一种基于生物传感器的高通量筛选方法及其在多基因代谢途径优化中的应用

摘要

本发明公开了一种基于生物传感器的高通量筛选方法及其在多基因代谢途径优化中的应用，属于高通量筛选技术领域。本发明结合特异性响应乙醇酸的两个生物传感器构建高效的高通量筛选方法，对代谢物小分子乙醇酸的多基因途径文库进行高通量筛选，在短时间内实现了乙醇酸多基因代谢途径的优化。本发明一方面基于平板抗性阻力选择高产菌株可极大的扩大筛选通量，简单快速富集高产菌株；另一方面，结合96孔板测定荧光的方法快速检测发酵液中乙醇酸的浓度。该方法的乙醇酸传感器和温敏型复制子结合可以实现质粒的反复消除，有利于迭代高通量筛选。通过以上改进有效提高了目标高产菌株的筛选灵敏性，提高了高产菌株的富集效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于生物传感器的高通量筛选方法及其在多基因代谢途径优化中的应用,属于生物化学技术领域。

背景技术

乙醇酸是一种在工业上有多种用途的α-羟基乙酸，已被广泛应用于化妆品，化学清洗以及可降解材料等领域。近年来，随着代谢工程和合成生物学的不断发展，全生物合成法生成乙醇酸以反应温和，产品纯度高，原料易得，绿色可持续的优点受到广泛关注。前期的研究通过代谢工程手段强化乙醇酸代谢流，乙醇酸产量有了显著提高，因此，一些昂贵的诱导物依赖性的强启动子(例如T7，Trc 启动子)被广泛用于促进生物化学品合成途径的转录，显着增加了发酵成本。此外，基因表达控制对于增加重组蛋白的产生，微调代谢途径并可靠地表达合成途径至关重要，强启动子调控的乙醇酸合成途径的过表达通常会导致超出实际需要的大量蛋白质表达，从而导致代谢通量失衡以及细胞资源的浪费。近几年，随着合成生物学的发展，强大的天然组成型启动子为提高途径基因的表达水平提供另一种方法，以促进目标产品的积累，并实现即插即用的体系结构，以应用于具有不同遗传背景的宿主。

多模块工程策略是最常用的代谢途径优化策略之一，已成功应用于多种高附加值化学品的生产。然而，优化多基因代谢途径的过程会产生成千上万种不同的组合。乙醇酸生产菌株缺乏高通量筛选方法是系统优化其合成途径的主要挑战。本发明针对上述存在的关键难题，建立乙醇酸途径文库并建立高效可行的基于乙醇酸传感器的高通量筛选方法，从而快速平衡乙醇酸代谢通路，改善菌体生长和生产性能，并为其他代谢产物的代谢通路平衡及高通量筛选提供理论参考。

发明内容

技术问题：

现有技术中的乙醇酸生物传感器通过荧光信号进行对乙醇酸生产菌株的筛选，而在实际应用中发现乙醇酸生产菌株发酵生产乙醇酸的周期与荧光检测相矛盾，发酵时间短菌株生产乙醇酸产量之间的差异不明显，生产时间长荧光信号发生衰减；且乙醇酸会分泌至胞外，干扰了反应体系中乙醇酸生产菌株单体的荧光信号，单个菌株的荧光信号是不真实的。

技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种乙醇酸生产菌株的筛选系统，包括第一传感器、第二传感器和乙醇酸合成缺陷菌株。

在一种实施方式中，所述第一传感器包括P

在一种实施方式中，所述抗性基因包含且不限于氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因，环丝氨酸抗性基因。

在一种实施方式中，所述第二传感器是根据公开号为CN110684792A的专利中的实施例1的方法构建，并命名为pGBS-P

本发明的第二目的是提供构建所述第一传感器的方法。

在一种实施方式中，所述第一传感器是将第二传感器pGBS-P

在一种实施方式中，所述第一传感器pGBS-P

在一种实施方式中，所述第二传感器是根据公开号为CN110684792A的专利中的方法构建并命名为pGBS-P

本发明的第三个目的是提供上述乙醇酸筛选方法在高通量筛选微生物中的应用，包括如下步骤：

1)将第一传感器转化至待筛选的细胞中，将重组细胞在含抗生素的培养基中筛选；

2)将步骤(1)筛选的细胞培养的上清诱导含有第二传感器的乙醇酸合成缺陷菌株，于高通量培养容器中培养。

本发明的第四个目的是提供上述高通量筛选方法在筛选乙醇酸生产菌株的应用，所述具体步骤如下：

1)将第一传感器投入待筛选的乙醇酸生产菌株中，并涂布于含有抗生素的选择琼脂板；

2)将步骤1)中平板上生长的单菌落挑取至高通量培养容器发酵培养，离心并收取上清；

3)将步骤2)获得的上清以8-12％的比例添加到M9培养基中诱导含有第二传感器的乙醇酸合成缺陷菌株，诱导4-8h后测量混合培养物的单细胞绿色荧光值，进一步筛选菌株；

4)将步骤3)筛选到的菌株40-44℃恒温摇床过夜培养消除第一传感器，摇瓶发酵复筛。

在一种实施方式中，步骤2)所述的发酵的条件是28-32℃，250rpm；步骤 4)所述的发酵的条件是35-39℃、250r/min。

在一种实施方式中，所述发酵的培养基为M9培养基，其组成为M9盐溶液、 8g/L葡萄糖、2mM MgSO

本发明第五个目的是提供一株乙醇酸生产菌株，所述菌株是由上述高通量筛选系统筛选得到的。

在一种实施方式中，所述菌株以乙醇酸生产菌株Mgly6为出发菌株，包含分别由PUTR

在一种实施方式中，所述菌株以乙醇酸生产菌株Mgly6为出发菌株，包含分别由PUTR

在一种实施方式中，所述ycdW基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述aceA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述gltA基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示，所述PUTR

本发明的第六个目的是提供一种生产乙醇酸的方法，所述方法为应用上述获得的乙醇酸生产菌株进行发酵。

在一种实施方式中，所述发酵的条件为：温度35-39℃，通气量0.5-1.5vvm，搅拌转速350-450rpm，利用氨水调节PH维持在7.0。初始葡萄糖添加量为5-8g/L，待发酵培养基里面的葡萄糖消耗至1-2g/L时补加葡萄糖，以维持葡糖糖浓度在 1-4g/L的速度进行补料。

本发明第七个目的是提供所述高通量筛选方法在筛选代谢乙醇酸或其上下游产物的菌株中的应用。

本发明的第八个目的是提供上述菌株在乙醇酸生物合成中的应用。

有益效果：

建立了一种乙醇酸高通量筛选方法，结合此方法可实现快速对乙醇酸多基因代谢途径的优化。利用本发明建立的的高通量筛选方法，在一周内完成了容量为 60万的途径文库的筛选，获得最佳菌株Mgly6-H1在不使用诱导剂的情况下可以产乙醇酸45g/L。

此方法是首次建立的针对微生物发酵生产乙醇酸的高通量筛选方法。本发明所采用高通量筛选方法是基于传感器经过两轮筛选，可高效的筛选获得高产菌株。相比流式细胞仪的单个细胞荧光信号检测，基于平板抗性阻力的选择策略可极大的扩大筛选通量，并且避免了乙醇酸生产周期长伴随着荧光猝灭的问题，同时也避免了分泌至细胞外小分子化合物在溶液中扩散导致的高产细胞难以识别的问题。另外，发酵液上清诱导对数期的传感器细胞也完美地平衡了荧光蛋白半衰期短和生产周期长的矛盾，同时进一步筛除了低产量菌株。

附图说明

图1乙醇酸工作原理及对不同浓度乙醇酸响应强度。A：乙醇酸传感器 pGBS-P

图2高通量筛选方法。A：高通量筛选流程；B平板菌落大小与乙醇酸产量的关系；C：发酵液诱导传感器细胞荧光值与乙醇酸产量的关系。

图3途径文库构建过程。

图4途径文库经筛选后乙醇酸摇瓶发酵产量。正方形代表OD值，圆形代表乙醇酸浓度，三角形代表葡萄糖浓度，菱形代表乙酸浓度。

图5工程菌株Mgly6-H1上罐发酵图。

具体实施方式

大肠杆菌JM109用于质粒构建，MG1655ΔglcC(已在专利中公开：公开号CN110684792A)用于传感器的表征，乙醇酸生产菌株Mgly6为本实验室保存(已在文章中公开：Systematic analysis of the effects of different nitrogen source and ICDHknockout on glycolate synthesis in Escherichia coli)。DNA聚合酶购自Takara 公司，重组克隆试剂盒C112购自诺唯赞公司。多功能酶标仪Cytation 3plate reader(BioTek)用于检测样品荧光强度。

对照组菌株为Mgly625(Mgly6携带质粒pJUN-5和pJUN-YA)：该菌株也发表于文章Systematic analysis of the effects of different nitrogen source and ICDHknockout on glycolate synthesis in Escherichia coli。

质粒pGLY-2：发表于文章Balancing the carbon flux distributions betweenthe TCA cycle and glyoxylate shunt to produce glycolate at high yield andtiter in Escherichia coli。

质粒pJUN-YA：发表于文章Systematic analysis of the effects of differentnitrogen source and ICDH knockout on glycolate synthesis in Escherichia coli。

质粒pJUN-5：发表于文章Systematic analysis of the effects of differentnitrogen source and ICDH knockout on glycolate synthesis in Escherichia coli。

四环素选择琼脂平板：6.78g·L

实施例1乙醇酸传感器的设计与构建

如图1A所示，pGBS-P

生物传感器pGBS-P

表1引物序列表

实施例2乙醇酸传感器对乙醇酸的响应

为检测乙醇酸传感器的响应性能，通过外源添加不同浓度乙醇酸诱导报告基因的表达。

pGBS-PffS-sfgfp导入宿主菌MG1655ΔglcC后挑取单菌落接种至卡那霉素抗性的液体LB培养基中，30℃，250rpm过夜培养制备种子液。将种子液分别以初始OD

pGBS-P

实施例3途径文库的构建

在乙醇酸生产中，具有三个关键途径基因，分别为ycdW、aceA和gltA，它们由诱导型启动子ptrc和T7启动子控制。用一系列具有梯度强度的启动子来取代Trc和T7启动子，以微调代谢途径并避免使用IPTG。将22个具有梯度强度的PUTR(启动子和5’UTR复合物)扩增并随机分别连接到三个途径基因的上游，将构建的质粒文库共转化为携带传感器的乙醇酸工程菌株 Mgly6(pGBS-P

以含有基因ycdW的质粒pJUN-YA为模板，用引物PycdW-F/PycdW-R扩增得到线性化载体ptrc-ycdWaceA，以含有基因gltA的质粒pJUN-5为模板，用引物 PgltA-F/PgltA-R扩增得到线性化载体pCDF-gltA；将扩增的22个PUTRs以等摩尔比(0.06pmol)混合均匀后，随机与线性化载体ptrc-ycdWaceA和pCDF-gltA相连接，得到两个质粒文库ptrc-α-ycdWaceA和pCDF-γ-gltA。

使用引物对PaceA-F/PaceA-R来扩增和线性化上一步构建的含有基因aceA 的质粒文库ptrc-α-ycdWaceA。在这里，为了尽可能引入模板多样性，将模板 ptrc-α-ycdWaceA过量加入(200ng)，线性化载体扩增完成后，回收得到的线性化载体经DpnΙ酶消化后去除多余的质粒模板。然后，将22个PUTRs随机插入aceA 的上游，得到质粒文库ptrc-α-ycdW-β-aceA。

将构建的质粒文库共转化为携带传感器pGBS-P

实施例4高通量筛选方法的评估

为了验证高通量筛选方法在实际应用中的可行性，将实施例3中构建的途径文库涂布于四环素选择琼脂板上。由实施例2可知：存在四环素时，携带传感器 GRT-P

为了验证48孔板筛选的可行性，将荧光值与通过高效液相色谱测量的乙醇酸产量进行了比较。首先在四环素抗性平板上随机挑取若干个单菌落于48孔板发酵，发酵24小时后，孔板4000rpm离心5min取上清，以10％的比例添加到 M9培养基中诱导提前培养至对数期的不产乙醇酸并含有pGBS-P

实施例5高通量筛选高产乙醇酸菌株

多基因途径优化面临最大的挑战是需要对大量的文库进行筛选，因此高效可行的筛选方法尤其重要。如图2所示，根据实施例1构建的生物传感器建立了一个高通量筛选方法，具体筛选步骤如下：

1)将步骤实施例3中构建获得的理论多样性为10648的途径文库涂布于四环素选择琼脂平板上，30℃，250rpm培养12-16h。

2)挑选单个大菌落(直径为1.5-2.5mm)接种于含有0.5mL M9培养基的 48孔板中30℃、250r/min培养24h。

3)将步骤2)中的48孔板4000rpm离心5min取上清，以10％的比例添加到M9培养基中，诱导提前培养至对数期的传感器细胞MG1655ΔglcC (pGBS-P

实施例6组成型工程菌株摇瓶发酵复筛

经过两轮筛选后最后获得155株高产菌株，在42℃摇床过夜培养消除传感器pGBS-P

发酵培养基：M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mM MgSO

发酵条件：将过夜培养的种子液以2％的体积接种至25mL发酵培养基中， 37℃、250r/min培养24小时后取样离心，经0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC检测乙醇酸浓度。结果如图4所示，有14％的菌株超过对照组诱导型菌株Mgly625的产量，它们的产量及过表达ycdW基因、aceA基因以及gltA基因所使用的PUTR名称如表2所示。产量最高的菌株为Mgly6-H1，产量为3.6g/L。

表2用于调控组成型乙醇酸生产菌株途径基因的PUTR

注：“-”代表基因ycdW和aceA共同由同一个启动子控制启动。

实施例75L发酵罐发酵生产乙醇酸

为进一步提高乙醇酸产量，Mgly6-H1在5L发酵罐进行上罐发酵，培养基同摇瓶发酵，初始葡萄糖为5g/L。发酵条件如下：

温度37℃，通气量1vvm，搅拌转速400rpm，利用氨水调节PH维持在7.0。待发酵培养基里面的葡萄糖消耗至1-2g/L时补加葡萄糖，以维持葡糖糖浓度在 1-4g/L的速度进行补料。

结果分析：发酵过程中每2h取一次样，12000rpm离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC检测乙醇酸、葡萄糖及副产物乙酸的浓度。结果如图5所示，菌体OD值从0-28h快速增长，28h后趋于稳定，在108h达到最高OD

对比例：

使用生物传感器pGBS-P

将传感器pGBS-P

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于生物传感器的高通量筛选方法及其在多基因代谢途径优化中的应用

<130> BAA210165A

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggatatca tcttttatca cccaacgttc gatacccaat ggtggattga ggcactgcgc 60

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tatgctttag tctggcatcc tcctgttgaa atgctggcag ggcgcgatct taaagcggtg 180

ttcgcactcg gggccggtgt tgattctatt ttgagcaagc tacaggcaca ccctgaaatg 240

ctgaaccctt ctgttccact ttttcgcctg gaagataccg gtatgggcga gcaaatgcag 300

gaatatgctg tcagtcaggt gctgcattgg tttcgacgtt ttgacgatta tcgcatccag 360

caaaatagtt cgcattggca accgctgcct gaatatcatc gggaagattt taccatcggc 420

attttgggcg caggcgtact gggcagtaaa gttgctcaga gtctgcaaac ctggcgcttt 480

ccgctgcgtt gctggagtcg aacccgtaaa tcgtggcctg gcgtgcaaag ctttgccgga 540

cgggaagaac tgtctgcatt tctgagccaa tgtcgggtat tgattaattt gttaccgaat 600

acccctgaaa ccgtcggcat tattaatcaa caattactcg aaaaattacc ggatggcgcg 660

tatctcctca acctggcgcg tggtgttcat gttgtggaag atgacctgct cgcggcgctg 720

gatagcggca aagttaaagg cgcaatgttg gatgttttta atcgtgaacc cttaccgcct 780

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<211> 1305

<212> DNA

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cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180

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taagaccaga aaacgtgatt taacgcctga tttgtcgtac ctggagtctt ccctttcgcc 60

ccccgtctgg tctacatttg gggggcgaaa aaaagtggct atcggtgcgt gtatgcagga 120

gagtgctatt ctggcatttc cgtcgcactc gatgcttagc aagcgataaa cacattgtaa 180

ggataactt 189

<210> 13

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgcgggttg atgtaaaact ttgttcgccc ctggagaaag cctcgtgtat actcctcacc 60

cttataaaag tccctttcaa aaaaggccgc ggtgctttac aaagcagcag caattgcagt 120

aaaattccgc accattttga aataagctgg cgttgatgcc agcggcaaac cgaattaatc 180

aaaggtgaga ggcac 195

<210> 14

<211> 192

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgctgcaatt tttatcgcgg aaaagctgta ttcacacccc gcaagctggt agaatcctgc 60

gccatcacta cgtaacgagt gccggcacat taacggcgct tatttgcaca aatccattga 120

caaaagaagg ctaaaagggc atattcctcg gcctttgaat tgtccatata gaacacattt 180

gggagttgga cc 192

<210> 15

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tttcgtttca acgccatcaa aacattgact tttatcgccg tagccttttc aataaaggtc 60

ttttgaagag taccaaaagg taacgcaagc a 91