一种制备治疗干槽症的复合海绵的方法

摘要

本发明公开了一种制备治疗干槽症的复合海绵的方法，包括将金黄色葡萄球菌细菌壁与海藻酸钠溶液混合，预冻，于冻干机中冻干，制得金黄色葡萄球菌细菌壁海绵；将明胶、壳聚糖、乳酸钙配制成混合溶液；将所述混合溶液加入到金黄色葡萄球菌细菌壁海绵中，预冻后冻干。本发明利用细菌感染后免疫细胞的分型改变，采用金黄色葡萄球菌的细菌壁，以壳聚糖、明胶和海藻酸钠为基质构建复合海绵，研究发现，本发明制备的复合海绵既能够有效调控局部的巨噬等免疫细胞，向促组织修复的分型转化，又能够有效避免细菌感染带来的炎症反应，从而对干槽症起到良好的治疗作用，具有良好的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于干槽症治疗技术领域，具体涉及一种制备治疗干槽症的复合海绵的方法。

背景技术

干槽症是口腔外科拔牙术后常见的并发症之一，以下颌后牙多见，特别是在下颌阻生第三磨牙拔除术后，在正常情况下，即使是翻瓣去骨拔牙手术，其创口的疼痛2～3天后会逐渐消失，如果拔牙后2～3天后出现剧烈的疼痛，疼痛向耳颞部、下颌下区或头顶部放射，用一般的止痛药物不能缓解，则可能发生了干槽症。临床检查牙槽窝内空虚，或有腐败变性的血凝块，呈灰白色。在牙槽窝壁覆盖的破死物有臭味，用探针可直接触及骨面并有锐痛。颌面部无明显肿胀，张口无明显受限，下颌下可有淋巴结肿大、压痛。

传统采用碘仿纱条以防止伤口感染，但采用碘仿纱条存在伤口愈合慢、需再次取出纱条等问题。因此如何既能保留碘仿纱条的防感染作用，又能快速促进伤口愈合并且避免再次取出是治疗干槽症需解决的问题。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

本发明提供一种制备治疗干槽症的复合海绵的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种制备治疗干槽症的复合海绵的方法，其包括，

将金黄色葡萄球菌细菌壁与海藻酸钠溶液混合，预冻，于冻干机中冻干，制得金黄色葡萄球菌细菌壁海绵；

将明胶、壳聚糖、乳酸钙配制成混合溶液；

将所述混合溶液加入到金黄色葡萄球菌细菌壁海绵中，预冻后冻干。

作为本发明所述的制备治疗干槽症的复合海绵的方法的一种优选方案：所述将金黄色葡萄球菌细菌壁与海藻酸钠溶液混合，其混合溶液中，金黄色葡萄球菌细菌壁的质量浓度为0.1％～2％，海藻酸钠水溶液质量浓度为2.5％。

作为本发明所述的制备治疗干槽症的复合海绵的方法的一种优选方案：所述将明胶、壳聚糖、乳酸钙配制成混合溶液；为将1％明胶、1％壳聚糖、0.5％乳酸钙配制成混合水溶液。

作为本发明所述的制备治疗干槽症的复合海绵的方法的一种优选方案：所述进行反应，时间为30min。

作为本发明所述的制备治疗干槽症的复合海绵的方法的一种优选方案：所述将所述混合溶液加入到海藻酸钠海绵中，为将1％明胶、1％壳聚糖、0.5％乳酸钙配制成混合水溶液加入到金黄色葡萄球菌细菌壁海绵中，反应30min，冻干，1％明胶、1％壳聚糖、0.5％乳酸钙混合溶液与金黄色葡萄球菌细菌壁海绵比例为：干重比1:1。

作为本发明所述的制备治疗干槽症的复合海绵的方法的一种优选方案：所述金黄色葡萄球菌细菌壁，其制备方法为将金黄色葡萄球菌接种于液体培养基中培养48h，将含有细菌的液体培养基混悬液分装于离心管中，12000rm离心20min，弃掉上清，取沉淀，用含10mMgSO

本发明的有益效果：本发明利用细菌感染后免疫细胞的分型改变，采用金黄色葡萄球菌的细菌壁，以壳聚糖、明胶和海藻酸钠为基质构建复合海绵，研究发现，本发明制备的复合海绵既能够有效调控局部的巨噬等免疫细胞，向促组织修复的分型转化，又能够有效避免细菌感染带来的炎症反应，从而对干槽症起到良好的治疗作用，具有良好的临床应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为大鼠干槽症图，红色区域为拔牙创感染时情况。

图2为空白对照组、细菌壁海绵组(A组)、无细菌壁海绵组(B组)、碘仿纱条组(C组)在第7、14天时软组织恢复情况对比。

图3为空白对照组、细菌壁海绵组(A组)、无细菌壁海绵组(B组)、碘仿纱条组(C组)局部组织Elisa检查结果。

图4为细菌壁海绵(A组)、无细菌壁海绵(B组)、碘仿纱条(C组)与小鼠RAW264.7细胞孵育24h后细胞PCR检查结果。

图5为细菌壁海绵组治疗后及空白对照组的牙槽窝组织HE染色结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实验动物：雄性SD大鼠60只，体重约140-160g，由徐州医科大学动物实验中心提供，清洁级，标准饲养。该实验方案通过徐州医科大学动物伦理委员会批准。

实验药物分组：A.细菌壁复合海绵：制备质量浓度(g/ml)为0.5％金黄色葡萄球菌细菌壁、2.5％海藻酸钠水溶液共24mL，加入48孔板中，每孔0.5mL，-20℃预冻，冻干机中冻干；质量浓度(g/ml)为1％明胶、1％壳聚糖、0.5％乳酸钙混合水溶液共24mL，混合后加入金黄色葡萄球菌细菌壁和海藻酸钠海绵中，每块海绵0.5mL，反应30min，-20°预冻，冻干。B.无细菌壁海绵：2.5％海藻酸钠溶液，-20°预冻，冻干机中冻干；制备1％明胶、1％壳聚糖、0.5％乳酸钙混合液，加入海藻酸钠海绵中，反应30min，-20°预冻，冻干。C.碘仿纱条。

0.5％金黄色葡萄球菌细菌壁的制备方法为：将金黄色葡萄球菌(ATCC6538)接种于液体培养基中(每升接种1×10

大鼠干槽症模型建立：使用4％水合氯醛腹腔注射(1ml/100g)SD大鼠，待麻醉后用探针分离牙龈，挺出上颌左右第一磨牙,并搔刮破坏牙槽窝骨壁，扩大创伤。用以浸有1:1000盐酸肾上腺素的棉塞置入拔牙窝1-2min,使牙槽窝内血管收缩，停止渗血后，将蘸有饱和的金黄色葡萄球菌菌种的棉塞放入拔牙创内2min。待动物苏醒后，返回动物房，断水0.5h后常规饲养。感染3-4天后，大鼠拔牙创牙槽窝被黄色低灰色坏死组织层覆盖，周围粘膜红肿,创口无明显缩小即为模型感染成功。

治疗：第四天将大鼠随机分为3组，每组20只，A组使用细菌壁海绵，B组使用无细菌壁海绵，C组使用碘仿纱条。大鼠一侧作为空白组，不予治疗，一侧作为治疗组，清除腐败坏死组织，使用浸有3％过氧化氢溶液的棉球与生理盐水的棉球交叉清理牙槽窝至干净无异味，然后按照分组放入药物。3天后检查药物在伤口内情况，若脱落则重新治疗。1周时将碘仿纱条取出。

观察指标：1.拔牙创面积测量：在治疗后的7d，10d，14d时肉眼观察并记录创口愈合情况，测量创口最大长(L)和宽(W)，测量三次取平均值，创口面积变化S＝L*W/(L

2.He染色：4％多聚甲醛固定2-3天后用10％EDTA脱钙液脱钙2-3周，期间2-3天需更换一次脱钙液，当标本肉眼观为半透明，手感有弹性，且探针可顺利刺入骨组织，即为脱钙完成。石蜡包埋，沿着颌骨长轴方向作矢状连续切片，厚度5μm，每一组切片取基本相同的三个位置备用。光镜下观察牙槽窝组织学改变。

3.Elisa测定：干槽症模型治疗14天后，将局部组织匀浆，1000rpm离心20分钟，取上清。将Elisa试剂盒(酶标生物)取出，置于室温下复温20分钟，取50μL不同浓度的标准品加入孔板中，同时采用样品稀释剂将样品稀释4倍加入孔板中，除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱孵育60min，孵育完成后弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满稀释20倍的洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此反复洗板5次，洗板完成，每孔加入底物A、B各50μL，37℃下避光孵育15min，最后每孔内加入终止液500μL，在15min内于450nm波长下测定各孔的OD值。

4.PCR测定：将小鼠RAW264.7巨噬细胞接种于6孔板中，将细菌壁复合海绵、无细菌壁海绵以及碘仿纱条分别与巨噬细胞孵育24h，每孔加海绵或纱条0.1g。24h后，加入适量RNAisoplus后吹打裂解细胞，静置5分钟，加入1/5裂解液体积的氯仿，震荡混匀后静置5分钟，4℃下12000g离心15分钟。取上清，加入0.5-1倍裂解液体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟，4℃下12000g离心10分钟，取沉淀，用与裂解液等体积的75％乙醇清洗沉淀，4℃下7500g离心5分钟，弃上清给，取沉淀，于室温下干燥，得RNA提取物。将上述RNA提取物溶于一定量无核酶水，于RNA浓度测定仪下测量RNA浓度，按逆转录试剂盒说明配制逆转录反应液，加入含有一定量RNA的样品，混匀，于RNA逆转录合成仪中按37℃反应15分钟，85℃，5秒，4℃循环一次的条件合成cDNA。按10μL体积系统，于96孔板中分别加入cDNA样品、引物、荧光溶液与无核酶水，封板膜封板，3500rpm，4℃下离心5分钟，使用PCR检测仪检测各组细胞因子的表达。引物序列如下：

肉眼观察结果：拔牙后第4天，肉眼可见牙槽窝表面有灰黄色坏死组织层覆盖，周围牙龈红肿，探之可出血(图1，大鼠干槽症，红色区域为拔牙创感染时情况)。大鼠全身情况略有不佳，毛发相较之前光泽降低，进食略减少。

治疗后观察，图2可见：空白对照组仍有较大创面，治疗组创口炎症均减退，随时间创口逐渐愈合，面积缩小。7天时，空白对照组愈合缓慢，拔牙创面积仍然较大，三组治疗组之间愈合速度细菌壁海绵(A组)>无细菌壁海绵组(B组)>碘仿纱条组(C组)。14天时，空白对照组仍有明显创面，细菌壁海绵组创面基本完全愈合，拔牙创内可见肉芽组织，无细菌壁海绵组和碘仿纱条组仍有创面未愈合。

表1拔牙创面积测量

图3为14天时干槽症部位Elisa检查结果。结果从细胞因子的蛋白水平证明了相比碘仿纱条和无细菌壁海绵组，细菌壁复合海绵显著提高了干槽症部位抑炎因子(IL-10和ARG-1)的蛋白水平，降低了其促炎因子(TNF-ɑ和iNOs)的蛋白水平，表明细菌壁复合海绵对干槽症具有良好的抑炎效果。

图4为将海绵与小鼠RAW264.7巨噬细胞共孵育24h后细胞PCR检查结果。结果表明相比碘仿纱条组(C组)，细菌壁复合海绵组(A组)和无细菌壁海绵组(B组)均显著提高了RAW264.7细胞的抑炎因子(IL-10和ARG-1)的基因表达量，其中细菌壁复合海绵组二者显著高于无细菌壁海绵组。而细菌壁复合海绵组的促炎因子(TNF-ɑ和iNOs)RNA表达显著低于其余三组。以上结果表明细菌壁复合海绵可能是通过改变巨噬细胞分型，提高巨噬细胞抑炎因子的RNA表达，降低其促炎因子的RNA表达，从而发挥对干槽症的治疗作用。

图5为细菌壁海绵组治疗后及空白对照组的牙槽窝组织HE染色结果，空白对照组1周时炎症较重，牙槽窝内有大量中性粒细胞，淋巴细胞浸润，表面有炎性渗出。复合海绵组上皮连续性基本恢复，炎症较空白对照组明显减轻，范围减小，周围开始出现纤维结缔组织增生。2周时空白对照组黏膜上皮连续性仍未完全恢复，而复合海绵组上皮完整，炎症更局限范围更小，牙槽窝内纤维结缔组织增生。

本发明利用细菌感染后免疫细胞的分型改变，采用金黄色葡萄球菌细菌壁制备复合海绵，研究发现，本发明制备的复合海绵既能够有效调控局部的巨噬等免疫细胞，向促组织修复的分型转化，又能够有效避免细菌感染带来的炎症反应，从而对干槽症起到良好的治疗作用，具有良好的临床应用价值。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。