一种不脱钙骨切片的染色方法

摘要

本发明属于生物医学技术领域，具体公开了一种不脱钙骨切片的染色方法，包括如下步骤：将骨组织用金刚刀切片机切片后，用磨片机打磨成厚度为15‑25μm的骨切片，将骨切片脱水后，用松香染色，再用中性树胶封固，得到染色的不脱钙骨切片。采用本发明方法制备牙切片制作厚度可控，质量高，可完好的展示骨组织的微细结构，更利于辨识，能很好地满足教学和科学研究要求；本发明的染色方法也适用于其他硬质骨组织不脱钙切片的制作。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种不脱钙骨切片的染色方法。

背景技术

形态学及组织学是研究骨组织行为及骨修复重建过程的重要手段之一。对骨骼组织变化进行检测并获得实验数据的标准方法是对骨组织进行包埋切片及染色分析，石蜡包埋法是最常用的方法。成熟骨组织(如牙及牙周组织中的牙釉质、牙本质、牙骨质和牙槽骨)质地坚硬致密、难切且脆、易碎，使用石蜡包埋法前必须对骨组织进行脱钙处理，脱钙是决定牙齿等骨组织切片质量和染色效果的关键步骤。但脱钙处理会严重破坏骨组织的固有结构，导致无法区分骨形成及矿化骨质和未钙化的类骨质，不能准确地评价新骨形成情况。

为了能够完整保留骨骼的成分并进行切片分析，有研究提出了不需脱钙的树脂包埋法。树脂包埋法中以树脂液代替石蜡，凝固后的树脂标本质地坚韧，不易碎裂，适用于不脱钙骨组织切片及分析，如《塑料包埋不脱钙大块骨组织切片及染色》(吕荣等，临床与实验病理学杂志，342页)。不脱钙骨组织切片保留了骨组织完整的矿化结构，标本经染色后，可区分钙化骨质与未钙化的类骨质。但常规的染色方法，如HE(苏木精-伊红)染色法，会使牙齿等骨组织的微细结构被破坏，不能满足教学和科研要求。而未进行特殊染色的骨切片不便于观察骨组织的形态结构。

另外，目前，不脱钙骨切片有采用金刚刀切割机制作，但厚度一般在100μm及以上，切片厚度较厚，不利于骨组织形态研究；而现有的不脱钙骨切片磨片方法主要为手工磨片，厚度在40μm以上，手工磨片边缘和中央厚薄不均，磨片厚度较厚，且手工磨片费时费力。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种不脱钙骨切片的染色方法，用于解决现有技术中不脱钙骨切片染色方法会破坏骨组织微细结构的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种不脱钙骨切片的染色方法，包括如下步骤：将骨组织用金刚刀切片机切片后，用磨片机打磨成厚度为15-25μm的骨切片，将骨切片脱水后，用松香染色，再用中性树胶封固，得到染色的不脱钙骨切片。

进一步，将脱水后的骨切片充分浸泡在烤化成液态的松香中，然后立即放置于载玻片上用中性树胶封固，得到染色的不脱钙骨切片。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)利用金刚刀切片机将骨组织切为200-300μm厚度的骨切片；

(2)将骨切片的一面粘牢在载物板上，将骨切片未粘在载物板的一面在磨片机上进行精细打磨，将骨切片从载物板上取下，清洗干净后，再将骨切片打磨后的一面粘牢在载物板上，再重复上述打磨过程，对骨切片未打磨的一面进行打磨，经磨片机精细打磨后的骨切片厚度为15-25μm；

(3)将骨切片从载物板上取下，清洗干净后，进行脱水；

(4)将松香烤化至液态，然后将骨切片用松香充分浸泡，立即放置于载玻片上，用中性树胶封固，得到染色的不脱钙骨切片。

进一步，步骤(1)中，所述金刚刀切片机的转速为5000-7000转/分。

进一步，所述步骤(2)中，用烤化的虫胶将骨切片粘牢在载物板上。

进一步，所述步骤(2)和(3)中，将打磨后的骨切片放入碱水中，加热，将骨切片从载物板上取下，并去除虫胶，再用清水清洗干净，进行下一步操作。

进一步，所述碱水由碳酸钠配制而成，碱水中碳酸钠的浓度为5-10％。

进一步，所述步骤(2)中，骨切片在磨片机上进行打磨时，载物板的平行度为10μm。

进一步，所述步骤(2)中，所述载物板选自玻璃板、塑料板、不锈钢板中的一种。

进一步，所述步骤(3)中，用无水乙醇对骨切片进行脱水。

进一步，所述骨组织为密质骨。

进一步，所述密质骨为牙齿，所述骨切片为牙切片。

本发明第二方面提供一种采用第一方面所述的染色方法制作得到的不脱钙骨切片。

进一步，所述不脱钙骨切片为不脱钙牙切片。

如上所述，本发明的不脱钙骨切片的染色方法，具有以下有益效果：

本发明提供了一种不脱钙骨切片的染色方法，在制作骨切片过程，不用树脂等包埋剂，减少较高温度的包埋剂对骨组织的损伤，尽可能完好的展示骨组织的微细结构。

本发明首次提出采用松香对骨切片进行染色，松香染色原理在于：松香内含一定量天然色素，骨切片磨片后经松香浸染，骨组织的各种结构性纹理会有部分色素沉积，从而观察到牙体釉质、牙本质、牙骨质的纹理都有增强，相较于未经染色的骨切片，更便于观察。

经过试验验证，采用本发明方法制作牙切片厚度可控，微细结构可见的高质量不脱钙骨切片，能很好地满足教学和科学研究要求。本发明的方法也适用于其他骨组织，尤其是密质骨的不脱钙切片及染色制作。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中不脱钙牙切片的松香染色结果图。

图2显示为教科书(《口腔组织病理学》，第四版人民卫生出版社，P23)中的釉牙骨质界的三种连接形式图。

图3显示为本发明对比例1中未经染色的不脱钙牙切片的组织形态图。

图4显示为本发明对比例2中不脱钙牙切片的HE染色结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明提供一种不脱钙骨切片的染色方法，将骨组织用金刚刀切片机切成200-300μm厚度的切片后，用磨片机打磨成厚度为15-25μm的骨切片，将骨切片脱水后，用松香染色，再用中性树胶封固，得到染色的不脱钙骨切片。

本发明的不脱钙骨切片的染色方法具体包括如下步骤：

(1)利用金刚刀切片机将骨组织切为200-300μm厚度的骨切片；

(2)将骨切片的一面粘牢在载物板上，将骨切片未粘在载物板的一面在磨片机上进行精细打磨，将骨切片从载物板上取下，清洗干净后，再将骨切片打磨后的一面粘牢在载物板上，再重复上述打磨过程，对骨切片未打磨的一面进行打磨，经磨片机精细打磨后的骨切片厚度为15-25μm；

(3)将骨切片从载物板上取下，清洗干净后，进行脱水；

(4)将松香烤化至液态，然后将骨切片用松香充分浸泡，立即放置于载玻片上，用中性树胶封固，得到染色的不脱钙骨切片。

具体的，步骤(1)中，金刚刀切片机的转速控制在5000-7000转/分，以下实施例中金刚刀切片机的转速为6000转/分。

具体的，步骤(2)中，用烤化的虫胶将骨切片粘牢在载物板上。

具体的，步骤(2)和(3)中，将打磨后的骨切片放入碱水中，加热，将骨切片从载物板上取下，并去除虫胶，再用清水清洗干净，进行下一步操作。其中，碱水由氢氧化钠配制而成，碱水中碳酸钠的浓度控制在5-10％较佳，以下实施例中采用的是碱水为5％的碳酸钠溶液。

具体的，步骤(2)中，骨切片在磨片机上进行打磨时，载物板的平行度控制为10μm，以保证骨切片打磨后厚度均匀。

具体的，步骤(2)中，载物板采用玻璃板，也可以采用其他材质的载物板，如不锈钢板、塑料板等。

具体的，步骤(3)中，用无水乙醇(酒精)对骨切片进行脱水。

本发明先用金刚刀切片机将骨组织切成200-300μm厚度的切片后，再用磨片机打磨成厚度为15-25μm的骨切片，厚度控制在15-25μm，更利于后期骨组织形态的观察。在制作骨切片过程，不用树脂等包埋剂，从而减少较高温度的包埋剂对骨组织的损伤，尽可能完好的展示骨组织的微细结构。

本发明首次提出采用松香对骨切片进行染色，松香染色原理在于：松香内含一定量天然色素，骨切片磨片后经松香浸染，骨组织的各种结构性纹理会有部分色素沉积，从而观察到牙体釉质、牙本质、牙骨质的纹理都有增强，相较于未经染色的骨切片，更便于观察。

本发明的染色方法适用于牙齿等密质骨骨组织的骨切片制作，下面采用牙齿为例，对本发明的方法进行详细地说明。

实施例1

一种不脱钙牙切片的制备及染色方法，步骤如下：

(1)利用金刚刀切片机(XQPI-66A￠400金刚石切片机)，在6000转/分的转速将牙齿切为200-300μm厚度的牙切片。

(2)用烤化的虫胶(紫色天然树脂)，将牙切片的一面用虫胶粘牢在玻璃板上，将牙切片未粘虫胶的一面在磨片机上进行精细打磨，利用碱水(5％碳酸钠)煮，去掉虫胶，清水漂洗；将牙切片打磨过的一面用虫胶粘贴在玻璃板上，对牙切片未打磨的一面再重复上述打磨过程。打磨过程中，玻璃板平行度为10μm。最终打磨后的牙切片厚度控制在15-25μm。

(3)用碱水(5％碳酸钠)去掉虫胶，清水漂洗，再用无水乙醇对牙切片进行脱水处理。

(4)将松香烤化至液态，将上述牙切片充分浸泡在松香中，然后立即放置于载玻片上，用中性树胶封固，得到染色的不脱钙牙切片。

图1显示为不脱钙牙切片的松香染色结果图。

由图1可知，实施例1中制备得到的牙切片完好地展示了牙的微细结构，其中1-A图可观察到根横断面，托姆斯颗粒层，外源牙骨质，内牙本质；1-B图可观察到窝沟，牙本质小管，绞釉；1-C图可观察到釉板，釉梭，釉牙本质界；1-D图可观察到釉牙骨质界，且1-D图与教科书(图2，《口腔组织病理学》，第四版人民卫生出版社，P23)中的釉牙骨质界的三种连接形式图(图1-28)中的A图相同，这表明采用本发明方法制备得到的牙切片能观察到与教科书现以模式图呈现的牙结构，说明本发明制备得到的牙切片质量高，微细结构明显可见，能很好地满足教学和科学研究要求。

对比例1

根据实施例1的方法制作得到厚度在15-25μm范围内的牙切片，将打磨后的牙切片脱水后，直接用中性树胶封固。

图3显示为未经染色的不脱钙牙切片的组织形态图。

对比例2

根据实施例1的方法制作得到厚度在15-25μm范围内的牙切片，将打磨后的牙切片脱水后，先用HE进行染色，然后用中性树胶封固。

图4显示为不脱钙牙切片经HE染色后的组织形态图。

由图1、图3和图4对比可知，图1显示的不脱钙牙切片组织形态图牙齿组织轮廓更分明，更利于辨识，这是由于松香所含的天然色素浸染牙片后，牙体硬组织中钙化程度较低(有机质含量较高)部分的组织轮廓对色素亲合力大于高钙化区，这样可使组织轮廓更分明，利于辨识。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。