一种贪铜菌及贪铜菌制剂和贪铜菌制剂在重金属污染土壤修复中的应用

摘要

本发明公开了一种贪铜菌及贪铜菌制剂和贪铜菌制剂在重金属污染土壤修复中的应用。贪铜菌(Cupriavidus sp.)能耐受重金属离子、吸附重金属离子、增加土壤水相微环境的pH和产生具有氮磷缓控释肥作用的鸟粪石，将其用于重金属污染土壤修复，特别是镉污染土壤修复，不但可以通过吸附和沉积固定土壤中镉离子，减少土壤镉的生物有效性，而且可以提高土壤肥力，解决土壤酸化等技术问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种贪铜菌，还涉及包含贪铜菌的制剂及其在镉污染土壤中的应 用，贪铜菌具有高效耐重金属、自诱导pH增加而提高重金属离子的吸附、积累 和沉淀，以及伴随产生具有氮磷缓控释肥作用的磷酸铵镁(俗称鸟粪石)，特别 适合镉污染土壤的修复。属于重金属污染环境微生物治理技术领域。

背景技术

现有的农田重金属污染以镉(Cd)污染为主，特别是农田的酸化进一步提 高了重金属污染耕地土壤中重金属的活度、迁移和扩散能力，导致重金属生物有 效性的增强。这加剧了土壤的重金属污染，危害了安全农产品的生产和民众健康。 我国人多地少，为了保证粮食充足且质量安全和如期实现《土壤污染防治行动计 划》要求的在2020年前污染耕地的安全利用率达到90％以上和2030年前污染耕 地的安全利用率达到95％以上的目标，亟需探索更加经济、高效、安全和绿色的 耕地土壤重金属污染修复技术。

当前，我国常用的农田污染修复技术主要集中在物理技术、化学技术、生物 技术和农艺修复措施等4方面。物理和化学修复技术因成本高、易造成二次污染 和改变土壤生态等原因，难见于重金属污染农田的修复。农艺修复虽然简单可行， 但对田间管理和农民的种田技术要求较高，大规模的重金属污染农田修复也比较 少见。生物修复，特别是微生物修复技术因具有原位修复、廉价和环境友好等优 点，逐渐受到重视。如中国专利(CN107815428 A)公开了一株镉(Cd)去除根瘤 菌(Rhizobium pusense)KG2、含有所述根瘤菌的菌剂及其在固定或去除土壤或水 体中Cd²⁺的应用。其具体公开瘤菌KG2具有高效Cd固定能力和较强的固氮功>

发明内容

针对现有生物技术修复重金属污染土壤存在的上述不足，本发明的第一个目 的在于提供一种能耐受重金属离子、吸附重金属离子、增加土壤水相微环境的 pH和产生具有氮磷缓控释肥作用的鸟粪石的贪铜菌Cd02(Cupriavidus sp.Cd02)。

本发明的第二个目的是在于提供一种包含上述贪铜菌Cd02的制剂。

本发明的第三个目的是在于提供一种包含贪铜菌Cd02的制剂在重金属污染 土壤修复中的应用，贪铜菌Cd02能耐受重金属离子，同时可以吸附重金属离子， 并且释放碱性物质增加土壤水相微环境的pH来沉积和固定重金属离子，以及产 生具有氮磷缓控释肥作用的鸟粪石；因此，贪铜菌Cd02不但可以吸附和固定农 田土壤中的重金属离子，还可缓解土壤的酸化，提高土壤肥力。

为了实现上述目的，本发明提供了一种贪铜菌Cd02(Cupriavidus sp.Cd02)， 其保藏编号为CCTCC NO:M 2018127。本发明的贪铜菌于2018年3月13日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018127，保藏地址 为湖北省武汉市武昌区八一珞珈山。

本发明还提供了一种贪铜菌制剂，其包含保藏编号CCTCC NO:M 2018127 的贪铜菌。

优选的方案，贪铜菌制剂还包含营养液。优选的营养液包含以下组分： K₂HPO₄、NH₄Cl、Na₂SO₄、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O和乳酸钠。进一步优选，>2HPO₄、0.5～1.2g>4Cl、0.6～1.3g>2SO₄、>2·2H₂O、1.5～2.5gMgSO₄·7H₂O及1.5～2.5g乳酸钠。培养液为贪>

优选的方案，贪铜菌制剂中贪铜菌的浓度为0.93～1.86g/L。

本发明还提供了贪铜菌制剂的应用，其作为重金属污染土壤修复制剂应用。

优选的方案，所述贪铜菌制剂添加至重金属污染土壤中吸附重金属离子及生 成碱性物质提高土壤环境pH沉积重金属离子，同时生成具有氮磷缓控释肥作用 的磷酸铵镁。贪铜菌其本身可以吸附重金属离子，同时又可以提高土壤pH来固 定沉积重金属离子，两者协同作用明显，大大提高对土壤中游离重金属离子的去 除效率。优选的重金属离子为镉离子。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益效果：

本发明的贪铜菌Cd02能高效耐受重金属离子，特别是对重金属镉离子耐受 性好，如镉离子浓度85mg/L是贪铜菌可以耐受的镉离子浓度。

本发明的贪铜菌Cd02在土壤溶液培养体系中培养过程中，在一个星期内， 可以将体系的pH从7.5升高到8.6。通过提高环境体系pH可以促进重金属离子 在土壤水相中沉淀，有效降低了镉离子的生物有效性。土壤水相溶液体系的pH 是影响重金属镉有效性所有参数中的最重要因子，土壤pH值越低，镉等重金属 离子可迁移性越高、毒性也就越大，因此，提高土壤水相溶液体系的pH，可以 降低土壤有效态镉含量，促进土壤镉的可利用态持续向难利用态或残渣态转化， 这就阻断了镉向作物迁移的可能，从而降低了作物中的镉的含量，保证了农产品 的安全生产。

本发明的贪铜菌Cd02在土壤溶液培养体系中可以诱导生成具有氮磷缓控释 肥作用的磷酸铵镁(俗称鸟粪石)生成。

本发明的贪铜菌Cd02制剂特别适合用于重金属污染农田土壤的修复，在适 当的培养液体系中，贪铜菌Cd02可以吸附土壤溶液体系中的重金属离子，实现 重金属离子在菌体上的吸附和积累，同时可以增加土壤水相微环境pH值，环境 pH值提高可以加速重金属离子的沉淀，从而土壤中游离重金属离子大幅度降低， 有效防止重金属离子在农作物中的富集，而且环境pH值提高可以改善土壤酸性 环境，解决土壤酸化的问题；特别是贪铜菌可以诱导土壤溶液体系中氮磷缓控释 肥作用的磷酸铵镁(俗称鸟粪石)的产生，可以提高土壤肥力，提高农作物产量。

附图说明

【图1】为本发明的贪铜菌Cd02菌株在无镉的LB固体培养基30℃培养48h的 菌体的革兰氏染色图。

【图2】为本发明的贪铜菌Cd02菌株在含镉离子浓度为85mg/L的营养液中30℃ 培养48h的图像(图2A)和革兰氏染色图(图2B)以及在含镉离子浓度为200 mg/L的营养液中30℃培养48h的图像(图2C)和革兰氏染色图(图2D)。

【图3】为本发明的贪铜菌Cd02菌株30℃培养在含不同镉离子浓度(0mg/L、 2mg/L、4mg/L和6mg/L)营养液中的600nm光密度变化图(OD₆₀₀)。

【图4】为本发明的贪铜菌Cd02菌株16Sr DNA基因系统发育树图。

【图5】为本发明的贪铜菌Cd02菌株30℃培养在含不同镉离子浓度(0mg/L、 2mg/L、4mg/L和6mg/L)营养液中的pH变化图(A)和在培养第六天的产碱 能力图(B)。

【图6】为本发明的贪铜菌Cd02菌株对镉离子的吸附和积累实验结果图，(A) 2mg/L镉离子(B)4mg/L镉离子(C)6mg/L镉离子(D)8mg/L镉离子。

【图7】为本发明的贪铜菌Cd02菌株在培养期间生成磷酸铵镁(俗称鸟粪石)的 XRD图。

【图8】为本发明的贪铜菌菌株在培养期间生成沉淀的TEM图。

【图9】为本发明的贪铜菌Cd02菌株在培养期间生成沉淀的XPS图谱(A)和 沉淀酸溶出曲线图(B)。

具体实施方式

下面利用实施例及附图对本发明做进一步的详细描述，但本发明的权利要求 保护范围不限于此。

实施例1

耐镉菌株贪铜菌Cd02的分离、筛选与耐镉能力验证

该菌株是从镉污染土壤样品中分离、筛选和纯化后获得的。具体方法如下： 取上述土壤样品1g，加入100mL无菌水，置转速150rpm的恒温摇床中振荡 24h后，静置30min，取1mL上清液涂布于含有100mg/L的含镉固体LB培养 基中，待周围有菌体长出，挑取菌体在固体LB培养基中划线，放入恒温培养箱 培养24h后观察菌落形态，并将长出的单个菌落划线至新鲜的LB固体平板上培 养，得到纯菌株，命名为Cd02。最后将Cd02菌株划线于斜面试管，置恒温培养 箱中30℃培养24h后，于4℃的冰箱中保存。本实施例1中的LB培养基配方 为：蛋白胨1g，NaCl 1g，酵母粉0.5g，琼脂粉2g，超纯水100mL，pH 7.0， LB培养基于121℃、1个大气压下灭菌20分钟后，备用。

Cd02菌的菌落形态体征如下:Cd02菌在LB固体培养基上培养24h后，形 成直径1cm左右的小菌落，湿润，不透明，表面光滑。革兰氏染色后镜检呈红 色(图1)，属革兰氏阴性菌。

为了验证该菌株Cd02的耐镉能力，挑取无镉LB固体平板上的单个菌落至 含镉浓度分别为20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的LB液体培养基中， 置转速150rpm，温度为30℃的恒温摇床中振荡48h后，Cd02菌都能生长，如 图2(A)是含镉浓度为200mg/L时的Cd02菌液，并取含200mg/L镉离子浓度 的LB液体培养基中的Cd02菌进行革兰氏染色并观察其形态，镜检后呈红色， 菌体形态变长，但染色不明显(图2B)。挑取LB固体平板上的单个菌落至含镉 离子浓度为85mg/L的营养液(每升培养溶液含有：0.5g K₂HPO₄、1g>4Cl、 1g>2SO₄、0.1g>2·2H₂O、2g>4·7H₂O、2g乳酸钠)中，置转速150rpm，>

接种2％(菌体浓度0.93～1.86g/L)的生长对数期的Cd02菌悬液到营养液 (每升培养溶液含有：0.5g K₂HPO₄、1g>4Cl、1g>2SO₄、0.1g>2·2H₂O、 2g>4·7H₂O、2g乳酸钠)中，营养液中镉离子浓度分别设置为0mg/L、2>600)。>

该菌株Cd02的16S rDNA基因序列特征：提取该菌株的细菌基因组DNA， 以该菌株的基因组DNA为模板，以用通用引物27F和1492R扩增该菌株的16S rDNA基因。PCR扩增体系：2μL 27F引物(10μmol/L)，2μL 1492R引物(10 μmol/L)，1μL该菌基因组DNA，25μL PCR扩增液，20μL ddH₂O，27F序列为>

TTGCGGTTAGGCTAACTACTTCTGGCAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGTAGTCGAGTTGCAGACTACGATCCGGACTACGATGCGTTTTCTGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTACGCACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCTTTCGTAGCAACTAGAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCCACTTTCCCTTTCGGGCACCTAATGCATCTCTGCTTCGTTAGTGGCATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTGAAGAAATGAATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTGACGTCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGACATACTCTAGCCTTGCAGTCACAAGCGCCATTCCCAAGTTGAGCTCGGGGATTTCACGCCTGTCTTACAAAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCGACCCCAGGTATTAACCCGGGCCATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCTTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGACATCGGCCGCTCCTGTAGCGCGAGGCCTTGCGGTCCCCCGCTTTCACCCTCAGGTCGTATGCGGTATTAGCTAATCTTTCGACTAGTTATCCCCCACTACAGGGCACGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGGTTG。

将该菌株的16S rDNA部分序列提交到NCBI Genbank，获得登录号 MG754454.1。

将该菌株的16S rDNA部分序列在NCBI Genbank上的相关细菌的16S rDNA 序列进行BLAST比对，并进行同源性分析，结果表明，该菌株与贪铜菌的同源 性最高，相似度在99％以上，结合形态特征、培养特征以及16S rDNA序列分析， 该菌株确定为贪铜菌。

该菌株的16S rDNA部分序列与Genbank中的相应菌株序列利用Cluster X 方法进行比对，使用MEGA7.0软件按邻接法构建系统发育树，基于1000次重 复的抽样分析。构建得到的该菌的16S rDNA系统发育树如图4所示。

实施例2

贪铜菌Cd02培养过程中培养介质pH的变化以及其产碱能力。

接种2％(菌体浓度0.93～1.86g/L)的生长对数期的Cd02菌悬液到营养液 (每升培养溶液含有：0.5g K₂HPO₄、1g>4Cl、1g>2SO₄、0.1g>2·2H₂O、 2g>4·7H₂O、2g乳酸钠)中，镉离子浓度分别设置为0mg/L、2mg/L、4mg/L、>

实验结果如图5(A)所示，在无镉培养液中随时间的增加pH在上升，在 培养后期达到8.6；在含镉培养液中随镉浓度的增大，培养液的pH也随培养时 间的增加而增加，在培养后期pH可增加到8.6左右，说明该菌在培养期间产碱。

在培养后期(144h)从每个浓度中取20mL进行双指示法滴定确定产碱量， 用移液管分别移取20mL的0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L培养液置于250mL 锥形瓶中，分别滴加酚酞3滴，用标准浓度的HCl(0.1mol/L)进行滴定，滴定至 红色褪为无色，分别记录滴加HCl的体积V₁、V₂、V₃、V₄，再分别滴加甲基>5、V₆、V₇、V₈最后以此确定产碱量。实验结果如图5(B)所示，镉离子0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L时，Cd02菌株的产碱量分别为0.143mol/L、>

实施例3

贪铜菌Cd02对重金属镉离子的吸附和积累。

接种2％(0.93～1.86g/L)的生长对数期的Cd02菌悬液到含镉的培养液(每 升培养溶液含有：0.5g K₂HPO₄、1g>4Cl、1g>2SO₄、0.1g>2·2H₂O、2g>4·7H₂O、2g乳酸钠)中，镉离子浓度分别设置为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L，置转速150rpm>

实验结果如图6所示，在培养期间，当pH值7.5升高8.6时，因H⁺浓度的>

实施例4

贪铜菌Cd02在培养体系促进碳酸镉形成并产生鸟粪石(磷酸铵镁)。

接种2％(0.93～1.86g/L)的生长对数期菌体到含镉离子8mg/L的培养液(每 升培养溶液含有：0.5g K₂HPO₄、1g>4Cl、1g>2SO₄、0.1g>2·2H₂O、2g>4·7H₂O、2g乳酸钠)中，96h后将培养物离心后，获得该镉浓度影响下>

图7和图8分别是X射线衍射(XRD)图谱和透射电子显微镜(TEM)图像， 根据图7和图8可知，Cd02菌转化生成了一种名为鸟粪石的缓释肥磷酸氨镁， 属于无定型沉淀。在水中、土壤水相中磷酸铵镁微溶于水，氮磷养分释放速率比 其它可溶肥慢，故可作缓释肥。

图9(A)为X射线光电子能谱分析(XPS)图谱，由图9(A)的分峰图可 知，沉淀中含有CdCO₃。考虑Cd02菌由于提高土壤水相pH而生成的CdCO₃沉>

序列表

<110> 湘潭大学

<120> 一种贪铜菌及贪铜菌制剂和贪铜菌制剂在重金属污染土壤修复中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

aaggtgatcc agccgca 17

<210> 3

<211> 1363

<212> DNA

<213> 贪铜菌(Cupriavidus sp.)

<400> 3

ttgcggttag gctaactact tctggcaaaa cccactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt 60

acaagacccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccagc 120

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