miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用

摘要

本发明提供一种miR‑30a‑5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用，所述miR‑30a‑5p为周围神经损伤修复的分子靶点，用于制备促进神经再生和修复神经损伤的药物。其在促进DRG神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用包括如下验证步骤：S1、培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR‑30a‑5p促进DRG神经元轴突生长情况；S2、培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR‑30a‑5p促进DRG神经元轴突再生情况；S3、提取原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR‑30a‑5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况。本发明以miR‑30a‑5p作为分子干预靶点，过表达miR‑30a‑5p，促进DRG神经元轴突的生长与再生。本发明利用微流体在体外DRG神经元，转染miR‑30a‑5p mimic，可以显著促进原代培养的DRG神经元轴突的生长与再生。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用。

背景技术

周围神经损伤修复是临床上的常见难题，给社会及家庭造成极大的负担。周围神经受损后可以自发的再生，但由于再生速度有限，最终导致功能难以恢复。因此，充分探索周围神经损伤再生的细胞与分子机制，有助于促进周围神经功能修复，为临床治疗提供理论基础。

microRNA (miRNA )是内源性非编码的小 RNA，长度约为 21-23个核苷酸，其主要作用是通过与靶基因 3’端的非翻译区完全或不完全结合，抑制靶基因翻译或直接降解靶基因。miRNA 在周围神经系统中不仅能够抑制神经元的凋亡，促进神经元轴突的再生，还能参与调节胶质细胞的增殖与迁移。研究发现，DRG神经元轴突生长有助于周围神经损伤修复，为此，需提供一种促进DRG神经元轴突的生长、有助于神经损伤后的治疗新的靶点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用，体外过表达miR-30a-5p，可以靶向Nrp1显著促进DRG神经元轴突的生长以及再生，为周围神经损伤修复提供新的靶点。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种miR-30a-5p，为周围神经损伤修复的分子靶点。

本发明还提供一种miR-30a-5p的用途，用于制备促进神经再生和修复神经损伤的药物。

其中，所述神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。

本发明还提供一种miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用，包括如下验证步骤：

S1、培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突生长情况；

S2、培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突再生情况；

S3、提取原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况。

其中，步骤S1的具体步骤为：

S1.1、微流体培养原代DRG神经元细胞

S1.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮，将背根神经节取出后放到解剖液HA中， 3mg/ml胶原酶消化，37℃，30min；

S1.1.2、弃胶原酶，加0.25%的胰酶消化，37℃，20min；

S1.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用，离心后弃上清；

S1.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中，培养4h后，替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基，10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞；

S1.2、神经元细胞mimics转染

待细胞贴壁后，用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到步骤S1.1培养的神经元细胞中，培养8h后更换为神经元培养基；

S1.3、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量

S1.3.1、DRG神经元细胞转染72h后将细胞培养基弃掉，用PBS润洗一遍，加入4%的多聚甲醛，固定30min；

S1.3.2、弃掉多聚甲醛后，PBS洗三遍，每遍5min；

S1.3.3、加入免疫组化封闭液，室温封闭1h；

S1.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody（1：400，abcam），加好一抗后，4℃过夜；

S1.3.5、弃掉一抗，PBS洗3遍，每遍5min；

S1.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG （1：400，Sigma），加好二抗后，避光室温2h；

S1.3.7、弃掉二抗，PBS洗3遍，每遍5min；

S1.3.8、加入适量PBS，ZEISS正置荧光显微镜下观察，拍照，观察DRG神经元轴突生长情况，拍照并统计各组突起长度的分布。

其中，步骤S2的具体步骤为：

S2.1、微流体培养原代DRG神经元细胞

S2.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮，将背根神经节取出后放到解剖液HA中， 3mg/ml胶原酶消化，37℃，30min；

S2.1.2、弃胶原酶，加0.25%的胰酶消化，37℃，20min；

S2.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用，离心后弃上清；

S2.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中，培养4h后，替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基，10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞；

S2.2、神经元细胞mimics转染

待细胞贴壁后，用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到培养的神经元中，培养8h后更换为神经元培养基；

S2.3、细胞免疫荧光染色及轴突再生长度测量

S2.3.1、DRG神经元细胞转染72h后，利用负压将小室中细胞的轴突去除掉，24h后将细胞培养基弃掉后，用PBS润洗一遍，加入4%的多聚甲醛，固定30min；

S2.3.2、弃掉多聚甲醛后，PBS洗三遍，每遍5min；

S2.3.3、加入免疫组化封闭液，室温封闭1h；

S2.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody，加好一抗后，4℃过夜；

S2.3.5、弃掉一抗，PBS洗3遍，每遍5min；

S2.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG，加好二抗后，避光室温2h；

S2.3.7、弃掉二抗，PBS洗3遍，每遍5min；

S2.3.8、加入适量PBS，ZEISS正置荧光显微镜下观察，拍照，观察DRG神经元轴突的再生情况，拍照并统计各组突起长度的分布。

其中，步骤S3的具体步骤为：

S3.1、原代DRG神经元细胞的提取

S3.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮，将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中，适量 3mg/ml 胶原酶消化，37℃，30min；

S3.1.2、弃胶原酶，加适量 0.25%的胰酶消化，37℃，20min；

S3.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用，离心后弃上清；

S3.1.4、用神经元培养基重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的6孔板中；

S3.2、神经元细胞mimics转染

待细胞贴壁后，用转染试剂混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照后加入到培养的神经元中，培养8h后更换为神经元培养基；

S3.3、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR

S3.3.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞，提取RNA；

S3.3.2、使用反转录试剂盒进行逆转录；

S3.3.3、逆转录后，采用RT-PCR 试剂盒进行qRT-PCR；

PCR仪反应程序：

Stage 1：95℃ 6min；

Stage 2：95℃ 10s，60℃ 30S，72℃ 10S；

Stage 3：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s；

NRP1引物序列：

Forward：CGCCTGAACTACCCTGAA，

Reverse：CCCCACAGCAGTAACGA。

S3.4、Western blot试验

S3.4.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞，PBS润洗一遍，加入含1%的蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解 5-10min，至细胞完全裂解；4℃离心，13000rpm，10min，收集上清；

S3.4.2、BCA法蛋白定量；

S3.4.3、进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%的脱脂牛奶，室温封闭2h；

S3.4.4、孵育一抗，用一抗稀释液稀释 anti- NRP1 Polyclonal antibody（1：400），室温孵育，过夜；

S3.4.5、1×TBS洗3遍，每遍 10min；

S3.4.6、用5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP，室温孵育，120min；

S3.4.7、1×TBST洗3遍，每遍 10min；

S3.4.8、1×TBS洗1遍，10min；

S3.4.9、在膜上孵育ECL显色液，室温，1-3min，显影，观察Western blot结果，待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

1、本发明以miR-30a-5p作为分子干预靶点，过表达miR-30a-5p，促进DRG神经元轴突的生长与再生。

2、本发明利用微流体在体外DRG神经元，转染miR-30a-5p mimic，可以显著促进原代培养的DRG神经元轴突的生长与再生。

3、本发明提供的miR-30a-5p可以通过调节DRG神经元轴突生长参与周围神经损伤修复，有助于更好地理解miRNA在神经损伤修复过程中的重要作用，并为神经损伤后的治疗提供新的靶点。

附图说明

图1为本发明实施例一中体外过表达miR-30a-5p可以显著促进DRG神经元轴突生长的示意图；

图2为本发明实施例二中体外过表达miR-30a-5p可以显著促进损伤后DRG神经元轴突再生的示意图；

图3为本发明实施例三中体外过表达miR-30a-5p可以显著抑制DRG神经元中NRP1的mRNA和蛋白表达的示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

本发明提供一种miR-30a-5p，作为周围神经损伤修复的分子靶点，在周围神经损伤修复过程中对 DRG 神经元进行调控，靶向Nrp1显著促进DRG神经元轴突的生长以及再生。

miR-30a-5p用于制备促进神经再生和修复神经损伤的药物，其中的神经损伤为周围神经系统坐骨神经损伤。

本发明还提供一种miR-30a-5p在促进 DRG 神经元轴突再生和周围神经损伤修复方面的应用，包括如下验证步骤：

S1、培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突生长情况；

S2、培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突再生情况；

S3、提取原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况。

下面结合几个具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。

实施例1：培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突生长情况，具体步骤为：

1.1、微流体培养原代DRG神经元细胞

1.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮，将背根神经节取出后放到解剖液HA中，适量3mg/ml胶原酶消化，37℃，30min；

1.1.2、弃胶原酶，加适量0.25%的胰酶消化，37℃，20min；

1.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用，离心后弃上清；

1.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中，培养4h后，替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基，10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞。

1.2、神经元细胞mimics转染

待细胞贴壁后，用Lipofectamine® RNAiMAX Reagent混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照（广州锐博生物公司，终浓度为100nM）后加入到步骤S1.1培养的神经元细胞中，培养8h后更换为神经元培养基。

1.3、细胞免疫荧光染色及轴突生长长度测量

1.3.1、DRG神经元细胞转染72h后将细胞培养基弃掉，用PBS润洗一遍，加入4%的多聚甲醛，固定30min；

1.3.2、弃掉多聚甲醛后，PBS洗三遍，每遍5min；

1.3.3、加入免疫组化封闭液，室温封闭1h；

1.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody（1：400，abcam），加好一抗后，4℃过夜；

1.3.5、弃掉一抗，PBS洗3遍，每遍5min；

1.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG （1：400，Sigma），加好二抗后，避光室温2h；

1.3.7、弃掉二抗，PBS洗3遍，每遍5min；

1.3.8、加入适量PBS，ZEISS正置荧光显微镜下观察，拍照，观察DRG神经元轴突生长情况，拍照并统计各组突起长度的分布。

结果显示，过表达miR-30a-5p（miR-30a-5p mimics）可以显著促进DRG神经元轴突的生长（图1），其中，图1A为Mimic Negative control（Mimic-NC，阴性对照）或miR-30a-5pmimics分别转染体外微流体中培养的DRG神经元，72h后细胞免疫组化染色。红光为 Tuj1/Cy3，再经Photshop 转换成灰度图，Bar=200μm。图1B为体外DRG神经元转染Mimic-NC与miR-30a-5p mimics后，至少15根最长轴突的平均值。*P < 0.05，***P < 0.001。

实施例2：培养原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p促进DRG神经元轴突再生情况，具体步骤为：

2.1、微流体培养原代DRG神经元细胞

2.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮，将背根神经节取出后放到解剖液HA中，适量3mg/ml胶原酶消化，37℃，30min；

2.1.2、弃胶原酶，加适量0.25%的胰酶消化，37℃，20min；

2.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用，离心后弃上清；

2.1.4、用含有5% FBS的DMEM重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的微流体小室中，培养4h后，替换为含有2% B-27、2mM谷氨酰胺及10ng/ml的NGF的Neurobasal培养基，10mM的阿糖胞苷用于去除非神经元细胞。

2.2、神经元细胞mimics转染

待细胞贴壁后，用Lipofectamine® RNAiMAX Reagent混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照（广州锐博生物公司，终浓度为100nM）后加入到培养的神经元中，培养8h后更换为神经元培养基。

2.3、细胞免疫荧光染色及轴突再生长度测量

2.3.1、DRG神经元细胞转染72h后，利用负压将小室中细胞的轴突去除掉，24h后将细胞培养基弃掉后，用PBS润洗一遍，加入4%的多聚甲醛，固定30min；

2.3.2、弃掉多聚甲醛后，PBS洗三遍，每遍5min；

2.3.3、加入免疫组化封闭液，室温封闭1h；

2.3.4、用免疫组化一抗稀释液稀释一抗anti-Tuj1 antibody（1：400，abcam），加好一抗后，4℃过夜；

2.3.5、弃掉一抗，PBS洗3遍，每遍5min；

2.3.6、用免疫组化二抗稀释液稀释荧光二抗Cy3 sheep anti-mouse IgG （1：400，Sigma），加好二抗后，避光室温2h；

2.3.7、弃掉二抗，PBS洗3遍，每遍5min；

2.3.8、加入适量PBS，ZEISS正置荧光显微镜下观察，拍照，观察DRG神经元轴突的再生情况，拍照并统计各组突起长度的分布。

结果显示，过表达miR-30a-5p（miR-30a-5p mimics）可以显著促进DRG神经元轴突的再生（图2），其中，图2A为Mimic Negative control（Mimic-NC，阴性对照）或miR-30a-5pmimics分别转染体外微流体中培养的DRG神经元，3d后负压吸引去掉生长的轴突。24h后细胞免疫组化染色。红光为 Tuj1/Cy3，再经Photshop 转换成灰度图，Bar=100μm。图2B为体外DRG神经元转染Mimic-NC与 miR-30a-5p mimics后，至少15根最长轴突的平均值。*P <0.05，***P < 0.001。

实施例3：提取原代DRG神经元细胞，观察体外过表达miR-30a-5p抑制NRP1 mRNA和蛋白表达情况，具体步骤为：

3.1、原代DRG神经元细胞的提取

3.1.1、DRG 神经元来自1d SD大鼠红皮，将背根神经节取出后放到解剖液 HA 中，适量3mg/ml 胶原酶消化，37℃，30min；

3.1.2、弃胶原酶，加适量 0.25%的胰酶消化，37℃，20min；

3.1.3、用含有10%胎牛血清的 DMEM 终止胰酶作用，离心后弃上清；

3.1.4、用神经元培养基重悬细胞，过200目筛网后种到用多聚赖氨酸包被的6孔板中。

3.2、神经元细胞mimics转染

待细胞贴壁后，用Lipofectamine® RNAiMAX Reagent混匀miR-30a-5p mimics及阴性对照（广州锐博生物公司，终浓度为100nM）后加入到培养的神经元中，培养8h后更换为神经元培养基。

3.3、DRG细胞RNA提取及qRT-PCR

3.3.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞，提取RNA；按TRIZOL® Reagent（Invitrogen）说明书提取RNA。

3.3.2、使用QIAGEN反转录试剂盒进行逆转录；

3.3.3、逆转录后，采用SYBR® PrimeScript RT-PCR Kit（QIAGEN）进行qRT-PCR；操作按试剂盒说明书进行（以GAPDH作为内参），

PCR仪反应程序：

Stage 1：95℃ 6min；

Stage 2 (Cycle：40)：95℃ 10s，60℃ 30S，72℃ 10S；

Stage 3：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s；

NRP1引物序列：

Forward：CGCCTGAACTACCCTGAA，

Reverse：CCCCACAGCAGTAACGA。

qRT-PCR结果如图3A所示，结果显示与Mimic Negative control组相比，过表达miR-30a-5p可以显著抑制DRG神经元中NRP1的mRNA 水平。其中，图3A为Mimic Negativecontrol（Mimic-NC，阴性对照）或miR-30a-5p mimics分别转染体外培养的DRG神经元，72h后qRT-PCR检测NRP1 mRNA的表达情况，内参为GAPDH。***P < 0.001。图3B为MimicNegative control（Mimic-NC，阴性对照）或miR-30a-5p mimics分别转染体外培养的DRG神经元，72 h后Western blot检测NRP1 蛋白表达情况，内参为β-actin。**P < 0.01。

3.4、Western blot试验

3.4.1、收取体外培养3d的DRG神经元细胞，PBS润洗一遍，加入适量的含1%的蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解 5-10min，至细胞完全裂解；4℃离心，13000rpm，10min，收集上清；

3.4.2、BCA法蛋白定量；

3.4.3、进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%的脱脂牛奶，室温封闭2h；

3.4.4、孵育一抗，用一抗稀释液稀释 anti- NRP1 Polyclonal antibody（1：400），室温孵育，过夜；

3.4.5、1×TBS洗3遍，每遍 10min；

3.4.6、用5%的脱脂牛奶稀释二抗羊抗兔 HRP（1：1000），室温孵育，120min；

3.4.7、1×TBST洗3遍，每遍 10min；

3.4.8、1×TBS洗1遍，10min；

3.4.9、在膜上孵育ECL显色液，室温，1-3min，显影，观察Western blot结果，待胶片晾干后用扫膜仪将结果传输到电脑。Western blot结果如图3B所示，结果显示与MimicNegative control组相比，过表达miR-30a-5p可以显著抑制DRG神经元中NRP1的蛋白水平。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南通大学

<120> miR-30a-5p及其在促进神经再生和修复周围神经损伤方面的应用

<141> 2020-11-23

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

Cys Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly

1 5 10 15

Ala Ala

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

Cys Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Ala Cys Gly

1 5 10 15

Ala