一种修复关节软骨缺损的复合材料及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于修复关节软骨缺损的复合材料，包括同种异体骨和包裹所述同种异体骨的凝胶层；所述凝胶层包含硫酸软骨素、透明质酸、氨基葡萄糖以及凝胶介质。本发明同时还提供了上述用于修复关节软骨缺损的复合材料的制备方法。本发明提供的用于修复关节软骨缺损的复合材料，能有利于减少关节软骨修复过程中的炎症反应，促进软骨基质的修复与重建，加快关节软骨尤其适用于修复大面积缺损的，尤其适用于大面积关节软骨缺损的修复与重建。

说明书

技术领域

本发明涉及医用材料领域， 特别涉及一种修复关节软骨缺损的复合材料及其制备方法。

背景技术

关节软骨属于透明软骨，其表面光滑，有光泽，是一种特殊的结缔组织，关节软骨是由软骨细胞，Ⅱ型、Ⅸ型、Ⅺ型胶原，蛋白多糖和小的糖蛋白，还有其他特异性与非特异性的基质蛋白以及水和无机盐构成，其中Ⅱ型胶原占总干重的50%。关节软骨覆盖于关节的表面，起着缓冲应力、吸收震荡、润滑关节表面、防止磨损等重要作用。人体关节软骨是无血管组织，没有血液供应，营养来源于周围关节滑液的滋润，一旦损伤就很难再生，因此关节软骨修复成为骨科医生最具挑战性的临床难题之一。

我国软骨损伤的发生率达到68.5%，且中老年的发生率高于青少年，而在中老年人之中，女性的发生率为90.5%，远远高于男性。软骨损伤主要是由于关节中的半月板损伤，从而导致关节软骨发生软化、龟裂、剥离和脱落。造成这一现象的原因主要有三类，第一类是缺乏运动，从而导致关节软骨的退变；第二类是关节过度活动引起的劳损；第三类是关节急性损伤引起的关节软骨的损伤。目前软骨损伤修复的治疗方法主要包括：A、口服药物；B、物理疗法；C、关节内注射局麻药及皮质激素；D、关节镜下冲洗与清理术；E、关节镜下软骨刨削术；F、微骨折术；G、同种异体软骨移植术；H、自体软骨细胞培养移植术。

但上述各种方法均存在一定的缺陷，例如：A、口服药物：能够减轻炎性反应，但有副作用，且无直接促进软骨修复的效果。B、物理疗法：多为患者主观感觉疼痛症状减轻，远期效果未知。C、关节内注射局麻药及皮质激素：可快速缓解症状，但不能促进关节软骨的修复，甚至导致软骨组织退化，远期预测是弊大于利。D、关节镜下冲洗与清理术：通过去除关节腔内的致炎因子、软骨碎片来减轻患者的临床症状，早期临床疗效显著，但仅延缓了关节软骨损伤的进一步发展，并不能够达到修复软骨缺损的目的。E、关节镜下软骨刨削术：单纯使用疗效受到质疑。F、微骨折术：关节透镜下将软骨受损部位移除，在清理过的软骨下方的软骨下骨钻出小孔，含有间充质干细胞的骨髓从孔中渗出，形成血液凝块，成为平滑且坚固的修复组织，代替软骨的作用，这种治疗方法的缺点是形成的纤维软骨与透明软骨有很大差距，其形成初期较脆弱，不能完全替代软骨的作用，易受到负重及大幅活动的影响。G、自体软骨细胞培养移植术:以牺牲自体非负重区软骨为代价，供区并发症多，需体外培养，操作复杂，感染几率大，有细胞退变及遗传学变化风险，需要两次手术，临床价格昂贵（6-10万）。

在申请号为201110021494.8的中国专利申请中公开了使用同种异体脱钙骨修复关节软骨损伤的技术方案，虽然其生物相容性好，无免疫排斥反应，生成的是透明软骨，修复效果较好，但在用于软骨缺损面积过大或损伤周围缺乏正常软骨组织的患者修复进程较慢，且效果不佳。在申请号为201910893393.6的中国专利申请中公开了基于上述专利技术进行优化了的生产工艺，并添加了自体富血小板血浆凝胶，所生成的新生软骨弹性模量和硬度更接近正常软骨，修复区域完整且平整度好，但仍然没有解决大面积缺损修复的问题。

发明内容

为了至少克服现有技术中的缺陷之一，本发明提供了一种修复关节软骨缺损的复合材料及其制备方法。本发明提供的修复关节软骨缺损的复合材料，采用同种异体骨为原材料，在经过一系列工艺后能有效去除免疫原性，减少排异性，并且添加凝胶，能有利于减少炎症反应，促进软骨基质的修复与重建，更能用于修复大面积缺损的患者。

具体地，本发明提供了一种用于修复关节软骨缺损的复合材料，包括同种异体骨和包裹所述同种异体骨的凝胶层；所述同种异体骨经过脱钙处理；所述凝胶层包含硫酸软骨素、透明质酸、氨基葡萄糖以及凝胶介质；所述凝胶层有效成分由10-25重量份的硫酸软骨素、5-10重量份的透明质酸、15-25重量份的氨基葡萄糖和20-40重量份的凝胶介质胶组成；所述凝胶介质选自西黄蓍胶、明胶、淀粉、纤维素衍生物、聚羧乙烯或海藻酸钠中的一种；优选为明胶。

在根据本发明的一个实施方案中，所述凝胶层含有25重量份的硫酸软骨素、5重量份的透明质酸、15重量份的氨基葡萄糖和30重量份的明胶。

本发明的另一方面提供了一种用于修复关节软骨缺损的复合材料的制备方法，包括：

1）制备脱钙后的同种异体骨；

2）称取适量的硫酸软骨素、透明质酸、氨基葡萄糖和明胶，共溶于热水中混匀，温度降至室温即得凝胶；

3）将同种异体骨浸泡于步骤2）制备得到的凝胶中，于2-10℃放置过夜，适当修剪包裹骨块的凝胶厚度；

4）干燥处理并辐照灭菌后即得复合材料。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1）中所述同种异体骨的脱钙处理是通过包括下述步骤的方法实现的：

将同种异体骨浸泡于含有0.1M-0.3M依地酸二钠、pH值6-10的螯合液中，在10-37℃温度下浸泡至同种异体骨的钙含量为0.5%-2%。

在根据本发明的一个实施方案中，所述同种异体骨包含皮质骨和松质骨结构。

在根据本发明的一个实施方案中，所述同种异体骨外面的凝胶厚度为3-10mm。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤4）中所述干燥处理为真空冷冻干燥。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤4）中所述辐照灭菌为钴60辐照灭菌。

本发明还提供了上述复合材料在制备修复关节软骨缺损中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：

本发明采用同种异体骨为骨架材料，添加硫酸软骨素、氨基葡萄糖、透明质酸，能有利于减少炎症反应，促进软骨基质的修复与重建，尤其适用于修复大面积缺损的患者。本发明提供的关节软骨修复材料只需一次手术即可，操作简单，成本低，患者所受痛苦少。

本发明利用1）低分子量硫酸软骨素（3500-5300）机体易吸收，能更好的促进伤口愈合和软骨修复的优点，减轻关节炎的炎症反应，减少溶酶体酶的释放，还具有抗凝血的作用。2）氨基葡萄糖可刺激软骨细胞产生有正常多聚体结构的蛋白多糖，提高软骨细胞的修复能力，促进软骨基质的修复和重建。3）透明质酸可以恢复关节滑液黏弹性和生理稳态等特性。本发明将上述三种成分与同种异体骨支架相结合，发现其具有显著协同的作用，相比于单纯使用同种异体骨支架产品，能够更有利于治疗大面积缺损，缓解骨关节炎，促进软骨下骨修复等优点。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方案中用于修复关节软骨缺损的复合材料的制备方法示意图。

图2为根据本发明的一个实施方案中以不同的组分与脱钙同种异体骨组合形成的复合材料修复后的关节软骨的弹性对比图。

图3为根据本发明的一个实施方案中以不同的组分与脱钙同种异体骨组合形成的复合材料修复后的关节软骨的硬度对比图。

图4为根据本发明的一个实施方案中以不同的组分与脱钙同种异体骨组合形成的复合材料修复关节软骨缺损的效果对比示意图。

图5为根据本发明的一个实施方案中以不同的组分与脱钙同种异体骨组合形成的复合材料修复关节软骨缺损的骨组织显微结构对比示意图。

图6为根据本发明的一个实施方案中以单一活性组分与脱钙同种异体骨组合形成的复合材料修复关节软骨的对比效果示意图。

图7为根据本发明的一个实施方案中以不同的组分与脱钙同种异体骨组合形成的复合材料修复后的关节软骨中新生软骨组织进行硬度测试结果对比示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中修复关节软骨缺损的复合材料，包括：同种异体骨和凝胶层。凝胶层包含硫酸软骨素10-25份、透明质酸5-10份、氨基葡萄糖15-25份和明胶20-40份。

实施例1 制备复合材料

1.制备凝胶

凝胶组分及含量如表1所示。

表1 凝胶组分及含量

按表1中所示，称取硫酸软骨素、透明质酸、氨基葡萄糖和明胶，溶于80-100℃的热水中混匀，溶液温度降至室温时，即得凝胶溶液，备用。

2.制备复合材料

如图1所示：

1）选择含有皮质骨、松质骨结构的同种异体骨；

2）将同种异体骨浸泡于螯合液中进行脱钙处理。螯合液为0.1M-0.3M的依地酸二钠，pH值6-10，温度：10-37℃。螯合脱钙后的同种异体骨的钙含量为0.5%-2%。同时，用原子吸收分光光度计监测脱钙进程，用万能力学试验机检测产品的力学性能。

3）清洗脱钙后的同种异体骨，去除无机盐离子，用电导率仪及紫外分光光度计监测清洗进程；

4）将清洗后的同种异体骨浸泡于上述凝胶溶液中，2-10℃放置过夜，修剪骨块外面的凝胶使之厚度为3-10mm即得复合材料1。本实施例中凝胶厚度为3mm。

5）将复合材料采用真空冷冻干燥。

6）将复合材料进行钴60辐照灭菌后即得到适合于软骨修复的复合材料。

实施例2 不同产品生物力学性能研究

将实施例1中的四种产品植入兔子体内24周后，取材进行生物力学性能检测。

将兔子关节的处理方式：

膝关节常规备皮、消毒、铺单，取正中切口经髌内侧入路进入关节腔，使髌骨向外侧脱位后显露股骨内侧髁。用环钻制造直径为4毫米全层关节软骨缺损。整个实验分成四组，分别在缺损处植入四种产品，24周后取材进行生物力学性能检测。

生物力学性能主要包括弹性模量、硬度试验。其实验结果如表2、图2和图3所示。

表2 生物力学性能检测结果

如表2、图2和图3所示，上述4中产品植入兔子体内24周后，硫酸软骨素含量高的产品弹性模量较高，表明硫酸软骨素可提高新生组织的弹性模量，但相应的硬度略微降低，上述四种产品中，优选产品4。以下实验以实施例1中的产品4进行。

实施例3 复合材料的性能研究

以实施例1中的产品4为例，进行复合材料的性能研究。

实验过程：选用4-6月龄小型猪进行软骨缺损的修复，麻醉、备皮、消毒，切开膝关节露出股骨滑车，在股骨滑车上做直径9mm全层关节软骨缺损。整个实验分为四组：（1）单纯使用硫酸软骨素（CS）、透明质酸（HA）、氨基葡萄糖（GA）组；（2）单纯同种异体骨支架（DCCBM）组；（3）CS+HA+GA+壳聚糖（CTS）凝胶组；（4）DCCBM+CS+HA+GA组。术后6、12、24周取材观察，其实验结果如图4所示；将24周后的膝关节标本的HE染色，其实验结果如图5所示。

从图4中可以看出，单独使用有益因子组（CS+HA+GA）基本上未填充，而在单独的DCCBM组中也观察到不完整的修复，表面覆盖不平坦且较DCCBM+CS+HA+GA组的修复组织更薄。DCCBM+CS+HA+GA组中在修复区域可以看到透明样软骨细胞，修复组织和正常软骨之间具有良好的整合。而CTS+CS+HA+GA组相较单纯的DCCBM组修复效果更差，修复组织更为单薄，未修复的面积较大，表明壳聚糖结合硫酸软骨素、透明质酸、氨基葡萄糖制备的凝胶修复大面积软骨缺损的效果较差。

从图5中可以看出，DCCBM+CS+HA+GA组修复效果更佳，在该组的修复区域内可以看到透明样软骨细胞，修复组织和正常软骨之间具有良好的整合，具有明显的潮线。

实施例4 不同组分的复合材料的性能研究

为证明透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）、氨基葡萄糖（GA）三者的增益作用，分别进行了猪软骨修复试验。分别以单独的活性成分透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）、氨基葡萄糖（GA）与同种异体骨支架（DCCBM）复合进行试验，其实验结果如图6所示。对24周的新生软骨组织进行硬度测试，其实验结果如图7所示。

从图6中可以看出，同种异体骨形成的支架单独结合某一种活性成分（CS、HA或GA），修复效果均较差。三组都比DCCBM+CS+HA+GA修复效果慢，新生软骨组织更为薄弱。

从图7 中可以看出，DCCBM+CS+HA+GA组生成的软骨硬度更为接近正常软骨，表明三者在结合同种异体骨支架修复软骨缺损方面，尤其是提高新生软骨组织硬度方面具有协同作用。

综上，本发明的复合材料不仅生物相容好，无免疫排斥反应，能有利于减少炎症反应，促进软骨基质的修复与重建；生成的是透明软骨修复效果好，而且弹性模量和硬度更接近于正常软骨，修复区域完整且平整度好，能够适用于软骨缺损面积过大（例如直径为达9mm的损伤，相较于现有技术中只能修复直径为4mm的缺损，本发明提供的产品修复面积扩大了4倍）或损伤周围缺乏正常软骨组织的患者；生产工艺简单，取材方便，成本低，使用该复合材料只需一次手术即可，操作简单，能够大幅度地减轻患者所受痛苦。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优良特点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。