盐酸维拉帕米在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用

摘要

本发明提供了盐酸维拉帕米在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。本发明经过对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型的菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长的实验，证明了盐酸维拉帕米具有对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型具有较强的抑制作用，可以将其制备成防治果蔬灰霉病和尖孢镰刀菌引起的植物病害的杀菌剂。传统农药对环境污染大、残留高、威胁食品安全。大量农药的使用也导致病原菌的抗药性增强，盐酸维拉帕米作为杀菌剂，具有高效和低毒的优点，适合于植物病害化学防治的要求，能够保证农产品及果蔬的高品质，符合可持续发展的要求，具有广阔的研究和市场前景。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及杀菌活性化合物，特别涉及盐酸维拉帕米在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。

背景技术

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌侵染所致的常见病害，是危害番茄生产最大的病害之一，发生非常普遍。除危害番茄外，番茄灰霉病菌还可危害茄子、黄瓜、葡萄、草莓等多种重要的经济作物，造成果蔬灰霉病。该病害不仅在寄主植物生长季节可以发生，还可以在农产品的储藏期间发生，因此危害严重。尤其是近年来设施栽培方式的大面积推广，导致该病菌侵染来源广，传播速度快，果蔬灰霉病的发生越来越严重，其发生与流行往往造成严重的经济损失。据报道北方设施番茄灰霉病的发生普遍较重，一般年份造成的经济损失可达20% –30%，严重的年份50%以上甚至绝收。

植物枯萎病的病原为尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种镰刀菌枯萎病的发生。寄主被镰刀菌侵染后，症状表现多种多样，一般导致维管束褐变，植株萎蔫枯死，球茎和根腐烂，植株生长衰弱等。特别是尖孢镰刀菌番茄专化型造成的番茄枯萎病，严重威胁番茄生产。镰刀菌枯萎病也是近年来对农业生产造成危害的一种重要的真菌性土传病害，在很多地区已有发生，尤其在作物重荏地发生程度更为严重，直接影响了农作物产量及其经济效益。

灰霉病菌和尖孢镰刀菌繁殖速度非常快，产生分生孢子的数量非常多，因此很容易发生变异而产生抗药性，目前已对农业生产上常用的氨基甲酸酯类等多种杀菌剂产生抗性，因此不仅导致防效的降低，而且导致药剂使用量不断加大。化学药剂的过度使用，不仅造成农产品农残超标，危害消费者的身体健康，还导致环境污染，破坏生态平衡，影响农业的可持续健康发展。

目前，对植物病害的防治的最为有效是化学防治。但是大量使用化学药物容易造成农药残留问题以及病原真菌的抗药性问题，并且对生态环境造成污染。因此，必须研发出高效、低毒、低残留和环境友好型的杀菌剂，并将其应用于生产实践中。我国农业要向着健康可持续方向发展，解决抗性、增强植物免疫能力、安全高效、与环境兼容性好等问题已经成为杀菌剂产品发展的方向。

盐酸维拉帕米，别名：戊脉安、维拉帕米盐酸盐、alpha-[3-[[2-(3,4-二甲氧苯基)乙基]甲氨基]丙基]-alpha-异丙基-3,4-二甲氧基苯乙腈盐酸盐等；英文名称：VerapamilHydrochloride；CAS号：152-11-4；分子式： C

盐酸维拉帕米为钙离子拮抗剂，能选择性扩张冠状动脉，增加冠脉流量；能抑制心肌兴奋性及房室传导，可用于治疗阵发性室上性心动过速、各种类型心绞痛、高血压病和肥厚性心肌病等。

目前，国内外尚无关于盐酸维拉帕米对农业植物病原菌抑制作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了盐酸维拉帕米在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。本发明通过毒力测定，证明了盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型具有良好的抑制活性。盐酸维拉帕米作为杀菌剂，其高效低毒，适合于植物病害化学防治的要求。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了盐酸维拉帕米在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。

进一步的：所述植物病原菌为番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型。

进一步的：所述杀菌剂中盐酸维拉帕米的有效使用浓度为1.0 mM – 5.0 mM。

进一步的：所述盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型的菌丝生长的抑制率呈剂量依赖性。

进一步的：所述杀菌剂中盐酸维拉帕米的浓度为5.0 mM时，盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型的菌丝生长抑制率超过89.2%。

进一步的：所述盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型的孢子萌发的抑制率呈剂量依赖性。

进一步的：所述杀菌剂中盐酸维拉帕米的浓度为5.0 mM时，盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型的孢子萌发的抑制率超过91.0%。

进一步的：所述盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性。

进一步的：所述杀菌剂中盐酸维拉帕米的浓度为5.0 mM时，盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型的芽管伸长抑制率超过90.9%。

进一步的：所述植物为番茄、茄子、辣椒、黄瓜、葡萄、草莓。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：目前防治植物病原菌主要靠农药。农药杀菌剂的品种作用机制比较单一，并且存在农药残留问题，直接威胁着人类的环境和食品安全。因此，开发是应用无污染、无公害绿色杀菌剂已成为农业生产中的重要防治方法。许多绿色杀菌剂已相继问世，并广泛应用于生产，取得了显著效果。本发明通过室内毒力测定，证明了盐酸维拉帕米对植物病原真菌具有良好的抑制活性。而且盐酸维拉帕米是一种无污染、对环境友好的小分子化合物，并且对非靶标生物及人畜安全，能够保证农产品及果蔬的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。

附图说明

图1是本发明中盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑菌实验结果；

图2是本发明中盐酸维拉帕米对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长的抑菌实验结果；

图3是本发明中盐酸维拉帕米抑制番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型分生孢子萌发的实验结果；

图4是本发明所述盐酸维拉帕米抑制番茄灰霉病菌孢子芽管伸长的实验结果；

图5是本发明所述盐酸维拉帕米抑制尖孢镰刀菌番茄专化型芽管伸长的实验结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

实施例1

一、实验材料

1、盐酸维拉帕米购自Sigma公司，4℃保存待用。

2、本实验中植物病原菌保存在4℃冰箱，采用的培养基为马铃薯葡萄糖培养基（简称PDA）。PDA培养基配方：马铃薯（土豆）200 g，葡萄糖 20 g，琼脂20 g，蒸馏水 1000 ml，自然pH。配制方法：将土豆洗净去皮，称200 g切成小块，加1000 ml蒸馏水煮沸20 min，再用四层纱布过滤于大烧杯中，根据实验需要加20 g琼脂，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，补足水至1000 ml，分装后121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

3、本实验中测定植物病原菌孢子萌发、芽管伸长采用是酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（简称YPD）。配方：1% Yeast Extract（酵母提取物），2% Peptone（蛋白胨），2%Dextrose（葡萄糖）。配制方法：分别称取酵母提取物10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖20 g，以及蒸馏水 1000 ml，自然pH。分装后121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

二、盐酸维拉帕米对灰霉病菌和植物枯萎病菌的生防实验

1、盐酸维拉帕米对植物病原菌菌丝生长的抑制作用

实验方法：将植物病原菌分别在PDA平板上25℃活化培养5天左右备用；取PDA培养基加热溶化，冷却至45-50 ℃，分别加入不同质量的盐酸维拉帕米制成含0、1.0、3.0和5.0 mM药液的培养基，并分别倒入培养皿中冷却；用打孔器在活化好的植物病原菌菌株菌丝边缘（生长状况尽量一致）打取圆形菌饼（直径0.60 cm），再用接种针挑至含药平板中央，然后将培养皿倒置于培养箱（25℃）中培养。

处理后及时观察测定菌丝的生长情况。等不含药物的对照平板基本长满后，并采用十字交叉法测得直径并处理数据，计算抑制率并拍照。抑制率(%)＝(对照新生长菌丝直径-处理新生长菌丝直径)/对照新生长菌丝直径×100。每个处理重复3次。

盐酸维拉帕米对果蔬灰霉病菌和植物枯萎病菌菌丝生长的抑菌效果如图1和图2所示，从图1和图2可知，随着盐酸维拉帕米浓度的升高，其对两种植物病原菌的抑制效果也有不同程度的提高。当盐酸维拉帕米在5.0 mM时，可以显著的抑制番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝的生长。

表1总结了盐酸维拉帕米对两种植物病原菌菌丝生长的抑菌率。由表1可知，当盐酸维拉帕米浓度为5.0 mM时，对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制率达到95.0%，对尖孢镰刀菌番茄专化型菌丝生长抑制率达到89.2%，表明盐酸维拉帕米对测试的两种植物病原真菌的菌丝生长都具有显著的抑制作用。

表1 盐酸维拉帕米对病原菌菌丝生长的抑菌率

2、盐酸维拉帕米对植物病原菌对孢子萌发的抑制作用

实验方法：将番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型分别接种在PDA平板培养至产生分生孢子；收集孢子并用YPD液体调整分子孢子的浓度在6.1×10

实验结果如图3所示，随着盐酸维拉帕米含量的增加，对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型分生孢子萌发的抑制率明显提高。当含量超过5.0 mM时，就可以基本抑制两种分生孢子的萌发，孢子萌发抑制率均超过91.0%。表明盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌和尖孢镰刀菌番茄专化型孢子的萌发均具有较强的抑制作用。

3、盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌芽管伸长的影响

实验方法：采用同上的凹玻片法进行检测，培养6h-10h后，显微镜观察并测量芽管伸长情况，并计算药物对芽管伸长的抑制率。抑制率(%)＝(对照芽管长度-处理芽管长度)/对照芽管长度×100。每个处理重复3次。

实验结果如图4所示，在同一时间点，随着盐酸维拉帕米浓度的提高，对芽管伸长的抑制率越高，即对番茄灰霉病菌分生孢子芽管伸长的抑制率呈剂量依赖性，当盐酸维拉帕米5.0 mM时，基本抑制了病原菌芽管的伸长。

表2总结了盐酸维拉帕米对番茄灰霉病菌芽管伸长的抑菌率。由表2可知，当盐酸维拉帕米浓度为5.0 mM时，对番茄灰霉病菌芽管伸长抑制率可以达到95.5%。

表2 盐酸维拉帕米（5.0 mM）对番茄灰霉病菌芽管伸长的抑菌率

4、盐酸维拉帕米对尖孢镰刀菌番茄专化型芽管伸长的影响：

实验方法：采用同上的凹玻片法进行检测，培养3h-9h后，显微镜观察并测量芽管伸长情况，并采用同上方法计算药物对芽管伸长的抑制率。

实验结果如图5所示，在同一时间点，随着盐酸维拉帕米浓度的提高，对芽管伸长的抑制率越高，即对尖孢镰刀菌番茄专化型分生孢子芽管伸长的抑制率也呈剂量依赖性，当盐酸维拉帕米5.0 mM时，尖孢镰刀菌番茄专化型芽管的伸长基本得到抑制。

表3总结了盐酸维拉帕米对尖孢镰刀菌番茄专化型芽管伸长的抑菌率。由表3可知，当盐酸维拉帕米浓度为5.0 mM时，对尖孢镰刀菌番茄专化型芽管伸长抑制率可以达到96.2%。

表3 盐酸维拉帕米（5.0 mM）对尖孢镰刀菌番茄专化型芽管伸长的抑菌率

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。