FLT3基因突变在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用

摘要

本发明提供FLT3基因突变在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂ICI疗法敏感性中的应用，以及在预测非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷程度中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及临床分子诊断学领域，具体涉及FLT3基因突变在预测ICI疗法敏感性中的应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫治疗取得了一系列突破性成果，成为继手术治疗、放化疗及靶向治疗之外的革命性治疗手段，特别是基于PD-1/PD-L1、CTLA-4等新兴的免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)的治疗方案在多种实体瘤得到了广泛的研究，并已进入非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)一线治疗。虽然免疫检查点抑制剂效果不错，但整体客观缓解率(Objective response rate，ORR)依然只有20％左右，因此，开发合适的生物标志物，精确筛选更多免疫治疗获益人群，是未来肿瘤免疫治疗发展亟待解决的关键问题。

目前，正在探索免疫治疗反应的各种生物标记物(Biomarker)。基于免疫组织化学染色检测肿瘤PD-L1表达是目前免疫治疗应用最为广泛的生物标志物。在某些肿瘤类型，如非小细胞肺癌，PD-L1的表达可以作为抗PD-1/PD-L1治疗反应的预测标志物。KEYNOTE-024研究结果显示，PD-L1高表达的NSCLC患者从帕博利珠单抗治疗中获益最大，特别是PD-L1表达≥50％的驱动基因阴性的晚期患者，一线治疗效果优于化疗。KEYNOTE-042研究显示帕博利珠单抗能显著改善PD-L1表达≥1％NSCLC患者的总生存期(Overall survival,OS)。但是，多个临床试验结果显示PD-L1表达对免疫治疗疗效的预测能力并不一致，部分PD-L1阴性患者依然能从免疫治疗获益，虽然PD-L1阴性患者整体有效率更低，但持续缓解时间不逊于PD-L1阳性的患者。并且，PD-L1的检测标准依然存在诸多争议，而且PD-L1在肿瘤的不同的解剖以及随着治疗的进展都会发生改变。

肿瘤突变负荷(Tumour mutational burden,TMB)是指肿瘤基因组特定区域每百万碱基中体细胞突变的总数，TMB已证明与多种肿瘤类型包括黑色素瘤，非小细胞肺癌和膀胱癌的免疫检查点抑制剂的治疗疗效相关。2019年，NCCN指南将TMB列为转移性非小细胞肺癌接受免疫治疗的推荐检测方法。基于KEYNOTE-158试验，2020年6月份，FDA加速批准帕博利珠单抗用于单药治疗肿瘤突变负荷高(TMB-H)且既往治疗后疾病进展的无法切除或转移性实体瘤患者，无需考虑癌症类型。尽管如此，TMB作为预测因子的应用仍面临一些问题。首先，CheckMate-227和CheckMate-528研究提示高TMB患者能从免疫治疗中获益，但KEYNOTE系列研究的探索性分析的结果显示，无论TMB的高或低，帕博利珠单抗联合化疗在鳞状和非鳞状NSCLC患者的一线治疗中均显示出生存获益。其次，国内不同检测机构因检测产品不同及算法各异，TMB的检测尚没有标准的方法。此外，目前究竟怎样的TMB阈值可以区分有效或者无效患者尚存在疑问。

DNA错配修复缺陷(Mismatch repair deficient,dMMR)或微卫星高度不稳定(Microsatellite instability high,MSI-H)在结直肠癌、胃癌等消化系统肿瘤中也显示出不错的预测作用。FDA首次依据分子标志物加速审批通过抗肿瘤药物帕博利珠单抗跨瘤种适应症，用于治疗MSI-H或dMMR的晚期经治实体瘤患者。但是肿瘤中MSI-H比例太低，临床推广有一定局限性，特别是dMMR/MSI-H对肺癌免疫治疗疗效的预测价值还需要更多的研究和数据来验证。PD-L1表达、TMB和MSI不稳定性是预测免疫疗效的重要指标，任一生物标志物单用都会遗漏很多潜在免疫治疗获益人群。临床上其它免疫治疗疗效预测新型的生物标志物也在探索中，研究者通过分析帕博利珠单抗治疗患者的肿瘤组织特异性基因表达谱，发现包含与抗原呈递，趋化因子表达，细胞毒性活性和适应性免疫有关的IFN-γ应答基因组成的T细胞炎症基因表达谱(Gene expression profile,GEP)，能够预测PD-1抑制剂的临床效果，并在黑色素瘤、肺癌、头颈部鳞癌等进行验证。此外，在未来的研究中，生物标志物之间的相关性研究及其联合使用也是未来肿瘤免疫治疗的主要方向，多种生物标记物联合可能会实现更加精准治疗，为患者带来更多的临床受益。

随着二代测序在肿瘤精准治疗中的开展日益广泛，越爱越多的研究发现特定基因的体细胞突变可能影响肿瘤免疫功能或对免疫治疗的响应，即提示特定体细胞突变可能是潜在的免疫治疗预测因子。编码DNA聚合酶的POLE基因参与DNA核苷酸和碱基切除修复途径，目前研究已证实POLE基因突变作为多癌种免疫治疗生存获益的生物标志物，研究者通过分析MSK-IMPACT接受免疫治疗实体瘤患者发现，POLE/POLD1突变的患者中位OS显著优于未携带者(34个月vs.18个月)。26％的POLE/POLD1基因突变的患者合并了MSI-H(微卫星高度不稳定)，去除这部分患者后突变组OS仍然获益(28个月vs.16个月)。即使通常认为无法获益于免疫治疗的微卫星稳定MSS(Microsatellite stable，MSS)患者，仍然可以通过POLE/POLD1基因突变来判断是否能获益于免疫治疗。最后，多因素分析证实POLE/POLD1突变可作为预测免疫治疗获益的全新独立指标。除此之外，相关研究还表明ARID1、ALRP1B、MUC16、PRKDC以及NFE2L2等基因突变为ICI免疫治疗疗效较好的正向预测因子；而EGFR、ALK、CDKN2A及KEAP1等基因突变则与ICI免疫治疗不良预后有关。但是，以上这些基因突变作为生物标志物依然不能覆盖所有潜在免疫治疗获益人群，本领域仍然需要更高效、更准确地鉴定适用于免疫检查点抑制剂治疗肺癌患者的方法和工具。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是寻求一种能够有效预测NSCLC患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性方法，为达到该目的，本申请特提出以下技术方案：

本发明提供一种FLT3基因突变的检测剂在制备用于预测或筛查NSCLC患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用；优选的，所述FLT3突变的存在是所述NSCLC患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征。

本发明还提供一种FLT3突变检测剂在制备用于预测或筛查NSCLC患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒中的应用；优选的，所述FLT3突变的存在是高肿瘤突变负荷的指征。

在一些方面，所述试剂盒还包括其他基因突变的检测剂。

在一些方面，所述免疫检查点抑制剂为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。

在一些方面，所述突变为点突变；优选的，所述点突变包括但不限于单核苷酸多态性，碱基取代/插入/缺失，或沉默突变。

在一些方面，所述检测剂于核酸水平进行检测；优选的，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。

在一些方面，所述检测剂于蛋白水平进行检测；优选的，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。

在一些方面，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。

在一些方面，所述样品选自所述NSCLC患者的血液、血清、血浆、胸水、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。

本发明还提供一种预测或筛查NSCLC患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性方法，其特征在于，所述方法包括使用检测剂检测FLT3基因突变的存在与否。

本发明还提供一种预测或筛查NSCLC患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于FLT3突变检测的试剂；优选的，还包括其他基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：FGFR4、POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、FGFR4、MUC16或NOTCH1-4之一或多个。

一种用于预测、评估或筛查非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于FLT3突变检测的试剂；优选的，还包括其他基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：FGFR4、POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、FGFR4、MUC16或NOTCH1-4之一或多个。

本申请有益的技术效果：

1、患者的免疫检查点抑制剂治疗仅使用PD-L1表达、TMB等作为适合治疗的生物标志物。然而，并不是所有的PD-L1高表达或TMB-H的患者对免疫治疗都有反应，本发明筛选出FLT3基因突变作为预测NSCLC患者中对ICI敏感的群体的生物标志物；在本发明通过FLT3基因突变，能够准确预测NSCLC患者中TMB高低，进而预测ICI敏感的群体，避免盲目用药，提高ICI治疗的经济性能。

2、本发明中采用的FLT3基因突变在实际应用中可以作为预测风险因素，提高检测效率，结果更为可靠。

3、本发明方法有利于简化检测内容，降低患者检测成本，加快检测报告出具时间，适于推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中FLT3基因突变患者(MT)与野生型患者(WT)肿瘤突变负荷(TMB)的比较；

图2为本发明一个实施例中FLT3基因突变患者(MT)与野生型患者(WT)PD-L1表达的比较；

图3为本发明一个实施例中FLT3基因突变位点分析图；

图4为本发明一个实施例中NSCLC FLT3基因突变患者(MT)与野生型患者(WT)接受使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的疗效比较；

图5为本发明一个实施例中FLT3基因突变患者(MUT)与野生型患者(WT)接受使用免疫检查点抑制剂后持续获益人群比例的比较；

图6为本发明一个实施例中Cox多因素回归分析与使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法疗效相关的独立风险因素。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

以下基本术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。

本文所使用的术语“互补”涉及核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及FLT3基因突变的检测剂在制备用于预测或筛查非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用，优选的，FLT3基因突变的存在是所述非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征。

本发明还涉及FLT3基因突变的检测剂在制备用于预测或筛查非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒中的应用，其中FLT3基因突变的存在是高肿瘤突变负荷的指征。

本发明的FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3，FMS样的酪氨酸激酶3)属于III型受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase III,RTK III)家族成员，近年来，许多大样本研究已经证实FLT3的激活突变在AML的发生及疾病的进展中起到十分重要的病理作用。FLT3的基因突变均能引起FLT3发生自动磷酸化进而导致FLT3发生配体非依赖性的组成性激活，进一步激活其下游异常的信号转导，从而起到促进增殖和抑制凋亡的作用，使得具有此突变表型的白血病患者临床预后较差。

在一些实施方式中，FLT3基因种属为哺乳动物；优选的，为灵长类动物。在一些优选的实施方式中，所述FLT3基因种属为人；Gene ID:54894NM_017763.6。

可以理解的是，本发明提供一种预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的新标记物：FLT3基因突变。经过临床研究证实，其在非小细胞肺癌患者中有基因突变与无基因突变患者TMB的程度发生统计学差异。且FLT3突变的患者接受免疫治疗后预后明显好于FLT3野生型患者。

如本文所用，术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。

本发明所述免疫检查点包括但不限于程序性死亡受体1(PD-1)、PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)；也包括一些新发现的免疫检查点例如淋巴细胞活化基因3(LAG3)、T-细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(TIM-3)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7/9等。在一些实施方式中，本发明的免疫检查点抑制剂优选为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。所述PD-1抑制剂进一步可以选择为Nivolumab(Opdivo；BMS-936558)、Pembrolizumab(Keytruda；MK-3475)、lambrolizumab(MK-3475)、Pidilizumab(CT-011)、特瑞普利单抗(JS001)、信迪利单抗(IBI308)、卡瑞利珠单抗(艾瑞卡)以及替雷利珠单抗(百泽安)中的一种或多种。所述PD-L1抑制剂进一步可以选择为Atezolizumab(Tecentriq；MPDL3280A)、JS003、Durvalumab(Imfinzi)、Avelumab(Bavencio)、BMS-936559、MEDI4736以及MSB0010718C中的一种或多种。

术语“突变负荷”、“突变负荷(Mutation burden)”和“突变负荷(Mutationalburden)”在本文中可互换使用。在肿瘤的背景下，突变负荷在本文中又称为“肿瘤突变负荷”、“肿瘤突变负荷”或“TMB”。

在本发明中，点突变可以是单核苷酸多态性(SNP)、碱基取代，碱基插入或碱基缺失，或沉默突变(例如，同义突变)。

评估FLT3基因突变包括确定其编码区是否存在突变，例如移码突变。

在一些实施方案中，所述突变位于FLT3基因的67-3048位核苷酸。在一些优选实施方式中，评估FLT3基因突变包括确定其编码区是否存在使FLT3蛋白截短的突变。

在一些实施方式中，在确定FLT3基因编码区存在使FLT3蛋白截短的突变后，评估FLT3基因表达，例如FLT3基因的蛋白表达水平。

在一些实施方式中，所述非小细胞肺癌患者的病理类型包括肺腺癌及肺鳞癌。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括其它基因突变的检测剂；优选的，所述基因包括但不限于：FGFR4、POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、FGFR4、MUC16或NOTCH1-4之一或多个。。

鉴于FLT3基因为一种能够编码蛋白质的基因，因而其基因的突变通常也会表现在转录水平和反应水平上，本领域技术人员可以从RNA和蛋白水平对其突变进行检测以间接反映其是否发生基因突变，这些都可以应用于本发明。

在一些实施方式中，所述检测剂于核酸水平进行检测。

核酸水平(DNA或RNA水平)的检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该DNA或RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等。并且本领域技术人员也容易想到将mRNA反转录成cDNA后对cDNA进行检测，这些技术手段的常规置换不超出本发明的保护范围。

在一些实施方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：

聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。在一些实施方式中，所述聚合酶链反应选自限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、Taqman探针法、竞争性等位基因特异性PCR和等位基因特异性PCR。

在一些实施方式中，所述生物质谱法选自飞行质谱仪检测，例如Massarray检测。

在一些实施方式中，所述核酸测序法选自Snapshot法。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。在本发明另外一些实施方案中，所述核酸测序法是高通量测序，也称作二代测序(“NGS”)。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。NGS是对传统Sanger测序技术革命性的变革，可以一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定。可用本发明的NGS的测序平台是商用可得的，包括但不限于Roche/454FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer和Applied Biosystems SOLID system等。转录组测序也可以通过二代测序平台快速、全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。在本发明另外一些实施方案中，所述核酸测序法可以为单分子实时测序，单分子DNA测序技术是近10年发展起来的新一代测序技术,也称为第三代测序技术,包括单分子实时测序、真正单分子测序、单分子纳米孔测序等技术。

在一些实施方式中，所述检测剂于蛋白水平进行检测。

在一些实施方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测的方法进一步可以为免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫组化、ELISA以及Western Blot等。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂；进一步地，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。

在一些实施方式中，所述样品选自所述非小细胞肺癌患者的血液、血清、血浆、胸水、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。

在一些实施方式中，所述组织为非小细胞肺癌癌组织或癌旁组织。其中，优选的检测样品为血液、血清、血浆；更优选的，来自外周血。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测或筛查非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法，所述方法包括：使用如上所述的检测剂检测FLT3基因突变的存在与否。在一些实施方式中，所述方法用于非小细胞肺癌患者在进行免疫检查点抑制剂疗法后的预后评估。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测、评估或筛查非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性试剂盒，所述试剂盒中包含用于FLT3基因突变检测的试剂；在一些优选的实施方式中，还包括其他基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：FGFR4、POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、FGFR4、MUC16或NOTCH1-4之一或多个。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测、评估或筛查非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于FLT3基因突变检测的试剂；在一些优选的实施方式中，还包括其它基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：FGFR4、POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、FGFR4、MUC16或NOTCH1-4之一或多个。

下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

本发明具体采用如下方法学进行研究

样本材料：试验样本来自中国非小细胞肺癌患者的FFPE肿瘤样品和配对的外周全血对照样品(所有患者均提供书面知情同意书)。研究通过靶向捕获NGS测序分析，具体涉及包含551个癌症相关基因的组合。

试验方法：

1)本发明使用成品商业化试剂盒，对肿瘤细胞占比在20％以上的FFPE切片及全血样本的DNA进行提取，提取后的核酸经过Qubit定量及Aglient 2100分析合格后进入文库构建。

具体的：本发明文库构建使用探针杂交捕获方法，所用建库及杂交捕获试剂为商业化试剂，探针为定制。提取质控合格的核酸经酶切法打断至200～300bp左右，后经过末端修复、接头连接，使用AMPure Beads对接头连接产物进行纯化，纯化后的产物进行PCR扩增后构建形成可用于杂交的预文库，使用定制探针与质控合格的预文库进行杂交，捕获目的片段形成终文库。终文库先使用Qubit4.0进行初步定量，随后使用Agilent4200TapeStation对文库的insert size进行检测，文库浓度及片段均符合预期后按照要求进行上机测序。

库检合格后，把不同文库按照目标下机数据量的需求pooling后使用IlluminaNovaseq 6000进行PE150bp的测序。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

本发明靶向测序551个基因，检测区间超过2.25Mbp。其中530个基因覆盖全外显子(编码区域1.41Mb)。可检测SNV、InDel、CNV、Fusion、MSI、TMB，可为患者提供靶向、化疗、免疫治疗及遗传风险等相关的检测结果。

2)基因组改变分析

本发明检测基因组改变的内容，包括单碱基替换(SNV)、短片段插入缺失(Indel)，基因拷贝数变异(CNV)，和基因重排和融合。使用bwa-mem(version0.7.17)将原始测序序列与人类基因组参考序列(hg19)进行比对。以测序样本的配对白细胞DNA作为对照，去除胚系变异，获得样本体细胞变异。

通过以下标准判断所鉴别的突变是否为真：

对于点突变与短片段插入缺失：该点突变所在位置的有效测序覆盖深度>200；包含该突变的每条测序序列质量值>40,序列上支持该突变的每个碱基的碱基质量值>20；该点突变通过Fisher精确检验判定为体细胞突变；所有支持该突变的序列条数≥6条；支持该突变的每个碱基距离与其所在序列片段末段最短距离的平均值≤8；该突变通过Fisher精确检验或Z检验可显著区别于由健康人样本构建的背景突变集中该位点的背景突变。

TMB计算：本发明中，TMB的定义为所检测编码区域范围内每百万碱基中所含SNV和Indel体细胞突变的个数，其中1)同义突变，2)AF<2％的突变，3)Cosmic公共数据库记录次数>100,4)NMPA/FDA明确批准用药靶点，NCCN指南推荐用药位点；以上4类位点不纳入TMB计算

免疫组化：使用免疫组织化学的方法进行PD-L1表达的检测。对于镜下观察肿瘤细胞大于100个的蜡块或切片进入免疫组化检测流程，白片经过烤片清洗的预处理后分别使用Dako Link 48(单克隆抗体22C3和28-8)染色仪对切片进行染色，染色结束后进行清洗封片后镜下观察结果。

公共数据库队列数据获取：为了进一步验证FLT3基因突变对于免疫检查点抑制剂治疗的临床预测作用及影响免疫治疗的潜在机制，本发明在肿瘤基因组学数据库cBioPortal网站(http://www.cbioportal.org/)中下载了纳入MSKCC 350例接收免疫治疗队列非小细胞肺癌患者数，包括患者临床基线资料、免疫检查点抑制剂治疗疗效评估数据以及患者基因组数据。

实施例1非小细胞肺癌患者特征表征

本发明将总共2300例非小细胞肺癌患者纳入该研究。病人的特征如表1所示。诊断时的中位年龄为63岁。2066例患者具有明确病理类型信息，肺腺癌和肺鳞癌患者分别为1816(79.0％)以及250(10.9％)例。对2300例患者进行TMB检测。整体人群的TMB中位数为2.94mut/Mb(IQR，0.74-5.88)。TMB≥10muts/Mb的肿瘤占12.3％。本实施例发现年龄与TMB呈正相关(p<0.001)。另外，肺鳞癌患者组(p＜0.001)的TMB值较高。

表1.非小细胞肺癌患者特征

实施例2FLT3基因突变在中国NSCLC人群中的发生频率以及和免疫治疗生物标志物PD-L1、TMB之间的相关性

对2300例非小细胞肺癌患进行FLT3基因突变统计分析发现，2300例非小细胞肺癌患者中有45例患者携带FLT3基因突变，占1.96％。FLT3突变与野生型两组患者的年龄没有显著性差异(表2)。FLT3突变患者的TMB显著高于FLT3野生型患者(中位TMB：10.3vs.2.84mut/Mb，p＜＝0.001(图1)。在2300例NSCLC患者中有927例患者肿瘤组织接受过PD-L1免疫组化检测，其中PD-L1阴性(PD-L1 TPS评分＜＝1％患者为20.8％，PD-L1弱阳性(PD-L1TPS评分＝1％～25％)和强阳性PD-L1表达(PD-L1 TPS评分≥25％)分别为14.2％和5.26％。FLT3突变患者的PD-L1阳性表达率(PD-L1 TPS≥1％)与FLT3野生型患者无显著相关性(30.3％vs.41.1％，p＝0.1905)(图2)。

表2.NSCLC患者FLT3突变与临床病理特征之间的相关性

实施例3FLT3基因突变位点分析

进一步对FLT3基因突变位点进行分析，发现FLT3基因变异形式主要为错义突变，其次为无义突变，而且主要位点为Y166*，E204*以及S883*；移码突变的位点为R849Vfs*4。不过整体而言，基因变异位点比较分散，没有明显的热点突变区域(图3)。

实施例4FLT3突变对ICI治疗的预测价值的临床数据验证

通过下载公共数据库队列信息进行外部验证。在cBioPortal网站(http://www.cbioportal.org/)下载了Rizvi等人上传的1662泛癌患者队列数据，Rizvi队列纳入了350例接受抗PD-(L)1单药治疗或抗PD-(L)1+抗CTLA-4联合治疗方案的非小细胞肺癌患者，具体患者基线资料可参考文献(Samstein RM,Lee CH,Shoushtari AN,et al.Tumormutational load predicts survival after immunotherapy across multiple cancertypes.Nat Genet 2019；51:202-6.)。接受免疫治疗非小细胞肺癌队列中，FLT3突变患者有9例(2.8％)，FLT3突变的患者接受免疫治疗后的中位PFS较FLT3野生型患者长(中位OS：未达到vs.10.2个月，P＝0.034)(图4)。进一步分析FLT3突变患者接受免疫治疗的持续获益人群(持续获益超过12个月)比例高于FLT3野生型患者(77.8％vs.44.2％，p＝0.04286)(图5)，这些都说明FLT3突变能够预测非小细胞肺癌患者的免疫治疗疗效。

Cox多因素分析结果进一步说明FLT3基因突变是免疫治疗预后的独立预测风险因素(FLT3 MT vs.FLT3 WT,HR:0 24,95％CI:0.06-0.96,p＝0.0432)(图6)。

可见，FLT3基因突变可作为预测非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷程度以及非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法潜在预测因子。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。