖基转移酶等酶改质后才能为下游应用企业所接受的低品位甜菊糖苷混合物。

应用环节的这一要求对甜叶菊育种工作提出了挑战。这要求新育成的甜叶菊品种应在现有品种的基础上提高RE、RD、RM、RA、RB等高品位甜菊糖苷的含量，同时降低STV、RF等低品位甜菊糖苷的含量。

由于甜叶菊为自交不亲和植物，之前的甜叶菊育种全凭经验，育种家们常利用的育种策略为“优优”杂交组合，即针对育种目标化合物，选择叶片中目标化合物含量高的单株系间配制杂交组合，由于甜叶菊叶片内包括甜菊糖苷在内的化合物种类繁多，且化合物间相互转化，而甜叶菊育种工作者所依托的化合物信息有限，只采用单一或有限几种化合物的含量信息进行杂交组合配制，育种效率低下。为了实现育种目标，育种工作者只能尽量多地配制杂交组合，成本高，成功率低。

同样地，由于甜叶菊为自交不亲和植物，遗传背景复杂，重组自交系获取难度大，这使得甜叶菊杂交后代间单株系叶片内包括甜菊糖苷在内的各化合物的种类和含量变异幅度大，育种工作者只能对所配制的杂交组合后代各株系海量地逐一检测。但是，一方面，由于甜叶菊叶片内包括甜菊糖苷在内的化合物种类多，常用的高效液相法分离检测方法，检测成本高，分离效率低，所提取的化合物信息少。另一方面，同样地由于化合物种类多，每个样品的分离检测所需时间多长达1.0小时及以上，时间成本高。

总概地，现有高效液相法检测方法分离效率低，所获化合物信息少，导致甜叶菊育种工作者无法在对各育种材料进行综合评价基础上有效配制杂交组合，导致育种效率低下。同时，由于甜叶菊杂交亲本遗传背景复杂，杂交后代变异程度大，育种材料及杂交后代检测的时间和仪器成本高，检测上的两大制约因素结合经验式杂交组合配制方法，严重制约了甜叶菊育种工作的高效开展，也制约了甜叶菊产业的可持续发展。究其根本原因在于，甜叶菊育种工作者缺乏一种有效提取育种材料及其杂交后代叶片所含化合物信息的方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对当前甜叶菊品质育种工作中因对育种材料叶片所含化合物信息的提取不充分及育种亲本选配的随意性所致的品质育种效率低下现状，本发明在对甜叶菊育种材料叶片所含化合物信息进行充分提取的基础上，根据育种方向，对各育种材料在改良甜叶菊叶片所含目标化合物含量方面的利用潜力进行评估，精准选配各育种亲本，实现对甜叶菊叶片内甜菊糖苷等化合物含量的高效改良，促进甜叶菊产业可持续发展。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种甜叶菊品质育种亲本选配方法，该方法包括以下步骤：

1)甜叶菊育种材料叶片所含化合物的检测。

采用液质联用方法(LC-MS)检测甜叶菊育种材料叶片所含化合物，其中：液相分离体系为：以ACE Ultracore 2.5 Super C18柱(150mm×4.6mm,2.5μm)为固定相，以含0.1％(v/v)甲酸(A)的纯净水和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱条件为：0min 22.0％B，7.0min26.5％B，12.0min 26.5％B，15.0min 38.0％B，19.0min 100％B，22.0min 100％B，22.01min 22.0％B。

质谱条件为：离子源为电喷雾电离源，负离子扫描模式，雾化气为纯度99.9％氮气，碰撞气为纯度99.999％氮气，雾化气压力为50psi，干燥气温度为350℃，干燥氮气流量为10.0L/min，毛细管电压为3500V，Mass range 100～5000m/z，碰裂电压175V。

2)甜叶菊育种材料叶片内检出化合物的定性分析。

各育种材料叶片所含化合物定性方法为：用包括但不限于保留时间、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰、2M-1峰和3M-1峰等共分离特征峰对各检出化合物进行定性。其中M-1为化合物的分子离子峰，M-1+36为氯化物离子峰，M+62为[M+NO

3)甜叶菊育种材料叶片内检出化合物的相对定量分析。

育种材料叶片检出各化合物的相对定量所采用方法包括以下三步：

第一步是按质量大小由小到大同时统计源于该化合物的质量大于等于1/2M的裂解峰、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰、质量介于M+62和2M-1之间的双分子裂解峰、2M-1峰、质量介于2M-1和3M-1之间的三分子裂解峰和3M-1及前述各峰的同位素峰所对应的峰面积。

第二步是以该化合物的质量大于等于1/2M的裂解峰、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰等4类特征离子及其同位素峰的峰面积乘以该化合物的单倍分子量(M)进行折算，质量介于M+62和2M-1之间的双分子裂解峰和2M-1峰及这两类峰的同位素峰峰面积乘以该化合物的两倍分子量(2M)进行折算，质量介于2M-1和3M-1之间的三分子裂解峰和3M-1峰及这两类峰的同位素峰峰面积乘以该化合物的三倍分子量(3M)进行折算。

第三步是对前述第二步折算的各类离子峰及其同位素峰峰面积所代表的该化合物的量进行求和，作为各育种材料叶片内该化合物的相对含量。

4)作为育种亲本的育种材料筛选。

可作为育种亲本的育种材料筛选分为三个步骤：

第一步，各育种材料收获器官内目标化合物理论含量的测算。

依相关系数由高到低筛选出与育种改良目标化合物相关的化合物，建立多元线性回归关系式，依多元线性回归关系式测算各育种材料叶片内育种改良目标化合物的理论含量。

第二步，作为父本的育种材料筛选。

比较各育种材料叶片所含改良目标化合物实测值和依多元线性回归关系式运算所得测算值，根据育种方向确定作为父本的育种材料：若需通过育种提高甜叶菊叶片中目标化合物的含量，则以实测值高、测算值与实测值相近、抗病性等田间性状好的育种材料为父本；反之，若需降低甜叶菊叶片中目标化合物的含量，则以实测值低、测算值与实测值相近、抗病性等田间性状好的甜叶菊育种材料为父本。

第三步，作为母本的育种材料筛选。

比较各育种材料叶片所含改良目标化合物的实测值与依多元线性回归关系式运算所得测算值，再根据育种方向确定可作为母本的育种材料：若需提高目标化合物的含量，则以测算值高、测算值大于实测值、产量高的育种材料为母本；反之，若需降低甜叶菊叶片中目标化合物的含量，则以测算值低、测算值小于实测值、产量高的甜叶菊育种材料为母本。

本发明技术方案中：所述的甜叶菊育种材料为遗传背景较为宽泛的甜叶菊杂交种子苗的无性扦插繁殖苗，各甜叶菊育种材料在田间性状、叶片所含化合物种类及各化合物相对含量等方面变异幅度大，同时还应包含育种工作开展时可搜集到的历史推广品种，以提高各育种材料的广泛性、提高育种效率。

本发明技术方案中：所述甜叶菊育种材料叶片取样时间等同于产地甜叶菊叶片的实际收获期，该收获期的确定因素包括甜叶菊叶片产量性状和甜叶菊叶片内目标化合物含量等两个方面，如以RB为主要育种目标则应于RB含量最高的现蕾前2-3周收获检测评价，以RA为主要育种目标者应于现蕾期收获检测评价。

本发明技术方案中：所述甜叶菊育种材料叶片取样方法为半株取样法，即由植株底部向顶部，在每一茎节和枝位各取一枚叶片，烘干后充分研磨混匀，全部通过60目筛，圆锥四分法取样检测。

本发明技术方案中：所述液相分离体系的要求为将各化合物一一分开，但由于甜叶菊叶片内所含化合物种类繁多，这一要求的实现具有一定挑战性，后期可通过共分离特征峰的精细识别将相关化合物一一分开。

本发明技术方案中：所述质谱条件中碰裂电压的设置要求为使尽量多的化合物以分子离子峰及其与氯离子、硝酸根离子等的加和离子形式进入质量检测器，提高各化合物的定性和相对定量准确度。

本发明技术方案中：所述质谱条件中质量分析器扫描范围的设置以确保目前已知的甜菊糖苷类化合物的2M-1峰和3M-1峰都可被扫描检测，提高各化合物相对定量准确度。

本发明技术方案中：所述各检出化合物的识别方法包括但不限于以同一保留时间段内出现的M-1峰、M-1+36峰、M+62峰、2M-1峰和3M-1峰等共分离特征峰对各甜叶菊育种材料叶片所含化合物进行定性，其中，M-1为化合物的分子离子峰，M-1+36为氯化物离子峰，M+62为[M+NO

本发明技术方案中：所述甜叶菊育种材料叶片各检出化合物的相对定量方法为同时统计该化合物的质量大于等于1/2M的裂解峰、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰、质量介于M+62和2M-1之间的双分子裂解峰、2M-1峰、质量介于2M-1和3M-1之间的三分子裂解峰和3M-1及前述各峰的同位素峰所对应的峰面积。

本发明技术方案中：所述甜叶菊育种材料叶片检出各化合物的相对定量方法是将该化合物的质量大于等于1/2M的裂解峰、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰等4类特征离子及其同位素峰的峰面积乘以该化合物的单倍分子量(M)进行折算，质量介于M+62和2M-1之间的双分子裂解峰和2M-1峰及这两类峰的同位素峰的峰面积乘以该化合物的两倍分子量(2M)进行折算，质量介于2M-1和3M-1之间的三分子裂解峰和3M-1峰及这两类峰的同位素峰的峰面积乘以该化合物的三倍分子量(3M)进行折算。

本发明技术方案中：所述甜叶菊育种材料叶片检出各化合物的相对定量方法是对各类离子峰及其同位素峰峰面积所代表的该化合物的量进行求和，作为各甜叶菊育种材料叶片内该化合物的相对含量。

本发明技术方案中：所述育种材料作为育种亲本筛选的第一个步骤为各育种材料叶片内育种改良目标化合物理论含量的测算。

本发明技术方案中：所述各育种材料叶片内育种改良目标化合物理论含量的测算方法为：依相关系数由高到低筛选出与育种改良目标化合物相关的化合物，建立多元线性回归关系式，再依多元线性回归关系式测算各甜叶菊育种材料内育种改良目标化合物的理论含量。

本发明技术方案中：所述育种材料作为育种亲本筛选的第二个步骤为作为父本的育种材料的筛选。

本发明技术方案中：所述作为父本育种材料的筛选方法为：比较各育种材料叶片所含目标改良化合物的实测值和依多元线性回归关系式运算所得测算值，根据育种方向确定可作为父本的育种材料：若需通过育种提高甜叶菊叶片中目标化合物的含量，则以实测值高、测算值与实测值相近、抗病性等田间性状好的育种材料为父本；若需降低甜叶菊叶片中目标化合物的含量，则以实测值低、测算值与实测值相近、抗病性等田间性状好的育种材料为父本。

本发明技术方案中：所述育种材料作为育种亲本筛选的第三个步骤为作为母本的育种材料的筛选。

本发明技术方案中：所述作为母本的育种材料的筛选方法为：比较各甜叶菊育种材料叶片所含目标改良化合物的实测值与依多元线性回归关系式运算所得测算值，根据育种方向确定可作为母本的育种材料：若需提高目标化合物的含量，则以测算值高、测算值大于实测值、产量等田间性状好的甜叶菊育种材料为母本；反之若需降低甜叶菊叶片中目标化合物的含量，则以测算值低、测算值小于实测值、产量等田间性状好的甜叶菊育种材料为母本。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对育种材料的广泛搜集，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本选配提供广泛的材料基础。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对收获期育种材料叶片品质现状的有效评价，为甜叶菊叶片品质育种提供有效的各育种材料叶片收获期所含各化合物数据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可以确保对育种材料植株整体情况有效评价，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本选配提供有效数据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对育种材料叶片所含化合物全面分离，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本选配提供有效数据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对育种材料所含化合物的各加和离子及其同位素离子进行全面统计，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本选配提供有效数据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对育种材料叶片所含各化合物进行较为全面的统计，特别是对2M-1峰和3M-1峰的扫描检测，非常有利于对在各育种材料间浓度差异较大的某一化合物和同一材料内浓度差异较大的各化合物相对含量的准确计算，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本选配提供有效数据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对育种材料叶片内各化合物的存在性进行有效判别，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本选配提供有效数据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对育种材料叶片内检出各化合物的相对准确定量，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本选配提供有效数据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对各育种材料作为育种亲本的应用潜值进行较为精准的评估，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本精准选配提供依据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对作为父本育种材料的有效筛选，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本精准选配提供依据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，可实现对作为母本育种材料的有效筛选，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种亲本精准选配提供依据。

依照本发明的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，重点解决了甜叶菊叶片品质育种亲本选配中的以下几个问题：

1)由于本发明采用了对植株田间性状、叶片所含化合物种类、叶片所含各化合物相对含量差异大的甜叶菊育种材料进行搜集考察的策略，为基于现有材料的甜叶菊叶片品质育种提供了广泛的材料基础。

2)由于本发明采用了在目标化合物最佳收获期对各育种材料进行评价的策略，避免了包括目标化合物在内各化合物含量在不同生育期间的波动对后期分析的影响，提高了育种材料评价效率、保障了评价数据的有效性。

3)由于本发明采用了包括植株全株各个部位叶位的半株取样法，避免了取样部位不同对检测数据的影响，提高了样品的代表性，保障了评价数据的有效性。

4)由于本发明采用了梯度洗脱液质联用检测方法，实现了对各育种材料叶片所含各化合物较为全面的分离检出，同时也提高了各检出化合物的信息丰富度，为后期各化合物间相关性分析等提供了较为全面和精准的数据采集。

5)由于本发明采用了利用同一时段内共分离的分子离子峰、加和离子峰、双分子离子峰等信息来综合判定各化合物存在性的方法，判断更为准确，为后期各化合物间相关分析提供较为全面和精准的数据采集。

6)由于本发明采用了对各化合物各碎片离子峰、加和离子峰、分子离子峰、双分子离子峰、三分子离子峰及前述各离子峰的同位素峰所代表的目标化合物的量进行加和统计的策略，提高了育种材料叶片内各化合物相对含量统计数据的有效性，为各化合物间相关分析提供了较为全面和精准的数据采集。

7)由于本发明采用了对育种材料叶片内各检出化合物相对含量都进行统计的方法，确保了用于测算各育种材料内育种改良目标化合物理论含量的多元线性回归关系式的可靠性。

8)由于本发明采用了通过比较各育种材料叶片所含目标改良化合物实测值和依多元线性回归关系式运算所得测算值间的差异结合育种方向来确定父、母本育种材料的亲本选配策略，杂交后代株系中叶片内目标化合物含量达到改良预期者占比高，育种效率高，可操作性强。

综上所述，由于采用了育种亲本精确选配的甜叶菊叶片品质育种方案，本发明的有益效果包括：

本发明突破了传统的只对育种材料中改良目标化合物的含量进行考察、凭借经验“优优”杂交组合进行甜叶菊叶片品质育种的策略，而是基于更广泛的育种材料和对各育种材料叶片所含化合物信息更全面的定性和定量分析，建立了一种可计算的、更精准的甜叶菊叶片品质育种亲本选配方法，为包括甜叶菊在内自交不亲和作物收获器官品质育种亲本的精准选配提供了更为可靠的新方法；避免了包括甜叶菊在内自交不亲和作物品质育种工作中亲本选配的随意性，有助于提高作物品质育种效率；有助于实现对包括甜叶菊在内自交不亲和作物各育种材料利用潜力的综合评价，为各作物品质育种核心种质资源库的建立提供依据；能够更好地发挥和利用包括甜叶菊在内各作物在提高动物和人类的健康福利水平中的作用，也有利于包括甜叶菊在内自交不亲和作物制种、种植、加工等环节的可持续发展。

利用本发明的育种亲本精确选配的甜叶菊叶片品质育种策略的优越性主要体现在以下几个方面：

1)通过对育种材料所含各检出化合物的全面评估，有助于高效地建立作物品质育种核心种质资源库，避免对种质资源的单一评价，更好地发挥各育种材料的育种潜力；

2)通过对各育种材料检出化合物信息的全面采集，有助于提高各育种材料作为育种亲本利用潜力的评价效率，提高作为目标化合物改良用父母本育种材料的选配精确度；

3)通过基于目标化合物改良方向的育种父母本的精确选配，高效地实现杂交后代收获器官目标化合物含量的提升或降低，有利于更好地发挥作物产品在提高动物和人类健康水平中的作用，有利于种业、种植业、提取业、养殖业和食品加工业等产业的可持续发展。

具体实施方式

实施例1

甜菊糖苷甜度高，约为蔗糖甜度的150-300倍，由于人体唾液中缺乏降解甜菊糖苷的酶，使得食(饮)用后其对味蕾会产生较为持续的刺激。RE为甜叶菊叶片合成的一种水溶性好、稳定性高、口感纯正的甜菊糖苷类化合物，其分子量与RA相同但其构型较RA更对称，在味蕾上停留时间短，口感接近蜂蜜，已作为新型甜菊糖苷类化合物进行开发应用。

现以提高甜叶菊叶内RE含量的杂交育种为例，展示本发明所述基于对具有广泛遗传背景和变异度的育种材料叶片所含各化合物信息全面解析的育种亲本精准选配策略在甜叶菊品质育种中的应用，包括如下步骤：

(1)甜叶菊种质资源库的建设：历年大田推广品种14份、2010-2018年实验室自育评价筛选保存材料123份、“南农1066”与“甜侬1号”杂交种子辐射诱变单株系材料70份，合计207份，以这些材料作为提高甜叶菊叶片内RE含量的育种材料进行分析选配。

(2)甜叶菊种质叶片样品的采集和准备：在现蕾期，半株取样法选取各株系叶片，80℃烘干过夜后研磨混匀过60目筛，取50mg入1.5mL 50％乙醇中振荡过夜，超声提取40分钟，4℃下10000rpm离心10分钟，取上清，0.45um有机微孔滤膜过滤，4℃冰箱保存待测。

(3)甜叶菊种质叶片所含化合物的液质联用方法(LC-MS)检测：液相分离体系为：以ACE Ultracore 2.5 Super C18柱(150mm×4.6mm,2.5μm)为固定相，以含0.1％(v/v)甲酸(A)的纯净水和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱条件为：0min 22.0％B，7.0min 26.5％B，12.0min26.5％B，15.0min 38.0％B，19.0min 100％B，22.0min 100％B，22.01min 22.0％B。质谱条件为：离子源为电喷雾电离源，负离子扫描模式，雾化气为纯度99.9％氮气，碰撞气为纯度99.999％氮气，雾化气压力为50psi，干燥气温度为350℃，干燥氮气流量为10.0L/min，毛细管电压为3500V，Mass range 100～5000m/z，碰裂电压175V。

(4)甜叶菊育种材料叶片内检出化合物的定性分析。用保留时间、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰、2M-1峰和3M-1峰等共分离特征峰对各甜叶菊育种材料叶片所含化合物进行定性。其中M-1为化合物的分子离子峰，M-1+36为氯化物离子峰，M+62为[M+NO

(5)甜叶菊育种材料叶片内检出化合物的相对定量分析。先按质量由小到大顺序同时统计各化合物的质量大于等于1/2M的裂解峰、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰、质量介于M+62和2M-1之间的双分子裂解峰、2M-1峰、质量介于2M-1和3M-1之间的三分子裂解峰和3M-1及前述各峰的同位素峰所对应的峰面积。再以质量大于等于1/2M的裂解峰、M-1峰、M-1+36峰、M+62峰等4类特征离子及其同位素峰的峰面积乘以该化合物的单倍分子量(M)进行折算，质量介于M+62和2M-1之间的双分子裂解峰和2M-1峰及这两类峰的同位素峰的峰面积乘以该化合物的两倍分子量(2M)进行折算，质量介于2M-1和3M-1之间的三分子裂解峰和3M-1峰及这两类峰的同位素峰的峰面积乘以该化合物的三倍分子量(3M)进行折算。最后，对各类离子峰及其同位素峰峰面积所代表的该化合物的量进行求和，作为各育种材料叶片内各化合物的相对含量。

(6)作为提高杂交后代叶片内RE含量的育种亲本的筛选，分为三个步骤：

第一步，各育种材料叶片内RE理论含量测算。

依相关系数由高到低筛选出与RE相关的化合物，先建立多元线性回归关系式:[RE]＝-376.272+0.429*[Rubusoside]+1.075*[787@16.766]-0.256*[741@16.559]+0.029*[RA]+1.560*[1097@12.704]+0.736*[919@16.094]。再依此多元线性回归关系式测算各育种材料叶片内RE的理论含量。

第二步，提高杂交后代叶片RE含量的父本育种材料筛选。

比较各育种材料叶片所含RE实测值和依多元线性回归关系式运算所得测算值，选取实测值高、测算值与实测值相近、抗病性等田间性状好、编号913的材料为提高杂交后代叶片RE含量的父本。

第三步，提高杂交后代叶片RE含量的母本育种材料筛选。

比较各甜叶菊育种材料叶片所含RE实测值与依多元线性回归关系式运算所得测算值，选取测算值高、测算值大于实测值、产量性状好、编号6659的材料为提高杂交后代叶片RE含量的母本。

(7)杂交选配实验

用编号913的材料为父本和编号6659的材料为母本进行提高杂交后代叶片RE含量的选配实验。

对比实施例1-1

参照传统的“优优”杂交组合选配父母本，与实施例1的差异为，直接选取在前述207份材料中叶片RE含量最高的编号4160的材料与编号6659的材料进行杂交，以编号4160的材料为父本，仍以编号6659的材料为母本。

对照组1

以编号6659的材料为母本，置于大田中自然授粉。

表1为各组合亲本单株系及其杂交后代收获期(现蕾期)叶片中RE含量。结果显示：

1)由于各亲本遗传背景复杂，各杂交组合后代现蕾期叶片中RE含量分离度高；

2)在三种杂交方法中，基于本发明所描述的利用育种材料叶片全组分分析结果的精准选配(实施例1)杂交后代群体叶片中RE含量的平均值和最高值高；

3)利用叶片中RE含量都较高的两育种材料采用传统的“优优”杂交组合(对比实施例1-1)和对照组的后代群体叶片中RE含量的平均值和最高值都较基于育种材料叶片全组分分析的精准选配杂交(实施例1)低。

结果表明，与传统方法相比较，由于本发明依托了变异更广泛的种质资源和更全面地采纳了收获器官内与叶片RE形成和积累密切关联的化合物信息，依照本发明进行的甜叶菊叶片品质育种亲本精准选配策略可明显提高育种效率。

表1各亲本单株系及各杂交组合后代现蕾期叶片RE含量情况

实施例2

STV为2010年以来广为推广种植的“润德”、“菊隆”、“谱星”、“浩天”等系列甜叶菊品种叶片内含有量仅次于RA的甜菊糖苷类化合物，由于其具青草味，现有策略是通过后期精制环节去除或降低其在甜菊糖苷混合品中的相对含量后再应用于下游的食品或饮料中。若能通过育种的方法降低其在甜叶菊叶片内的相对含量，将减少精制加工环节、降低加工成本、有效提升甜菊糖苷的市场开拓能力。

现以降低甜叶菊叶内STV含量的杂交育种为例，展示本发明所述基于对育种材料叶片所含化合物信息全面解析的亲本精准选配策略在甜叶菊品质育种中的应用，包括如下步骤：

(1)-(5)同实施例1

(6)作为降低杂交后代叶片内STV含量的育种亲本的筛选，分为三个步骤：

第一步，各育种材料内STV理论含量的测算。

依相关系数由高到低筛选出与STV相关的化合物，建立多元线性回归关系式:

[STV]＝-288528.498+3.182*[1031-2]+26.354*[537@19.723]+0.979*[836@14.407]+19.741*[571@5.013]+1.175*[353@1.25]+0.780*[RF]+2.456*[1051-10]-3.856*[357@19.773]

并依此多元线性回归关系式测算各育种材料叶片内STV的理论含量。

第二步，降低杂交后代叶片STV含量父本育种材料的筛选。

比较各育种材料叶片所含STV实测值和依多元线性回归关系式运算所得测算值，选取RA含量较高、STV实测值低、STV测算值与实测值相近、抗病性等田间性状好、编号4147的材料为降低杂交后代叶片STV含量的父本。

第三步，降低杂交后代叶片STV含量的母本育种材料的筛选。

比较各育种材料叶片所含STV实测值与依多元线性回归关系式运算所得测算值，选取RA含量高、STV实测值低、STV测算值小于实测值、产量性状好、编号6643的材料为降低杂交后代叶片STV含量的母本。

(7)杂交选配实验

用编号4147的材料为父本和编号6643的材料为母本进行降低杂交后代叶片STV含量的选配实验。

对比实施例2-1

参照传统的“优优”杂交组合选配父母本，与实施例2的差异为，直接选取在前述207份材料中产量性状较差，但叶片RA含量最高的编号810材料与编号6643的材料进行杂交，以编号810的材料为父本，仍以编号6643的材料为母本。

对照组2

以编号6643的材料为母本，置于大田中自然授粉。

表2为各组合亲本单株系及其杂交后代收获期(现蕾期)叶片中STV含量。结果显示:

1)由于各亲本遗传背景复杂，各杂交组合后代现蕾期叶片中STV含量分离度高；

2)在三种杂交方法中，基于本发明所描述的利用育种材料叶片全组分分析结果的精准选配(实施例2)杂交后代群体叶片STV含量的平均值和最小值都最低；

3)相比较地，利用叶片中RA含量高、采用传统的“优优”杂交组合(对比实施例2-1)和对照组的后代群体叶片中STV含量的平均值和最小值都较基于育种材料叶片全组分分析结果的精准选配杂交后代群体叶片STV含量(实施例2)高。

结果表明，与传统方法相比较，由于本发明依托了变异更广泛的种质资源和更全面地采纳了收获器官内与叶片STV形成和积累密切关联的化合物信息，依照本发明进行的甜叶菊叶片品质育种亲本精准选配策略可明显提高育种效率。

表2各亲本单株系及各杂交组合后代现蕾期叶片STV含量情况

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。