一种利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法

摘要

本发明提供了一种利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法，包括以成熟合子胚的靠近胚轴端1/2子叶为胡桃楸外植体；消毒后在不定根诱导培养基与优化培养基培养，获得胡桃楸不定根；并在生物反应器对胡桃楸不定根进行扩大培养。使用本发明的方法可以提高胡桃楸不定根的增殖速度，在短期内获得大量的不定根，增殖系数13.59；同时可减少培养基成本，又降低劳动强度和生产成本，解决目前人工破坏性采集、挖掘胡桃楸及短期大量培育难度大的问题，为商业化生产提供一种新的途径。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法。

背景技术

胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)又名核桃楸，胡桃科胡桃属落叶乔木，是我国东北珍贵的“三大硬阔”树种之一。目前，胡桃楸已被列为中国国家Ⅱ级珍稀树种和中国珍稀濒危树种的三级保护植物。胡桃楸主要分布于我国的大、小兴安岭、完达山脉、长白山区及辽宁东部、华北地区，俄罗斯远东地区、朝鲜北部和日本也有零星分布。其材质坚硬致密，纹理通直美观，未成熟外果皮、根(枝)皮、外壳及叶片均可入药，用途广泛，经济价值高。

随着人民生活质量的日益提高、居住环境如“雾霾”等因素影响着人民、疾病频繁高发，人们对中药保健、治疗越来越重视，而胡桃楸树皮、树叶、果皮等多部位具有清热解毒、抗菌消炎、抗癌等多种功效，民间流传着六月六采胡桃楸来祛病的传说，其市场需求越来越大。然而，多年来的过量采伐和利用，胡桃楸野生资源遭到严重地破坏；胡桃楸有性繁殖与无性繁殖(扦插与组织培养)种子发芽率低、扦插生根率低、组织培养中增殖系数低、体系不健全等多原因，也制约了人工栽培的发展。

通过植物组织培养技术获得的培养物，并以培养物代替其野生、栽培植株成为药源，是实现胡桃楸资源可持续利用的有效方式之一，在生产中具有重要实际应用价值，在科学基础研究上，为以后生物制药工程提供了资源、对开展新的次生代谢合成及合成途径等研究都奠定了基础。

生物反应器最初是应用在微生物发酵或细胞培养中，与微生物发酵或细胞培养相比，植物器官的培养更为复杂，因此植物器官培养较为困难，至今尚未有利用生物反应器培养胡桃楸营养器官的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法，包括以下步骤：

1)以选择胡桃楸外植体；

2)消毒胡桃楸外植体，并用无菌水冲洗；

3)使用胡桃楸不定根诱导培养基培养胡桃楸外植体；

4)使用胡桃楸优化培养基继续培养胡桃楸外植体，获得胡桃楸不定根；

5)在生物反应器对胡桃楸不定根进行扩大培养即得。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，所述胡桃楸外植体为成熟合子胚的靠近胚轴端1/2子叶。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，所述消毒胡桃楸外植体的方法为70％乙醇浸泡30秒2次，然后用0.1％的升汞HgCl₂溶液消毒10分钟。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，所述胡桃楸不定根诱导培养基配方为硝酸铵354.0～360.0mg/l，硫酸镁90.37～91.37mg/l，磷酸二氢钾66.25～67.25mg/l，硫酸钾389.75～390.00mg/l，二水氯化钙28.125～30.00mg/l，硝酸钙85.44～86.44mg/l，硼酸4.8～5.5mg/l，五水硫酸铜0.25～0.30mg/l，Na2-EDTA 45.4～47.00mg/l，七水硫酸铁33.8～35.00mg/l，硫酸锰33.5～34.5mg/l，钼酸钠0.39～0.51mg/l，六水硫酸镍0.005～0.006mg/l，六水硝酸锌17.0～18.0mg/l，肌醇100～101mg/l，盐酸硫胺素1.0～1.2mg/l，盐酸吡哆醇1.0～1.2mg/l，烟酸1.0～1.2mg/l，生物素0.22～0.32mg/l。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，所述优化培养基为在所述不定根诱导培养基中添加吲哚乙酸0.5-2.0mg/ml，琼脂6.0g·L^-1，添加蔗糖30％g·L^-1。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，在所述优化培养基中培养条件为采用避光培养，培养温度为25±2℃；在培养30天不定根生根率达97.0％。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，在所述生物反应器扩大培养的条件为：5L气升式生物反应器接种20-30g鲜重的不定根，在生物反应器中加入2L的增殖培养基，增殖培养周期以40天。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，所述增殖培养基配方为在所述不定根诱导培养基中附加20-30％重量蔗糖。

优选地，本发明所述的利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法中，所述增殖培养的条件为通气量设置为50m/min(空气体积)，温度为25±2℃,转速为110r/min，PH为5.8。

本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明可以提高增殖速度，在短期内获得大量的不定根，增殖系数13.59(20g鲜重不定根40d培养获得的273.8g)。

(2)生物反应器培养可减少培养基成本，又降低劳动强度和生产成本，解决目前人工破坏性采集、挖掘胡桃楸及短期大量培育难度大的问题，为商业化生产提供一种新的途径。

附图说明

图1为本发明的一个实施例中以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根的胡桃楸不定根示意图；

图2为本发明的一个实施例中的以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根培养7天后的胡桃楸不定根示意图；

图3为本发明的一个实施例中的以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根培养14天后的胡桃楸不定根示意图；

图4为本发明的一个实施例中的以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根培养21天后的胡桃楸不定根示意图；

图5为本发明的一个实施例中的以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根培养1个月后的胡桃楸不定根示意图；

图6为本发明的一个实施例中的以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根培养1个月后的胡桃楸不定根示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1利用生物反应器培养胡桃楸不定根的方法

(1)2017年9月，采集黑龙江省哈尔滨地区帽儿山实验林场内的胡桃楸成熟种子用于诱导不定根培养的材料；如图1所示，以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根。

(2)用70％乙醇浸泡30秒2次，然后用0.1％的升汞HgCl₂溶液消毒10分钟(期间不定时摇晃)，用无菌水冲洗5-7次，备用；

(3)胡桃楸不定根诱导培养基配方为(mg/l)：硝酸铵354.0，硫酸镁90.37，磷酸二氢钾66.25，硫酸钾389.75，二水氯化钙28.125，硝酸钙85.44，硼酸4.8，五水硫酸铜0.25，Na₂-EDTA>

(4)在不定根诱导培养基中添加吲哚乙酸0.5-2.0mg/ml，琼脂6.0g·L^-1，添加蔗糖30g·L^-1，混合后的优化培养基的PH值调节至5.8；采用避光培养，培养温度为25±2℃；在培养30天不定根生根率达97.0％。

(5)生物反应器扩大培养：5L搅拌式生物反应器(Electrolab FerMac 320)接种步骤(4)获得的20-30g鲜重的胡桃楸不定根(将诱导出的胡桃楸不定根切成1cm大小)，生物反应器中含有4L的增殖培养基，所述增殖配方为步骤(3)不定根诱导培养基中添加20-30g·L^-1蔗糖。通气量设置为50m/min(air>

(6)实验结果

以靠近胚轴端的1/2子叶为外植体诱导不定根，接种7d左右在外植体伤口处出现愈伤组织(图2)，14d左右愈伤组织表面产生出现少量白色不定根(图3)，21d左右外植体表面也开始形成松散、粘稠的愈伤组织，不定根继续生长(图4)，等到一个月后大量不定根附着在外植体表面(图5、6)。

将获得的胡桃楸不定根20g(鲜重)接种在含有4L增殖培养基(其中，IBA 0.5mg/mL，蔗糖30g/L)的生物反应器中()，培养1周左右时几乎没有太大变化，l0d左右开始不定根膨大变粗，到15d时，不定根开始分化出细根，18d浮于液面上，不定根颜色较白，35d之后不定根生长缓慢，在第40d时鲜重达到273.8g，干重达到最大26.3g。随后，随着天数的增加，不定根开始褐化，其不定根的鲜物重和干物重逐渐降低，干物重在40d时达到最大。

其中，20g鲜重胡桃楸不定根在生物反应器中培养40d鲜重达273.8g，增殖系数13.59；而不经过生物反应器增殖培养增殖系数仅为0.06-0.1。

因此，本发明可以提高增殖速度，在短期内获得大量的不定根。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。