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新型减毒的病毒株及其用作疫苗的用途

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本发明涉及源自人间质肺病毒(metapneumovirus)株的减毒的病毒株，其包含序列SEQ ID NO：1所示的基因组序列，所述减毒株包含所述序列SEQ ID NO：1的一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减弱所述株的毒力。

著录项

公开/公告号CN112888456A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-06-01

原文格式PDF
申请/专利权人里昂第一大学;国家科学研究中心;里昂高等师范学院;国家健康科学研究所;拉瓦尔大学;
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申请/专利号CN201980062098.4
发明设计人 M·罗莎-卡拉特拉瓦;G·博文;J·迪布瓦;M·A·皮佐诺;O·特利尔;M-E·海梅林;M-H·卡瓦纳;
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申请日2019-07-12
分类号A61K39/12(20060101);A61K39/155(20060101);C12N7/04(20060101);C12N15/86(20060101);
代理机构11314 北京戈程知识产权代理有限公司;
代理人程伟;韩文华
地址法国维勒班
入库时间 2023-06-19 11:11:32

说明书

技术领域

本发明涉及来自新型人间质肺病毒(metapneumovirus)株的遗传修饰的病毒株。

本发明涉及毒力减弱的这些修饰株，其用于预防或治疗肺炎病毒科(Pneumoviridae)的病毒引起的感染的用途，以及包含所述修饰病毒株的疫苗组合物。

背景技术

下呼吸道的急性感染是全球范围内发病率和死亡率的主要原因之一。特别是在5岁以下的儿童中，根据所评估的国家，他们的死亡率高达15％以上，因此依据世界卫生组织，是第二大死亡原因。

大多数下呼吸道的急性感染与多种病理相关(从简单的感冒，到严重的肺炎)，主要是由病毒引起的，例如属于以下科的病毒：

(i)正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒(主要包括流感病毒)；

(ii)副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒；

(iii)腺病毒科(Adenoviridae)的病毒；

(iv)小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的病毒；

(v)冠状病毒科(Coronaviridae)的病毒；和

(vi)肺炎病毒科(Pneumoviridae)的病毒，主要包括人呼吸道合胞病毒和人间质肺病毒。

人呼吸道合胞病毒(hRSV)和人间质肺病毒(hMPV)是引起呼吸道急性感染(例如细支气管炎、支气管炎或肺炎)的病毒。它们主要影响处于危险中的人群，即5岁以下的幼儿、老年人和免疫抑制的人。

hRSV是1岁以下婴儿的细支气管炎和肺炎的主要病因，在6个月以下的婴儿中发病率增加。在成人中，hRSV的感染很少且是良性的，老年受试者除外。传播基本上是通过呼吸途径进行的，病毒在呼吸道中复制。

于1957年分离出hRSV。它是一种具有负极性的单链RNA病毒，呈“包膜”型，带有螺旋对称的衣壳。它属于肺炎病毒科(Pneumoviridae)正肺病毒属(Orthopneumovirus)。

在婴儿的细支气管炎和肺炎中普遍存在hMPV，尤其严重影响1至3岁的儿童。

儿童感染hMPV的主要症状包括流鼻涕、咳嗽、呼吸窘迫或发烧。hMPV也可能引起上呼吸道的感染，并可能与耳部感染相关，而很少发生非呼吸道症状(例如腹泻、呕吐和出现红斑)。hMPV优先靶向人呼吸树的纤毛细胞。

hMPV感染可导致宿主生物的肺部发生组织病理学改变，尤其会产生以下生理影响：

-呼吸道上皮水平的损伤；

-产生过多黏液，以及

-急性炎症，特别是在间质性肺组织水平的急性炎症，这与促炎细胞因子和趋化因子的大量分泌有关。

在成人的呼吸道病理中，已在5％至10％呼吸道急性感染的成人或老年人中发现了hMPV，并在3％至5％慢性肺部疾病加重或社区获得的肺炎的成人中发现了hMPV。

于2001年在荷兰首次分离并描述hMPV(van den Hoogen等人，2001)。次年，在位于北美的患者中分离出了几株hMPV(Peret等人，2002)。hMPV是具有负单链RNA的病毒，属于肺炎病毒科(Pneumoviridae)间质肺病毒属(Metapneumovirus)。

因hMPV感染并发症而住院的儿童平均年龄为6到12个月，即晚于hRSV引起的主要发生在0到3个月之间的儿童平均年龄。但是，hMPV的流行病学与hRSV的流行病学有很多共同点：

-它遍及各大洲；

-其年度分布主要在冬季和春季，与hRSV重叠；

-其传播也可能通过唾液飞沫发生。

尽管正在进行积极的研究，但当今市场上尚无有效且特异性地针对hRSV和hMPV病毒感染的预防或治疗方法(Mazur等人，2018)。

对于治疗，在严重的hMPV或hRSV感染病例中，偶尔可以使用利巴韦林(不排除不良影响)或静脉内免疫球蛋白(非常昂贵)。当前正在开发其他类型的治疗方法，例如使用融合抑制剂肽、硫酸化糖胺聚糖、干扰RNA和某些免疫调节剂。

如今，通常被广泛使用的临床方法在于：尤其在治疗感染症状的同时，将患者置于呼吸辅助下(提供氧气或机械通气)，并给他们施用支气管扩张剂、皮质类固醇和/或抗生素，以预防或治疗细菌性超级感染。

关于疫苗接种，尤其受到hMPV影响的人群是婴儿、幼儿和老年人，重要的是要有快速安全有效的疫苗，以减少严重的呼吸道发作，这对于这些年龄段都是具有重大影响的。

因此，针对hRSV和hMPV开发疫苗不仅体现了重大的健康挑战，而且还是一个现实的社会经济问题，其目标是降低与这些感染相关的治疗和住院高成本，并在细菌超级感染的情况下减少对抗生素的使用，从而限制了耐药性的出现。

现有技术

下表1、表2和表3列出了正在开发中的不同方法，用于从野生的hMPV株中获得减毒的活疫苗。

与野生型(WT)病毒相比，当病毒株显示出降低的复制能力，和/或当这些病毒株所致的感染爆发的形成更为受到限制时，则病毒株被认为是体外减毒的，尤其是合胞体(病毒感染后，和相邻的细胞发生融合)。在体内，与野生病毒株相比，减毒的病毒株以更低的最大载量进行复制和/或诱发的病理更轻(就体重减轻、或炎症情况、或组织病理学损害而言)。

表1.已开发或正在开发中的，在具有一个或多个突变的hMPV病毒株基础上而进行减毒的候选活疫苗的清单

术语“Vero”表示非洲绿猴肾细胞系，广泛用于细胞培养以测试各种病毒。

术语“LLC-MK2”表示源自恒河猴肾细胞的细胞系，其用于测试各种病毒的感染。

符号√表示所使用的细胞容易受到病毒感染。

体内研究模型使用以下缩写：M表示小鼠；H表示仓鼠；CR表示棉鼠；CM表示食蟹猕猴；AGM表示非洲绿猴；Ch表示黑猩猩；Rh表示猕猴；SCID表示重症联合免疫缺陷。

表2.已开发或正在开发中的候选减毒活疫苗的清单，其中所述疫苗包含至少一个基因完全缺失的hMPV病毒株

Δ：基因的全部缺失。

测试的所有减毒的病毒株均源自A2亚组的野生株CAN97-83。

表3.基于嵌合hMPV株，已开发或正在开发中的候选减毒活疫苗的清单

使用以下缩写：TM＝跨膜结构域；PIV＝副流感病毒；SeV＝仙台病毒。

国际申请WO 2005/014626涉及几种hMPV株，以下列名称命名：CAN 97-83、CAN 98-75和HMPV 00-1。该申请描述了一种重组hMPV株，命名为CAN 97-83，其经过遗传修饰以减弱其毒力。提出的修饰特别涉及编码G和/或SH蛋白的基因的全部缺失。修饰的病毒株可用于人的治疗，以预防或治疗肺炎病毒的感染。向仓鼠施用野生株或这些减毒株使得可以保护它们免受后来的CAN 97-83hMPV感染。但是，WO 2005/014626没有提及完全的保护特征，特别是没有对所治疗的动物进行体重监测。表2中引用的科学文章中描述了相同的实验结果。

接下来，采用相同的减毒株在猴动物模型上获得了体内的结果；缺失SH、G和M2-2基因的重组病毒株继续在猴的呼吸道中复制；并且像CAN97-83野生病毒株一样，进一步诱导中和性抗体的产生。

其他分离的hMPV株已在专利US 8,841,433中描述，还提出了其在制备疫苗中的用途。

基于使用减毒活病毒株的疫苗具有许多优势。

一方面，由减毒活病毒生产的疫苗的优点在于：可诱导产生对病毒的强烈免疫应答，而这种病毒的繁殖能力已大大降低，因此有可能在模仿自然感染的同时避免发生病理。在开发这些减毒株的过程中，重要的是在减毒和免疫原性之间找到理想平衡。

另一方面，这些疫苗可以通过鼻内途径施用，并因此模拟野生病毒的天然进入途径，从而诱导的免疫应答非常类似于对感染的生理反应。

此外，这种疫苗接种策略不会像失活疫苗那样产生过度的炎症反应。最后，通常不需要添加佐剂。

因此，这是预防风险人群(如幼儿和婴儿)的最佳疫苗接种策略。

发明内容

本发明的主题是源自人间质肺病毒特定临床株rC-85473的减毒的病毒株，其包含由序列SEQ ID NO：1所示的基因组序列，所述减毒株包含所述序列SEQ ID NO：1中的一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减弱了所述株的毒力。

根据本发明的减毒的病毒株，具体是通过失活或缺失编码G和SH辅助蛋白之一的至少一个基因而修饰的重组株，以产生分别命名为ΔG rC-85473和ΔSH rC-85473的重组病毒。

更具体地，本发明的主题是源自人间质肺病毒临床株的减毒的病毒株，其包含由序列SEQ ID NO：1所示的基因组序列，所述减毒株包含至少一个选自以下的遗传修饰：辅助G蛋白编码基因的失活和辅助SH蛋白编码基因的失活。

在体外(LLC-MK2细胞系)和离体(重构的人呼吸道上皮，培养于气液界面)细胞模型上针对感染性和病毒复制，以及在hMPV鼠感染模型中针对病毒的发病机理及其疫苗保护性质方面，进行了这些株的表征。

实验部分所示的结果突出显示，与那些以类似方式修饰的病毒株相比(也缺失G或SH基因，但源自hMPV的另一临床株(CAN98-75))，ΔG rC-85473和ΔSH rC-85473这些病毒株具有特定的属性。

病毒ΔG或ΔSH rC-85473尤其具有：

(i)鼠模型中具有减毒的病毒特征，这不同于重组病毒ΔSH CAN98-75，重组病毒ΔSH CAN98-75这部分具有很强的毒性；

(ii)同时保留其在结合细胞系统(参考系LLC-MK2)和悬浮液中的复制能力，不同于重组病毒CAN98-75，重组病毒CAN98-75的生产力要低得多；

(iii)病毒ΔG或ΔSH C-85473有利地具有显著的保护特征：被感染小鼠的存活率为100％，体重减轻很少，诱导了针对同源病毒株(C-85473，血清型A)的中和性抗体应答，并且针对至少一种异源株(CAN98-75，血清型B)的中和性抗体应答，以及降低感染动物的肺部发病机理，与之相比，野生hMPV(株rC-85473)的感染性挑战，在未经免疫的对照组导致了50％的致死率。

这种减毒的病毒株可以在体内、离体和体外用作至少一个外源基因的表达载体，具体是编码病毒抗原的基因，其中病毒抗原源自人呼吸道合胞病毒(hRSV)，尤其是其F融合蛋白。

本发明还涉及该减毒的病毒株，其用作药物的用途，更具体地，用于预防和/或治疗肺炎病毒科的病毒感染。

最后，本发明还涉及一种疫苗组合物，其在药学上可接受的载体中包含至少一种如上所定义的减毒的病毒株，以及任选地佐剂。

附图说明

图1.从临床株C-85473和CAN98-75产生的重组hMPV。

[图1A]由临床株C-85473通过反向遗传学产生的重组病毒基因组的示意图，并已在其3'末端克隆了GFP(绿色荧光蛋白)编码序列。病毒rC-85473包含野生株C-85473的基因组，该基因组还表达GFP基因。重组病毒的基因组源自株C-85473，并缺失SH(ΔSH-rC-85473)或G(ΔG-rC-85473)基因，如下所示。遗传修饰的病毒具有功能性和复制性，如LLC-MK2细胞的图像所示，LLC-MK2细胞感染有感染复数(MOI)为0.01的这些病毒，并在感染后三天通过荧光显微镜观察。

[图1B]由临床株CAN98-75通过反向遗传学产生的重组病毒基因组的示意图，其中已克隆了GFP(绿色荧光蛋白)编码序列。病毒rCAN98-75包含野生株CAN98-75的基因组，在其3'末端另外表达GFP基因。重组病毒的基因组源自株CAN98-75，并缺失SH(ΔSH-rCAN98-75)或G(ΔG-rCAN98-75)基因，如下所示。遗传修饰的病毒具有功能性和复制性，如LLC-MK2细胞的图像所示，LLC-MK2细胞感染有MOI为0.01的这些病毒，并在感染后三天通过荧光显微镜观察。

图2.病毒株rC-85473和rCAN98-75及其衍生株的体外复制能力。

[图2A]重组病毒rCAN98-75(黑圈)、ΔSH-rCAN98-75(黑方形)和ΔG-rCAN98-75(黑三角形)以0.01的感染复数(MOI)感染LLC-MK2细胞后，在连续7天每天收集的细胞上清液中，以TCID50/ml评估病毒载量。

[图2B]重组病毒rC-85473(黑圈)、ΔSH-rC-85473(黑方形)和ΔG-rC-85473(黑三角形)以0.01的感染复数感染LLC-MK2细胞后，在连续7天每天收集的细胞上清液中，以TCID50/ml评估病毒载量。

**p<0.01，和***p<0.001(双因素ANOVA统计学检验)。

图3：通过感染BALB/c小鼠，重组hMPV(rCAN98-75和rC-85473)的体内特征：体重曲线和感染后5天的肺病毒载量。

[图3A]经鼻内滴注OptiMem培养介质(“模拟”阴性对照，黑三角形)、或2.5×10

[图3B]感染后5天，每组5只小鼠(阴性对照组除外)进行安乐死，以测量TCID50/肺克数的肺部感染性病毒载量。

[图3C]经鼻内滴注OptiMem培养介质(“模拟”阴性对照，黑色菱形)、或5×10

[图3D]感染后5天，每组5只小鼠(阴性对照组除外)进行安乐死，以测量TCID50/肺克数的肺部感染性病毒载量。

统计学检验：双因素ANOVA检验，将每种病毒与“模拟”条件进行比较。*p＜0.05，**p＜0.01，和***p＜0.001。

图4：重组hMPVΔG-rC-85473和ΔSH-rC-85473在BALB/c鼠感染性攻击模型中的体内保护特征。

[图4A]免疫方案图(上)，接着是感染性攻击方案(下)。致死剂量相当于1×10

[图4B]对用病毒株rC-85473(黑圈)、ΔSH-rC-85473(灰方形)或ΔG-rC-85473(灰三角形)免疫的小鼠、或未经免疫的(“模拟”，黑三角形)小鼠，进行感染性攻击。

免疫后21天，通过鼻内滴注致死剂量(1×10

[图4C]免疫小鼠的不同组中小鼠的攻击后存活曲线。

“模拟”未经免疫的小鼠仅存活50％；经重组病毒rC-85473、ΔSH-rC-85473或ΔG-rC-85473免疫的小鼠存活率为100％。

[图4D]感染性攻击后5天(即在免疫后的第26天)，每组4只小鼠进行安乐死以测量其TCID50/g肺的肺部感染病毒载量。“nd”表示不可检测。

[图4E]感染性攻击后5天(即在免疫后的第26天)，每组4只小鼠进行安乐死以通过RTqPCR(N基因)测量其肺部感染病毒载量。

统计学检验：双因素ANOVA检验，将每种病毒与模拟条件进行比较。*p＜0.05，**p＜0.01，和***p＜0.001。

图5：重组病毒rC-85473和rCAN98-75及其缺失形式的体外细胞结合能力。

[图5A]被感染的LLC-MK2细胞的百分比，作为与病毒rCAN98-75(圈)及其减毒形式ΔSH-rCAN98-75(方形)和ΔG-rCAN98-75(三角形)的结合时间的函数。

[图5B]被感染的LLC-MK2细胞的百分比，作为与病毒rC-85473(圈)及其减毒形式ΔSH-rC-85473(方形)和ΔG-rC-85473(三角形)的结合时间的函数。

图6：重组病毒rC-85473和rCAN98-75在重构的人呼吸道上皮3D模型上在气液界面培养时的离体复制能力。

[图6A]培养中的人呼吸道上皮模型感染有重组病毒rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75(上排图片)或重组病毒rC-85473(白色)、ΔSH-rC-85473(深灰)和ΔG-rC-85473(不可确定)(下排图片)。

[图6B]在被重组病毒rCAN98-75(WT，白色)、ΔSH-rCAN98-75(深灰)和ΔG-rCAN98-75(浅灰)(虚线左侧)或重组病毒rC-85473(WT)、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473(虚线右侧)感染的上皮顶表面上，测量的病毒后代的定量(通过病毒基因组的定量)。

[图6C]定量上皮中存在的病毒基因组，所述上皮感染有重组病毒rCAN98-75(WT，白色)、ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75(虚线左侧)或重组病毒rC-85473(WT，白色)、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473(虚线右侧)。

图7.在重构的人呼吸道上皮3D模型上感染重组病毒rC-85473后，并在气液界面进行培养时，诱导的细胞因子和趋化因子的分泌。

重构人呼吸道上皮(

[图7A]趋化因子MCP-1、IP-10、RANTES、IL-8、吸引G-CSF的T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞。

[图7B]定量促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α。

[图7C]定量细胞因子IL-7，刺激T和B淋巴细胞的分化。

[图7D]生长因子FGF，其参与组织修复。

统计学检验：单因素ANOVA分析，将病毒ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473与病毒rC-85473进行比较。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

图8.在由重组hMPV rC-85473感染的永生化鼠巨噬细胞模型中，病毒诱导的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的体外分泌。

[图8A]用重组病毒rC-85473(黑色)、ΔSH-rC-85473(深灰)或ΔG-rC-85473(浅灰)以0.1的MOI感染永生化鼠巨噬细胞系(源自野生小鼠骨髓的BMDM系)后2天，在每天收集的细胞上清液中，以FFU/ml为单位评估病毒载量。

[图8B]与未感染的“模拟”永生化鼠巨噬细胞(白色)相比，用重组病毒rC-85473(黑色)、ΔSH-rC-85473(深灰)或ΔG-rC-85473(浅灰)以0.1的MOI感染永生化鼠巨噬细胞后2天，从每天收集的细胞上清液中，通过ELISA试验评估的促炎细胞因子TNF-α的量。

[图8C]与未感染的“模拟”永生化鼠巨噬细胞(白色)相比，用重组病毒rC-85473(黑色)、ΔSH-rC-85473(深灰)或ΔG-rC-85473(浅灰)以0.1的MOI感染永生化鼠巨噬细胞后2天，从每天收集的细胞上清液中，通过ELISA试验评估的促炎细胞因子IL-1β的量。

统计学检验：双因素ANOVA分析，将病毒ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473与病毒rC-85473进行比较。*p<0.05和**p<0.01。

图9.重组hMPV rC-85473、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473感染BALB/c小鼠后5天，在体内感染位点的肺部炎症和免疫细胞募集(ΔG-rC-85473特有的肺部炎症)。

[图9A]根据BALB/c小鼠肺的支气管/支气管内、支气管周、血管周、间质、胸膜和肺泡内组织的炎症强度评估，来计算累计的肺组织病理学评分，所述小鼠感染有病毒rC-85473(黑色)、ΔSH-rC-85473(深灰)、ΔG-rC-85473(浅灰)或“模拟”未经感染，在感染病毒后5天收集所述组织并用甲醛固定。

[图9B]感染后5天，从感染病毒rC-85473和ΔSH-rC-85473的BALB/c小鼠肺的裂解物中，通过免疫标记(抗CD45、抗CD11b、抗CD170、抗Ly6C、抗Ly6G、抗CD11c、抗CD115、抗B220、抗CD3ε、抗CD4、抗CD8a)进行流式细胞术，确定免疫细胞的表型。募集的免疫细胞分为四类：CD8+T淋巴细胞(CD8+T细胞)、CD4+T淋巴细胞(CD4+T细胞)、单核细胞/巨噬细胞、和嗜中性粒细胞。

统计学检验：单因素ANOVA分析，将病毒ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473与病毒rC-85473进行比较。**p<0.01和***p<0.001。

图10.在感染性攻击后，在由重组hMPVΔG-C-85473和ΔSH-C-85473免疫的BALB/c鼠模型中表征了体内的次级免疫应答。

如图4A所示，在受到病毒WT rC-85473感染性攻击后1天和/或5天，通过Luminex技术(BioPlex Pro试剂盒分析法，BioRad)从肺裂解物中测量了几种细胞因子和趋化因子的量[图10A-图10C]；通过免疫标记(抗CD45、抗Ly6G、抗CD11b、抗CD170/Siglec-F、抗Ly6C、抗CD11c、抗F4/80、抗B220、抗CD3ε、抗CD4和抗CD8a)进行流式细胞术，从肺裂解物中确定浸润肺组织的免疫细胞的表型[图10D-图10F]；并且，根据甲醛固定的鼠肺的支气管/支气管内、支气管周、血管周、间质、胸膜和肺泡内组织的炎症强度评估，来计算累计的肺组织病理学评分[图10G]。

在图10A至图10G中表示：

-黑色，已被病毒rC-85473免疫的BALB/c小鼠组；

-深灰，已被病毒ΔSH-C-85473免疫的组；

-浅灰，已被病毒ΔG-C-85473免疫的组；

-以及(如有的话)，白色表示所谓的“模拟”未经免疫的组。

N＝2或3只小鼠/组，分别用于细胞因子的组织病理学或分泌/细胞募集分析。

统计学检验：双因素ANOVA分析以彼此比较各组，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

[图10A]在感染性攻击1天和5天后，定量促炎细胞因子IL-6和IFN-γ。

[图10B]在感染性攻击1天和5天后，定量抗炎细胞因子IL-10。

[图10C]在感染性攻击1天和5天后，定量吸引的趋化因子G-CSF、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β，并刺激免疫细胞的活化和分化。

[图10D]在感染性攻击1天和5天后，定量浸润BALB/c小鼠肺组织的CD8+和CD4+T淋巴细胞。

[图10E]在感染性攻击1天和5天后，定量浸润BALB/c小鼠肺组织的B淋巴细胞。

[图10F]在感染性攻击1天和5天后，定量浸润BALB/c小鼠肺组织的巨噬细胞和嗜中性粒细胞。

[图10G]在感染性攻击5天后，累计的肺组织病理学评分。

具体实施方式

人间质肺病毒(hMPV)病毒株

在2001年，hMPV被鉴定为肺炎病毒科的组成部分。

hMPV的基因组结构类似于hRSV。它细分为编码N、P、M、F、M2(M2-1和M2-2)、SH、G和L蛋白的几个ORF(开放阅读框)。图1A和图1B中表示了病毒rC-8543和rCAN98-75的一般基因组结构。

肺炎病毒科的病毒成员在其表面表达三种被称为F、G和SH蛋白的糖蛋白。

F融合糖蛋白在不同的hMPV亚组之间高度保守，其参与病毒向靶细胞的渗透以及合胞体的形成，所述合胞体，即在被病毒感染后源自单个细胞融合的大的多核细胞。F糖蛋白也被认为是病毒hRSV和hMPV的主要抗原，从而可以诱导中和性抗体的产生。

G蛋白是II型膜蛋白，其C末端在细胞外。该蛋白对于病毒成分的组装以及在体外复制不是必需的。对于hRSV，已经表明缺失编码该蛋白的基因减弱了小鼠呼吸道感染过程中株的毒力。

SH蛋白也是II型膜蛋白，其在病毒周期中的功能仍是未知的。在hRSV的情况下，缺失编码SH蛋白的基因产生能够在体外繁殖的重组病毒，并且其毒力在小鼠的上呼吸道中减弱，但在所述呼吸道的下部并没有减弱。

对hMPV临床株的遗传分析，主要根据表面结合(G)和融合(F)糖蛋白的序列可变性，使得能够定义两个主要组(血清型A和B)和四个“次要”亚组(A1、A2、B1和B2)。接下来表明，这些组可以再次细分为亚系，如A2a和A2b(Huck等人，2006)。

在广泛研究的病毒株中，可以列举出属于血清型A1的NL00-1株；属于血清型A2的CAN97-83株；以及属于血清型B2的CAN98-75株。

本发明基于从加拿大患者样品中分离出的人间质肺病毒的病毒株，命名为rC-85473，具体是在文章中提及(Hamelin等人，2010)。

曾提出，将这种株的F蛋白联合M蛋白用作疫苗接种策略(Aerts等人，2015a)。

在文章(Palwithino等人，2015)中，描述通过福尔马林处理而失活的该病毒株rC-85473，作为失活的活疫苗株的用途。还对rC-85473株的热失活形式进行了测试(Hamelin等人，2007)。

最近，根据其F蛋白的蛋白序列，对该株的强融合能力进行了详细研究(Dubois等人，2017)。

在GenBank中引用株rC-85473的F基因和M基因的序列，其登录号分别为KM408076.1和KM408077.1。

本文首次公开了该病毒株rC-85473的完整基因组序列，其包含13394个核苷酸：在所附的序列表中参考SEQ ID NO：1所示。

下表4显示了该株rC-85473与人间质肺病毒的其他三种病毒株的同一性百分比：CAN 97-83、CAN 98-75和NL 00-1。

表4–病毒rC-85473与其他hMPV之间每个ORF的核苷酸序列同一性百分比(括号中表示氨基酸序列的同一性)

关于用NL00-1株观察到的高序列同源性，可以得出结论：该株rC-85473是A1亚组的成员。

株rC-85473的特点是：具有显著的融合能力，使其能够以高频率/高感染度渗透到靶细胞中。该株的显著的融合能力使其有可能产生特别长的合胞体。合胞体是巨大的多核细胞。病毒rC-85473在体外具有很高的诱导细胞融合的能力，导致形成由许多细胞核组成的非常长的合胞体。

现已表明，F蛋白中HRA功能结构域的5个氨基酸(在其他已知的hMPV株中是特有的)是造成这种超融合表型的部分原因(Aerts等人，2015b；Dubois等人，2017)。

根据本发明的优选实施方案，源自株rC-85473的减毒的病毒株F蛋白的肽序列包含HRA功能结构域的这5个氨基酸，例如在(Dubois等人，2017)中所述。

根据本发明的优选实施方案，源自株rC-85473的减毒的病毒株F蛋白的肽序列未被修饰，因此与株rC-85473的F蛋白的肽序列相同，如(Dubois等人，2017)中所述。

反向遗传学技术

反向遗传学技术能够从核酸序列(DNA或RNA)以及从合适的宿主细胞中，产生有功能的带衣壳的病毒。

因此，人间质肺病毒的重组株rC-85473获自命名为C-85473的临床株(从患者中分离得到的)。

2004年描述了第一个应用于hMPV的反向遗传系统(Biachesi等人，2004)。文章(Aerts等人，2015b)中也描述了该技术。

该技术的原理是，基于使用仓鼠肾细胞系(BHK-21)进行修饰以使其组成型表达T7噬菌体的RNA聚合酶(BHK-T7或BSR-T7/5细胞)，能够产生重组hMPV。

基因组元件分布在五个质粒元件中：一个编码hMPV反基因组的质粒、和四个“卫星”质粒，它们编码转录机制的病毒蛋白(L、P、N和M2-1)。

在这些细胞中，将反基因组质粒hMPV和四个“卫星”质粒共转染后，对应于病毒基因组链的RNA链(负RNA链)被T7聚合酶从其启动子开始转录。

转染的宿主细胞还表达参与hMPV病毒转录的四种蛋白质，从而构成了一种活性RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)复合体。因此，这种功能性病毒聚合酶将基因组RNA转录为病毒mRNA，然后通过基质链的转录将其复制到病毒基因组RNA的新分子中。

因此，病毒蛋白与基因组RNA的翻译和组装，可以使感染性hMPV颗粒从转染的BHK-T7细胞的质膜中出芽。接下来，由于在共培养物中添加了LLC-MK2细胞(ATCC CCL-7)，因此能够进行重组病毒的扩增，以允许感染。

因此，由于这些修饰的细胞是可商购的，因此可以从特定病毒株的基因组序列产生重组病毒。

源自株rC-85473的减毒的病毒株

本发明涉及一种源自人间质肺病毒株的减毒的病毒株，其包含序列SEQ ID NO：1所示的基因组序列，所述减毒株包含所述序列SEQ ID NO：1的一个或多个遗传修饰，从而减弱所述株的毒力。

在本申请中，术语“病毒”和“病毒株”被不加区别地用于表示具体的病毒株，例如先前所鉴定的。

在本发明的意义上，“衍生株”是指通过将遗传修饰引入所谓的“原始株”病毒株的基因组中而获得的重组病毒株。原始株有利地是野生株，例如临床分离株。

全部引入原始株的遗传修饰的目的在于减弱所述原始株的毒力，而不是改变其基因组的特征。

具体地，这些遗传修饰仅涉及编码对于病毒复制非必需的蛋白的基因，换句话说是编码“辅助蛋白”的基因，例如SH和G蛋白。在该遗传修饰的减毒株中，原始株rC-85473的F蛋白肽序列没有被修饰，因此具有与原始株相同的肽序列。

病毒株的毒力对应于病毒在给定生物体中繁殖的速度，因此对应于其侵入率。因此，“减弱毒力”是指降低病毒在生物体中的侵入率。

这种减毒可以采取以下形式：病毒株的复制能力降低，和/或其感染靶细胞的能力降低，和/或生物体中病毒感染引起的病理学降低。

因此，在本发明的意义上，“减毒的病毒株”是指重组病毒，其毒力与原始病毒株相比降低，也就是说比原始病毒株的毒力要小。

为了测量病毒株的毒力，可以进行体外、离体或体内测试，例如体外复制能力测试(通过TCID50/ml滴定或定量PCR进行测量)、通过显微镜观察来监测体外和离体细胞病变作用的演变、或在体内感染模型中监测病理的临床体征、肺组织病理观察和肺病毒载量的测量。

为了比较野生株和减毒株的生理作用，还可以在病毒宿主生物中测量/确定在肺和/或其他免疫系统水平上改变的不同生理参数。

如本申请的实施例7、实施例8和实施例9所述，可以评估以下病毒诱导的作用，以比较减毒的病毒株彼此之间、或减毒的病毒株与野生病毒株之间的生理作用：

-促炎细胞因子的分泌(通过上皮细胞和/或巨噬细胞)；

-趋化因子的分泌；

-生长因子的分泌；

-肺部炎症的水平(通过评估组织的炎症强度来计算评分)；以及

-在体内感染部位募集的免疫细胞表型。

这些不同的测量使得可以更精确地了解每种病毒株的生理作用，并根据这些特征进行选择最适合于开发减毒的活病毒疫苗的那些。

将遗传修饰引入病毒株以获得其减毒形式

本发明涉及一种源自包含序列SEQ ID NO：1所示的基因组序列的人间质肺病毒株的减毒的病毒株，所述减毒株包含所述序列SEQ ID NO：1的一个或多个遗传修饰，从而减弱所述株的毒力。

“减弱所述株的毒力的遗传修饰”是指对于编码病毒复制非必需蛋白的基因的遗传修饰，这是本领域技术人员众所周知的。在这些蛋白中，如上所述的G和SH蛋白是众所周知的。

换句话说，本申请涉及源自包含序列SEQ ID NO：1所示的基因组序列的人间质肺病毒株的减毒的病毒株，所述减毒株已被遗传修饰以减弱其毒力，也就是说引入的基因突变已被独特地引入到编码病毒复制非必需蛋白的基因中。

能够减弱病毒株毒力的各种遗传修饰是本领域技术人员已知的。可将这些修饰引入原始株rC-85473的基因组中。

在本发明的意义上，遗传修饰是指对原始核苷酸序列的所有修饰，例如一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的添加、以及一个或多个核苷酸的取代。这些修饰具体地包括能够改变遗传阅读框、或将终止密码子引入编码序列的中间、或缺失一个或多个编码序列的全部或部分的所有修饰。

在旨在减弱病毒株毒力的遗传修饰中，众所周知遗传修饰可以使一个或多个基因失活、或者甚至缺失一个或多个基因，其中所述基因编码对于病毒在培养物中复制非必需的蛋白。

例如，通过失活(具体是通过缺失)编码SH、G和M2-2辅助蛋白的基因，获得了人间质肺病毒的减毒的病毒株。

但是，取决于减毒株所来源的原始病毒株的特征，减毒的病毒株的功能特征可能会非常不同，该株的毒力取决于原始基因组和所进行的遗传修饰。

根据本发明的第一方面，根据本发明的减毒的病毒株的特征在于：序列SEQ IDNO：1的修饰包括编码SH蛋白的基因的失活。

更具体地，根据本发明的减毒的病毒株的特征在于：使所述株毒力减弱的序列SEQID NO：1的遗传修饰在于使编码SH蛋白的基因失活。

在本发明的意义上，基因的失活表示这样的事实：该基因被修饰，使得该基因的产物不再表达或以非活性形式表达、以如此少的量表达而不存在该蛋白的活性。可以通过本领域技术人员众所周知的所有技术来进行基因的失活。

具体地，可通过将点突变引入基因、通过部分或全部缺失基因的编码序列、或通过修饰基因启动子，来获得基因的失活。将根据本领域技术人员熟知的任何一种分子生物学技术进行这些不同的遗传修饰。

在本发明的意义上，“基因的缺失”是指从病毒株的基因组中去除该基因编码序列的重要部分，尤其是：

-当涉及部分缺失时，所述编码序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％；

-当涉及完全缺失时，所述编码序列的100％。

根据一个优选的实施方案，在根据本发明的减毒的病毒株中，编码SH蛋白的基因被完全缺失，也就是说从原始序列SEQ ID NO：1中去除SH蛋白的所有编码序列(的100％)。

具体地，所述病毒株包含核苷酸序列，例如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。更具体地，所述病毒株的序列由例如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成。

如实施例所示，此减毒株称为ΔSH-rC-85473，具有以下特征：

-在体外，在培养细胞中的感染和复制是正常的(与原始株的特征无差异)；

-在体内，这种重组病毒ΔSH-rC-85473对小鼠的感染仅引起很少的体重减轻，这不同于原始株的感染；被感染小鼠的存活率为100％，但这种减毒的病毒在肺组织中复制；

-在体内，事先用这种减毒株免疫小鼠，可100％保护受致死剂量野生病毒rC-85473攻击的小鼠。攻击后第5天，在肺中未检测到感染性病毒rC-85473，也表明了这种保护；这种保护还表示为在感染性攻击后D+21，在血清中，针对同源病毒株(C-85473，血清型A)以及针对至少一种异源株(CAN98-75，血清型B)的高的微-中和载量；

-在体外，与病毒ΔSH-rCAN98-75的能力相比(约40％的感染细胞)，减毒病毒ΔSH-rC-85473与培养中LLC-MK2细胞的结合能力和感染细胞的能力更好(约60％的感染细胞)；

-离体地，这种减毒株对呼吸道上皮模型的感染会诱导细胞因子和趋化因子的分泌，其量等于或少于野生株诱导的量；但是与野生株诱导的相比，炎症应答减少了(图7A、图7B)；

-在体外，这种减毒株感染巨噬细胞会诱导促炎细胞因子的分泌，但其动力学与野生株所诱导的动力学不同(图8B、图8C)；

-在体内，这种减毒株感染后，病毒诱导的肺组织炎症明显低于野生株(图9A)；但是，仍然可以确保免疫细胞的募集(图9B)。

根据本发明的第二方面，根据本发明的减毒的病毒株，其特征在于序列SEQ IDNO：1的修饰包括使编码G蛋白的基因失活。

更具体地，根据本发明的减毒的病毒株，其特征在于使所述株毒力减弱的序列SEQID NO：1的遗传修饰在于使编码G蛋白的基因失活。

根据一个优选的实施方案，在根据本发明的减毒的病毒株中，编码G蛋白的基因被完全缺失，也就是说从原始序列SEQ ID NO：1中去除G蛋白的所有编码序列(的100％)。

具体地，所述病毒株包含核苷酸序列，例如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。更具体地，所述病毒株的序列由例如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成。

如实施例所示，此减毒株称为ΔG-rC-85473，具有以下特征：

-在体外，在LLC-MK2细胞模型中，在培养细胞中的感染和复制是正常的(与原始株的特征无差异)；

-在体内，这种重组病毒ΔG-rC-85473对小鼠的感染仅引起很少的体重减轻；被感染小鼠的存活率为100％；但这种病毒在肺组织中复制；

-在体内，事先用这种减毒株免疫小鼠，可100％保护受致死剂量野生病毒rC-85473攻击的小鼠。攻击后D+5天，在肺中未检测到感染性病毒和野生基因组rC-85473，也表明了这种保护；这种保护还表示为在感染性攻击后D+21，在血清中，针对同源病毒株(C-85473，血清型A)以及针对至少一种异源株(CAN98-75，血清型B)的高的微-中和载量；

-在体外，与病毒ΔG-rCAN98-75的能力相比(20％以下的感染细胞)，减毒病毒ΔG-rC-85473与培养中LLC-MK2细胞的结合能力和感染细胞的能力更好(约60％的感染细胞)。

-离体地，这种减毒株对呼吸道上皮模型的感染会诱导细胞因子和趋化因子的分泌，其量显著低于野生株诱导的量(图7)；

-在体外，这种减毒株对巨噬细胞的感染诱导TNF-α的分泌，与野生株的病毒诱导分泌的方式相同；但仅非常轻微地诱导IL-1β的分泌(图8B，图8C)；

-在体内，这种减毒株感染后，病毒诱导的肺组织炎症明显低于野生株或低于减毒株ΔSH-rC-85473(图9A)。

根据本发明的第三方面，根据本发明的减毒的病毒株，其特征在于，序列SEQ IDNO：1的修饰包括使编码G蛋白和SH蛋白的两个基因失活。

更具体地，根据本发明的减毒的病毒株，其特征在于使所述株毒力减弱的序列SEQID NO：1的遗传修饰在于使两个基因失活，一个编码SH蛋白，而另一个编码G蛋白。

根据一个具体的实施方案，两个基因的失活对应于编码G和SH蛋白的一个、或另一个、或两个基因的完全缺失。

另外，可以理解的是，可以减弱株rC-85437毒力的任何其他遗传修饰可以被引入到序列SEQ ID NO：1所示的所述株的基因组中。

将外源基因引入病毒株rC-85473的基因组中

根据本发明的一个方面，可以通过引入至少一个外源基因来遗传修饰根据本发明的减毒的病毒株的核苷酸序列。

因此，根据本发明的减毒的病毒株具有包含至少一个外源基因的基因组序列。具体地，该外源基因可以是编码病毒抗原的基因。

在本发明的意义上，“病毒抗原”被理解为是指由病毒表达的蛋白元件或另一性质的元件，个体的免疫系统将其识别为外来的，并且通过产生特异性抗体和/或刺激细胞免疫应答，引起所述个体的应答。

具体地，病毒抗原可以选自：至少一种流感病毒表达的抗原、或至少一种肺炎病毒科的病毒(例如hRSV)表达的抗原、或至少一种副粘病毒科的病毒(例如副流感病毒)表达的抗原。

更具体地，所述病毒抗原可以选自：hRSV的全部或部分F蛋白，以及流感病毒或副流感病毒的全部或部分血凝素。

这种减毒的病毒株在向患者施用期间将能够产生针对表达的病毒抗原和针对hMPV的多重免疫应答。

这样的株在单次施用后能够获得针对几种病毒的组合免疫应答，是非常有利的。

另外，包含至少一个外源基因的这种减毒的病毒株可以在体内、离体或体外用作人间质肺病毒的靶细胞中至少一个外源基因的表达载体。

“人间质肺病毒的靶细胞”是指易于被该病毒感染的个体的呼吸道上皮细胞。该表述还意指使所述病毒能够在体外复制的所有细胞系。

减毒的病毒株作为药物的用途

本发明还涉及如上所定义的减毒的病毒株，其用作药物的用途。

实际上，该株尤其可以用于治疗或预防病毒感染。

术语“治疗”表示在人或动物生物体中抵抗病毒感染的事实。由于施用了至少一种根据本发明的组合物，生物体中的病毒感染水平(感染载量)将降低，并且优选病毒将从生物体中完全消失。术语“治疗”还表示减轻与病毒感染有关的症状(呼吸综合征、肾衰竭、发烧等)的事实。

在本发明的意义上，术语“预防”表示避免(或至少降低)人或动物生物体中发生感染的风险的事实。由于施用了至少一种根据本发明的减毒的病毒株，所述生物体的人细胞或动物细胞变得不太容易被感染，因此被最好地处于不被所述病毒感染的情况。

更具体地说，本发明涉及一种减毒的病毒株，例如上述所定义的，其用于预防和/或治疗由肺炎病毒科的病毒感染的用途。

应当理解，该减毒的病毒株将优选整合在包含药学上可接受载体的疫苗组合物中，所述载体适于悬浮所述株并适于对其进行施用。

所述疫苗组合物包含至少一种根据本发明的减毒的病毒株，使得可以以特定方式刺激人或动物生物体的免疫系统。

因此，该疫苗组合物包含至少一种减毒的活病毒株，其发挥抗原的作用，即在生物体中诱导特异性免疫应答的化合物，所述免疫应答将保留其记忆。

这样的疫苗组合物可以用作预防性疫苗，也就是说旨在在病原性病毒感染生物体之前刺激特异性免疫应答。

这样的疫苗组合物也可以用作治疗性疫苗，也就是说旨在与所述病原性病毒感染生物体的同时刺激特异性免疫应答。

本发明还涉及一种在人中预防和/或治疗肺炎病毒科感染的方法，该方法包括向易于被这种病毒感染的个体施用至少一种如前所述的减毒的病毒株。

本发明还涉及一种在人中预防和/或治疗肺炎病毒科感染的方法，该方法包括向易于被这种病毒感染的个体施用至少一种如前所述包含至少一种减毒的病毒株的疫苗组合物。

根据本发明的一个具体实施方案，所述感染是人间质肺病毒的感染。

根据本发明的另一个具体实施方案，所述感染是正肺病毒科的感染，例如人呼吸道合胞病毒(hRSV)。

本发明还涉及一种减毒的病毒株，其序列包含至少一个编码病毒抗原的外源基因，其用于预防和/或治疗表达至少一种病毒抗原的病毒感染，所述病毒抗原被所述减毒的病毒株表达。

根据一个具体的实施方案，根据本发明的减毒的病毒株，其包含作为外源性病毒抗原的hRSV的F蛋白，其可以用于预防和/或治疗hRSV的感染。

根据另一个具体的实施方案，根据本发明的减毒的病毒株包括作为外源性病毒抗原的流感病毒的血凝素，可以用于预防和/或治疗流感病毒的感染。

包含至少一种减毒的病毒株的药物组合物

本发明还涉及一种疫苗组合物，其在药学上可接受的载体中包含至少一种根据本发明的减毒的病毒株，以及任选地佐剂。

根据本发明，术语“药学上可接受的载体”是指载体或赋形剂，即在此考虑对感染没有特异性作用的化合物。这些载体或赋形剂是药学上可接受的，这表明它们可以被施用于个体或动物而没有明显的有害作用风险或抑制性的不期望作用。

应当理解，根据本发明的疫苗组合物包含至少一种有效量的减毒的病毒株。在本发明的意义上，“有效量”是指在其所施用的生物体中足以触发免疫反应的减毒的病毒株的量。

根据本发明使用的疫苗组合物适合于口服、舌下、吸入、皮下、肌内或静脉内施用。

根据本发明的具体实施方案，根据本发明的疫苗组合物特征在于其为旨在通过吸入施用的药物形式。

吸入表示被呼吸道吸收。具体地，这是一种用于吸收治疗目的化合物、吸收气体、悬浮剂中的微滴或粉末形式的某些物质的方法。

通过吸入(即通过鼻和/或颊通道)施用药物组合物或兽医组合物是本领域技术人员众所周知的。

吸入施用分为两种：

-当组合物为粉末形式时，通过吹入法施用，和

-当组合物为气雾剂(悬浮剂)形式或溶液形式(例如加压水溶液)时，通过雾化施用。然后将推荐使用雾化器或喷雾剂来施用药物组合物或兽医组合物。

因此，此处考虑的药物形式有利地选自：粉末、滴的水性悬浮剂或加压溶液。

要接种疫苗的个体人群主要是儿科人群，也就是说由小于18岁的个体(更具体而言是小于5岁的幼儿和婴儿)组成。实际上，肺炎病毒科的病毒主要感染这些个体，与更年长的个体相比，这些个体倾向于具有较弱的免疫力。

本发明还涉及如上所述的疫苗组合物，其用于预防和/或治疗肺炎病毒科病毒感染的用途。

实施例

实施例1：由临床株C-85473和CAN98-75.1A产生的重组hMPV

制备图1A和图1B所示的基因构建体，以便可以通过GFP(绿色荧光蛋白)的表达而检测到病毒，并将旨在减弱其毒力的遗传修饰引入到重组的参考株rC-85473和rCAN98-75中：

-缺失编码SH蛋白的基因(ΔSH)；

-缺失编码G蛋白的基因(ΔG)。

这些基因构建体的完整序列示于SEQ ID NO：4(GFP rC-85473)、SEQ ID NO：5(GFPΔSH-rC-85473)、SEQ ID NO：6(GFPΔG-rC-85473)和SEQ ID NO：8(GFP rCAN98-75)。源自rCAN98-75的病毒株的序列以及与GFP偶联的序列未示出，但是本领域技术人员基于所示的其他遗传构建体可获得这些序列。

被0.01感染复数(MOI)感染的LLC-MK2细胞照片显示，由于GFP，病毒可见，产生了以下重组病毒：ΔSH-rCAN98-75、ΔG-rCAN98-75、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473是功能性的且可复制的。感染后三天通过荧光显微镜观察细胞。

这些照片表明，重组病毒rCAN98-75似乎比重组病毒rC-85473的感染性更弱和复制性更弱：荧光强度更低，合胞体区的尺寸更小。

实施例2：重组病毒rC-85473和rCAN98-75的体外复制能力

LLC-MK2细胞分别被下列重组病毒感染，感染复数为0.01：

-rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75(图2A)；

-rC-85473、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473(图2B)。

每天收集细胞上清液，一式三份，共7天，然后以TCID50/ml评估其病毒载量。进行双因素ANOVA统计学检验，以比较每种缺失的重组病毒(ΔSH和ΔG)与野生重组病毒。

图2A和图2B显示了获得的结果：对于减毒的重组病毒，复制能力和生产能力因原始株CAN98-75或C-85473的性质而异。

重组病毒rC-85473、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473具有比病毒rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75更好的复制能力和生产能力。病毒ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75效率最低，而病毒ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473在LLC-MK2细胞上培养时具有最佳生产能力。

下表列出了病毒储液的平均载量，所述病毒储液是针对每种重组病毒rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75(表5)和rC-85473、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473(表6)生产且浓缩的。

病毒载量以“TCID50”单位计数，其代表最终的病毒稀释度，在该稀释度时50％的细胞组织因感染被破坏，或显示出明显的细胞病变作用(50％的组织培养物感染剂量)。

表5

表6

这些病毒载量证实了前述结果，即源自C-85437的减毒的病毒株具有令人满意的复制能力，与原始株的复制能力相比没有减弱。

实施例3：重组hMPV rCAN98-75和rC-85473在BALB/c小鼠病毒感染模型中的体内表征

经鼻内滴注感染BALB/c小鼠：

-OptiMem培养介质(模拟)或

-2.5×10

-5×10

使用的两种病毒剂量是相同的(野生病毒在感染后对小鼠产生相同的作用)。

每天监测小鼠的体重和存活率，持续14天(10只小鼠的平均体重±SEM)。

另外，在感染后5天，每组5只小鼠进行安乐死，以测量以TCID50计的肺部感染病毒载量。

进行统计学检验(双因素ANOVA)，以比较每种病毒与模拟条件。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

图3A和图3B显示了用病毒rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75获得的结果；图3C和图3D显示了用病毒rC-85473、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473获得的结果。

这些结果表明重组病毒ΔSH-rC-85473或ΔG-rC-85473仅引起很少的体重减轻；实际上，这些组小鼠的行为与未感染组的小鼠类似。

此外，肺病毒载量(图3D)与在病毒rC-85473感染组中观察到的相似，表明缺失的减毒病毒在肺中复制。

结果与重组病毒ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75不同：病毒ΔSH-rCAN98-75引起很显著的体重减轻(图3A)；而病毒ΔG-rCAN98-75仅引起非常轻微的体重减轻(图3A)，这是由于其在肺中的复制能力低(图3B)。

实施例4：野生病毒rC-85473感染性攻击后，重组hMPVΔG-rC-85473和ΔSH-rC-85473在BALB/c鼠模型中的体内保护性特征

免疫和感染性攻击方案如图4A所示。

通过鼻内滴注OptiMem培养介质(“模拟”阴性对照)或5×10

免疫后21天，通过鼻内滴注致死剂量(1×10

每天监测小鼠的体重和存活率，持续14天(10只小鼠的平均体重±SEM，图4B)。

攻击后14天，对不同组的小鼠，每天监测小鼠的存活率(模拟组的存活率为50％，通过重组病毒rC-85473、ΔSH-rC-85473或ΔG-rC-85473进行免疫，存活率表现为100％)。结果显示在图4C中。

感染性攻击后5天(即在免疫后第26天)，每组4只小鼠进行安乐死以测量以TCID50计(图4D)和RTqPCR(N基因，图4E)的肺部感染病毒载量。

统计学检验：双因素ANOVA，将每种病毒与模拟条件进行比较。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

这些结果证实重组病毒ΔSH-rC-85473或ΔG-rC-85473仅引起极少的体重减轻(小鼠组的行为类似于未感染组的小鼠)，并且在这些实验条件下，可以100％保护致死剂量野生病毒rC-85473攻击的小鼠。在预先用重组病毒ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473免疫的小鼠中，在攻击后D+5时在肺中未检测到感染性病毒和野生基因组rC-85473(nd)，攻击后D+21时血清中高的微-中和载量(>160)，也证明了这种保护作用。

下面的表7显示了在D+20(感染性攻击前1天)和D+42(感染性攻击后21天)从不同组小鼠所取血清中进行的微-中和测试结果。

在56℃失活30分钟并稀释血清后，将它们与100TCID50(即100个感染性单位，比如按TCDI50/ml确定的)的病毒rC-85473或病毒rCAN98-75在37℃下一起孵育2小时。然后，将该混合物施加于LLC-MK2细胞，以确定中和载量。

中和性抗体的载量取决于血清的最大稀释度，在该稀释度时与血清+病毒混合物一起孵育的LLC-MK2细胞不显示出细胞病变作用，也就是说被认为对感染呈阴性(根据一式两份进行的测试)。

表7.微-中和测试

图代表所测试血清的稀释度，在该稀释度时特异性抗体载量可有效中和病毒感染(微-中和载量)。

结果5或10代表初次免疫应答(初次接触病毒)。大于或等于160的结果是最大免疫应答的特征，表示该生物先前已经接触过病毒，因此已被免疫。

用减毒株预先免疫后，源自原始株rC-85473的病毒株能够实现针对hMPV C-85473(血清型A)和至少针对病毒CAN98-75(血清型B)令人满意的中和性体液应答。

实施例5：重组病毒rC-85473和rCAN98-75的体外细胞结合能力

用以下感染LLC-MK2细胞(t＝0)：

-病毒rCAN98-75及其减毒形式ΔSH-rCAN98-75和ΔG-rCAN98-75(图5A)；

-病毒rC-85473及其减毒形式ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473(图5B)；

为了改变病毒与细胞的结合时间，将细胞在冰上感染0.5、1、2或3小时，然后洗涤，然后在37℃下孵育24小时。

感染后24小时测得的感染细胞百分比代表能够在指定时间内(0.5、1、2或3h)与细胞结合的病毒数量。

结果表明，根据重组病毒基因组CAN98-75或C-85473的来源不同，重组病毒在培养物中与LLC-MK2细胞结合的能力(因此其感染能力)不同。

结果表明，与病毒ΔSH-rCAN98-75(40％)和ΔG-rCAN98-75(少于20％的受感染细胞)相比，减毒的病毒ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473(约60％的感染细胞)具有更好的细胞结合和细胞感染能力。

实施例6：重组病毒rC-85473和rCAN98-75在重构的人呼吸道上皮3D模型中并在气液界面培养时的离体复制能力

根据供应商Epithelix的说明，将重构的人呼吸道上皮(

图6A中显示的照片表明，相较于重组病毒rC-85473，重组病毒rCAN98-75的感染性和复制性均较低(荧光强度更低，以及感染部位的尺寸更小)。

上皮中病毒基因组的定量结果(图6C)证实重组病毒rC-85473、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473以及重组病毒rCAN98-75和ΔSH-rCAN98-75的复制能力，这区别于复制能力极弱的病毒ΔG-rCAN98-75。

上皮顶端表面上病毒基因组的定量结果(图6B)表明重组病毒rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75、ΔG-rCAN98-75，rC-85473和ΔSH-rC-85473的生产。

另一方面，未检测到病毒ΔG-rC-85473的基因组，表明没有病毒后代产生。一个假设是，在这种复杂的多层次离体系统中，病毒ΔG-rC-85473可能已经失去了在感染细胞的表面出芽的能力。

这些差异可能具有进一步支持我们发明的创造性特征的性质，重点在于针对hMPV病毒株而言，不同来源的重组病毒之间的不同特征，以保护我们的减毒活疫苗候选者ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473。

实施例7：在重构的人呼吸道上皮3D模型上，在气液界面上培养时，重组病毒rC-85473感染诱导的细胞因子和趋化因子的分泌

根据供应商Epithelix的说明，将重构的人呼吸道上皮(

在感染上皮的基础介质中对所选择的分泌的细胞因子和趋化因子的定量，反映了诱导的细胞应答，该应答随着所评估的重组病毒rC-85473的不同而有所不同(图7)。

a)相较于野生株rC-85473，病毒ΔG-rC-85473诱导的不同测试细胞因子和趋化因子的分泌量显著低得多，但促炎细胞因子TNF-α除外。这些结果与图6中所示的结果一致，图6表明与野生株的感染性相比，该病毒在重构人呼吸道上皮中的感染性显著降低。

b)尽管病毒ΔSH-rC-85473在重构人呼吸道上皮模型中的感染和复制能力比野生重组病毒rC-85473的能力有所提高(图6)，然而，相较于野生病毒的病毒所诱导的，评估的其所诱导的细胞因子和趋化因子谱的分泌量却相同或更少。

分泌的趋化因子MCP-1、IP-10、RANTES、IL-8、G-CSF和促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平，似乎表明受此病毒ΔSH-rC-85473感染的上皮细胞能够募集T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜中性粒细胞免疫细胞，这些免疫细胞是宿主进行固有免疫应答和适应性应答所必需的。

此外，病毒ΔSH-rC-85473导致IL-7(一种细胞因子，可诱导非活性淋巴细胞分化为活性T和B淋巴细胞)和FGF(一种参与机体组织修复的生长因子)的分泌，分泌的量与野生病毒rC-85473类似。

因此，病毒ΔSH-rC-85473的感染使得上皮细胞能够对感染进行初次防御应答，然而与野生病毒诱导的炎症应答相比，与宿主的炎症应答更为降低有关。

因此，这些差异将有利于使用源自株rC-85473的重组病毒作为减毒的活疫苗，并且优选来自减毒株ΔSH-rC-85473的重组病毒。

实施例8：重组hMPV rC-85473在永生化鼠巨噬细胞模型上的体外病毒复制和促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌

使用永生化小鼠巨噬细胞系评估重组病毒rC-85473、ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473的复制和对促炎细胞因子诱导的能力。

巨噬细胞构成了在感染部位(在本案例中，为呼吸道上皮)募集的免疫系统第一批细胞的一部分。巨噬细胞有助于炎症应答、固有应答和刺激宿主的适应性应答。

巨噬细胞被重组病毒rC-85473、ΔSH-rC-85473或ΔG-rC-85473感染，每天收集其细胞上清液，共2天。结果如图8所示。

a)以FFU/ml为单位测量的病毒载量表明，与野生重组病毒相比，病毒ΔSH-rC-85473在巨噬细胞上的复制能力降低，而病毒ΔG-rC-85473显示与野生病毒相似的病毒复制(图8A)。进行双因素ANOVA统计学检验用以比较缺失的病毒ΔSH-rC-85473与野生重组病毒的复制动力学。

b)然后，在感染的巨噬细胞的上清液中测量促炎细胞因子TNF-α(图8B)和IL-1β(图8C)的分泌。

病毒ΔSH-rC-85473产生的细胞因子谱与野生病毒rC-85473的谱显著不同，与野生病毒相比，其在感染后1天更早地出现分泌峰，而野生病毒在感染后两天出现涉及这两种细胞因子的分泌峰。

病毒ΔG-rC-85473以与野生病毒相当的水平诱导细胞因子TNF-α的分泌，但在感染的前两天不诱导细胞因子IL-1β的分泌。

这些结果表明，尽管动力学有所改变，但病毒ΔSH-rC-85473仍保留了感染鼠巨噬细胞的能力，尤其是导致促炎细胞因子分泌的能力。

如在重构人呼吸道上皮模型中所观察到的，病毒ΔG-rC-85473可有效感染鼠巨噬细胞，但诱导的促炎细胞因子的分泌更弱。

实施例9：重组hMPV rC-85473、ΔG-rC-85473和ΔSH-rC-85473感染BALB/c小鼠5天后，在体内诱导的感染部位肺部炎症和免疫细胞的募集

经鼻内滴注感染BALB/c小鼠：

-OptiMem(模拟)培养介质；

-5×10

在感染5天后，每组5只小鼠进行安乐死，并对其肺进行组织病理学分析，并测量感染引起的炎症评分(图9A)。

进行统计学检验(双因素ANOVA)以彼此比较每种情况：*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

图9A显示野生病毒rC-85473在感染的小鼠中引起强烈的肺部炎症，而病毒ΔSH-rC-85473和ΔG-rC-85473导致的炎症显著低于野生病毒的炎症，此结果与减毒株降低的病理严重程度相符合，这在前述图3中得到了证明。

此外，在感染后5天，每组5只小鼠进行安乐死并取其肺，用于对感染后浸润肺组织的CD4+、CD8+淋巴细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞免疫细胞进行绝对定量(图9B)。

进行统计学检验(单因素ANOVA)以比较条件ΔSH-rC-85473和条件rC-85473：**p<0.01。

图9B表明，在用病毒rC-85473和ΔSH-rC-85473接种5天后，感染部位募集了不同的免疫细胞群(CD4+T、CD8+T、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)；但对于减毒株而言，量更低，尤其是对于CD4+淋巴细胞。

因此，看起来病毒ΔSH-rC-85473导致了肺部炎症的减轻，这与鼠模型中病毒诱导的病理学减弱(图3)以及感染的上皮细胞分泌的细胞因子减少(图7)一致，同时确保在感染部位有效募集不同的免疫细胞。

这些不同的结果(图7至图9)显示了野生重组rC-85473和缺失的病毒之间在感染后生理作用方面的不同特征。

从以下角度的性质来看，减毒株ΔSH-rC-85473对于减毒活疫苗的开发似乎特别有前景：(i)上皮和巨噬细胞对炎性细胞因子和趋化因子的分泌、(ii)体内诱导肺部炎症、和(iii)免疫细胞在体内浸润到被感染的器官。实际上，这种减毒株对宿主的感染既与有效的初次免疫应答(相当于在野生病毒中观察到的免疫应答)有关，也与炎症应答的降低有关。

实施例10：在经重组hMPV rΔG-C-85473和ΔSH-C-85473免疫的BALB/c鼠模型中，在感染性攻击之后，细胞因子/趋化因子的分泌、体内感染部位免疫细胞的募集和肺部炎症

病毒感染后，由于感染的上皮细胞(见图7)和驻留免疫细胞(图8)分泌细胞因子和趋化因子，在感染部位发生了复杂的炎症和免疫应答。首先，固有应答(非特异性)的效应细胞被募集并随后激活，其次适应性应答(特异性)的效应细胞被激活。当预先对感染个体进行免疫或接种时，适应性应答越迅速、越强且越特异性，记忆应答越有效。这就是这种免疫应答的特征，称为继发应答，其描述于本实施例中。

通过鼻内滴注OptiMem培养介质(“模拟”阴性对照)或5×10

免疫后21天，通过鼻内滴注致死剂量(1×10

感染性攻击后1天或5天(即，分别在免疫后第22天或第26天)，每组3只小鼠进行安乐死，以定量肺组织中分泌的所选细胞因子和趋化因子：结果如图10A、图10B和图10C所示。这些结果表明，局部免疫应答的诱导随着用于免疫BALB/c小鼠的重组病毒rC-85473的不同而不同：

-相较于用病毒WT rC-85473免疫的组，用病毒ΔG-C-85473和ΔSH-C-85473免疫的组显示更强的促炎细胞因子IL-6和趋化因子MCP-1分泌，最快于感染性攻击后的1天。

-此外，与用病毒WT和/或病毒ΔG-C-85473免疫的组相比，用病毒ΔSH-C-85473免疫的组还显示出抗炎细胞因子IL-10和趋化因子G-CSF和MIP-1β分泌的显著增加。

5天后，与攻击后第1天测得的水平相比，所有测试的细胞因子/趋化因子均急剧下降，这表明攻击后诱导的对细胞因子和炎症应答的吸收。

这些结果表明，用减毒的病毒ΔG-C-85473(更具体是ΔSH-C-85473)进行免疫，导致局部发生细胞因子应答，这不同于用相应的非减毒病毒WT进行免疫所诱导的细胞因子应答。

为了评估免疫细胞在感染部位的募集情况，测量了浸润肺组织以对抗感染的主要免疫细胞群的数量；结果如图10D、图10E和图10F所示。

因此，感染性攻击后5天，与用病毒WT rC-85473免疫的组相比，以及与用病毒ΔG-C-85473免疫的组相比，用病毒ΔSH-C-85473免疫后T淋巴细胞(CD8+细胞毒性和CD4+辅助细胞)和B淋巴细胞的募集显著增加(尤其对于B淋巴细胞而言显著不同，图10E)。

在所测试的不同病毒之间，募集的巨噬细胞和嗜中性粒细胞的群没有显示出显著差异(图10F)。

用病毒ΔG-C-85473免疫的小鼠组所示的细胞募集谱与病毒WT免疫的组相似，这表明病毒ΔG-C-85473对免疫应答的诱导与野生病毒(WT)一样有效。相反，当预先用病毒ΔSH-C-85473免疫小鼠时，对响应感染性攻击的适应性免疫应答更强，同时保持平衡，而固有应答似乎并未受到影响，这表明病毒ΔSH-C-85473不会诱导更有效的记忆免疫应答。

最后，在攻击后5天，每组2只小鼠进行安乐死，以测量每个免疫组和“模拟”未经免疫组中因攻击所致的肺部炎症评分；结果如图10G所示。

正如使用病毒WT rC-85473的致死接种所预期的那样，该致死接种对应于群体50％的死亡率[见图4C]，模拟免疫组中的累计炎症评分非常高。如前所述，用病毒WT rC-85473或ΔG-C-85473免疫的组中炎症评分彼此具有相当的可比性，并且与模拟免疫组相比其炎症评分也略有下降，即使这些组的小鼠未表现出任何死亡率[图4C]。

图10的结果表明，在感染性攻击后，用病毒ΔSH-C-85473免疫的小鼠发生的炎症应答大大降低，这表明该组小鼠的肺部攻击将减少。同样，在感染过程中肺功能将得以保留。

因此，响应于继发感染，减毒病毒ΔSH-C-85473在数量和质量上更好地在肺部募集免疫细胞，从而有助于限制感染宿主中的生理病理和肺部炎症。宿主的这种更有效的应答也可能反映出针对hMPV病毒的更好的记忆免疫应答。

总之，这种减毒病毒ΔSH-C-85473具有以下特征：

(i)它比其他测试病毒诱导更大量的促炎、抗炎细胞因子和趋化因子；

(ii)在感染部位，能够更强但均衡地募集免疫细胞(CD8+/CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞)，

(iii)同时产生有限的肺部炎症。

参考文献

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<400> 1

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatgtctct 60

tcaagggatt cacctgagtg atctatcata caagcatgct atattaaaag agtctcagta 120

cacaataaaa agagatgtgg gtacaacaac tgcagtgaca ccctcatcat tgcaacaaga 180

aataacgctg ttgtgtggag aaattctgta tgctaaacat gctgattaca aatatgctgc 240

agaaatagga atacaatata ttagcacagc tttaggatca gagagagtgc agcagattct 300

gaggaactca ggcagtgaag tccaagtggt cttaaccaga acgtactctc tggggaaagt 360

taaaaacaat aaaggagaag atttacagat gttagacata cacggggtag agaagagctg 420

ggtagaagag atagacaaag aagcaaggaa aacaatggca accttgctta aggaatcatc 480

aggtaatatc ccacaaaatc agaggccctc agcaccagac acacccataa tcttattatg 540

tgtaggtgca ttaatattta ctaagctagc atcaaccata gaagtgggac tagagaccac 600

agtcagaagg gctaaccgtg tactaagtga tgcactcaag agatacccta gaatggacat 660

cccaaaaatt gccagatcct tctatgactt atttgaacaa aaagtgtatc acagaagttt 720

gttcattgag tatggcaaag cattaggctc atcatctaca ggcagcaaag cagaaagtct 780

atttgttaat atattcatgc aagcttatgg agccggtcaa acaatgctaa ggtggggggt 840

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aacaccaaaa agaaagtttc gtttacacca aatgaaccag gaaaatatac aaagttggaa 1680

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attgttgaag atgaaagcac aagtggagaa tctgaagaag aagaagaacc aaaagacata 2100

caagacaata gtcaagaaga tgacatttac cagttaatta tgtagtttaa taaaaataaa 2160

caatgggaca agtaaaaatg gagtcctacc tagtagacac ttatcaaggc attccttaca 2220

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taacaataac cactctgtat gctgcatcac aaaatggtcc aatactcaaa gtgaatgcat 2400

cagcccaagg tgcagcaatg tctgtacttc ccaaaaaatt tgaagtcaat gcgactgtag 2460

cactcgatga atatagcaaa ttggaatttg acaaactcac agtctgtgaa gtaaaaacag 2520

tttacttaac aaccatgaaa ccatacggga tggtatcaaa atttgtgagc tcagccaaat 2580

cagttggcaa aaaaacacat gatctaatcg cactgtgtga ttttatggat ctagaaaaga 2640

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ctactgttga agctgctata agcagtgaag cagaccaagc tctaacacag gccaaaattg 2760

caccttatgc gggattgatt atgatcatga ctatgaacaa tcccaaaggc atattcaaaa 2820

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taagtaaaat atgcaagact tggagccatc aagggacaag atatgtgttg aagtccagat 2940

aacagccaag caccttggcc aagagctact aactctatct catagattat aaagtcacca 3000

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agaactcaga acagtttctg ctgatcaact ggcaagagag gagcaaattg agaatcccag 3360

acaatctaga tttgttctag gagcaatagc actcggtgtt gcaacagcag ctgcagttac 3420

agcaggtgtt gcaattgcca aaaccatccg gcttgaaagt gaagtaacag caattaagaa 3480

tgccctcaaa aagaccaatg aagcagtatc tacattgggg aatggagttc gagtgttggc 3540

aactgcagtg agggagctgg aagattttgt gagcaagaat ctaacacgtg caatcaacaa 3600

aaacaagtgc gacattgctg acctgaaaat ggccgttagc ttcagtcaat tcaacagaag 3660

gtttctaaat gttgtgcggc aattttcaga caatgctgga ataacaccag caatatcctt 3720

ggacttaatg acagatgctg aactagccag agctgtttcc aacatgccaa catctgcagg 3780

acaaataaaa ctgatgttgg agaaccgtgc aatggtaaga agaaaggggt tcggaatcct 3840

gataggagtt tacggaagct ccgtaattta catggtgcaa ctgccaatct ttggagttat 3900

agacacgcct tgctggatag taaaagcggc cccttcttgc tcagaaaaaa agggaaacta 3960

tgcttgcctt ttaagagaag atcaaggatg gtattgtcag aatgcagggt caactgttta 4020

ctacccaaat gaaaaagact gcgaaacaag aggagaccat gtcttttgcg acacagcagc 4080

aggaatcaat gttgctgagc agtcaaagga gtgcaacatc aacatatcca ctactaatta 4140

cccatgcaaa gttagcacag gaagacaccc tatcagtatg gttgcactgt ctcctcttgg 4200

ggctttggtt gcttgctaca agggagtgag ctgttccatt ggcagcaaca gagtagggat 4260

catcaagcaa ctgaacaaag gctgctctta tataaccaac caagacgcag acacagtgac 4320

aatagacaac actgtatacc agctaagcaa agttgagggc gaacagcatg ttataaaagg 4380

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acttgaccaa gttttcgaaa gcattgagaa cagtcaggcc ttggtggatc aatcaaacag 4500

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tgtccttggc tctaccatga tcctagtgag tgtttttatc ataataaaga aaacaaagaa 4620

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aataaaaata aaaatttggg acaaatcata atgtctcgca aggctccatg caaatatgaa 4800

gtgcggggca aatgcaatag aggaagtgag tgcaagttta accacaatta ctggagttgg 4860

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aggcaggcta gagataacaa accatctgac agcaaacatg tggcacttca caacttagtc 5160

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ccgagagaga aactgaaaaa attagcaaag cttataattg acttatcagc aggtgctgaa 5280

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tcaaaggtat acaaactctg caataaacag agacacatgc tggaaaataa gcagaaatca 5880

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tcacatagta gaatgccatt gtatatacac agttaaatgg aagtgctatc attacccaat 6060

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gaaaataatg attatccaat gtatgaagtt gtacttaaat tattaggaga tactttgaga 8220

tgtattaaat tattaatcaa taaaaactta gagaatgctg ctgaattata ctatatattt 8280

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ttgaaagata ataaattcga ccaaaaagaa cttaaaagtt atgtggttaa acaagaatat 8820

ttaaatgata aggatcatat tgtctcgcta actggaaaag aaagagaatt aagtgtaggt 8880

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acaaacaagg caaacacaat aattgattgg ttagaacata ttttaaattc tccaaaaggt 13080

gaattaaatt atgatttttt tgaagcatta gaaaatactt accctaatat gattaaacta 13140

atagataatc tagggaatgc agagattaaa aaactgatca aagtaactgg atatatgctt 13200

gtaagtaaaa aatgaaaaat gataaaaatg ataaaatagg tgacaacttc atactattcc 13260

aaagtaatca tttgattatg caattatgta atagttaatt aaaaactaaa aatcaaaagt 13320

taaaaactaa taactgtcat taagtttatt aaaaataaga aattataatt ggatgtatac 13380

ggtttttttg ccgt 13394

<210> 2

<211> 12645

<212> DNA

<213> 间质肺病毒

<400> 2