用于猕猴桃金桃品种鉴定的分子标记引物及应用

摘要

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物及应用，所述的引物为：Geo28‑113‑F:TGAGGTGAATGGTAGCAGCA和Geo28‑113‑R:GTATTGCAACAAAAGGTGCG。利用本发明提供的引物对金桃DNA进行扩增，仅金桃可特异性的扩增出261bp和265bp的条带；根据不同条带的大小和数目，也可对：‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘H‑15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金霞’‘金艳’、‘金圆’、‘金玉’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘QS‑5’、‘通山5号’、‘WH‑1’、‘厦亚1号’、‘新观2号’或‘西选1号’猕猴桃进行区分。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物及应用。

背景技术

中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃遗传资源的原始起源中心。近年来，我国猕猴桃产业稳步扩增，截至2017年全国栽培面积达240万亩，产量290万吨，均居世界首位。在品种格局上，我国立足于本土猕猴桃遗传资源研究，选育出了‘金艳’、‘金桃’等猕猴桃新品种，在全球范围广泛栽培，彻底改变了世界猕猴桃产业唯‘海沃德’品种的单一格局，推动了猕猴桃市场多样化和消费的多元化。

随着猕猴桃新品种的日益推出，新品种的鉴定是亟待解决的一大难题。目前，对猕猴桃专利品种的鉴定仅通过树势、叶片形态、花期、花形态、果实外观等传统手段，难免受到环境和其他人为因素的影响。对猕猴桃品种的不确定性，限制了产业的健康持续发展，且苗木品种不纯甚至错误将造成果农经济效益严重受损。

分子标记技术能快速、准确、高效对品种进行鉴定,对保证农业生产中品种的正确性具有重要的意义。选择适宜的分子标记及其配套检测技术,建立一套简便、经济、准确而高效的品种鉴定和指纹图谱技术体系,是打击假冒伪劣种苗、保护植物遗传育种工作者和农民的合法权益，规范我国农业市场的迫切需要。

分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异，从而对不同个体进行区分，是继形态标记和生化标记之后，发展的一种较为理想的遗传标记。在植物种质资源鉴定及育种中，对分子标记的应用已日趋成熟。SSR分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组，呈共显性，等位变异高，操作简便且稳定性好，已应用于大豆、苹果和葡萄等品种鉴定方面。在猕猴桃中，分子标记技术应用于猕猴桃雄性系列品种的鉴定，已为多个优异猕猴桃品种准确提供授粉雄株，提升猕猴桃的育种效率。

‘金桃’于2005年通过国家品种审定(S-SV-AC-018-2005)，在世界猕猴桃主要生产国或区域申请了植物新品种权保护。‘金桃’猕猴桃果实为短圆柱形，单果重在80-100克，成熟时果面光洁无毛，外观漂亮。果肉质地脆，多汁，酸甜适中，果心小而软，果实耐藏性好，且贮藏中Vc损失少。‘金桃’表现高产、耐贮、品质优，在意大利、智利和南非等国广泛推广种植。开发适用于猕猴桃‘金桃’品种的分子鉴定标记，有利于从分子水平上明确界定专利品种，利于对猕猴桃品种进行鉴定和品种保护。

发明内容

本发明的目的在于利用分子标记技术，提供一种用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物，所述的分子标记命名为Geo28-113，针对其设计的引物为Geo28-113-F:TGAGGTGAATGGTAGCAGCA和Geo28-113-R:GTATTGCAACAAAAGGTGCG。

本发明的另一个目的在于提供了用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物的获得：申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSRFinder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘金桃’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo28-113，针对其设计的引物为Geo28-113-F:TGAGGTGAATGGTAGCAGCA和Geo28-113-R:GTATTGCAACAAAAGGTGCG。

用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用，包括利用本发明的引物用于猕猴桃的育种，或是利用本发明的引物对猕猴桃品种，特别是‘金桃’的品种进行鉴定，仅金桃可特异性的扩增出261bp和265bp的条带；或是根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘H-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金霞’、‘金艳’、‘金圆’、‘金玉’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’、‘厦亚1号’、‘新观2号’或‘西选1号’猕猴桃进行区分。

与现有技术相比，本发明的优点：

1.形态标记简单直观，但是数量少、多态性差、易受环境条件影响。分子标记操作简便，在植物体的各个组织和发育时期，均可检测，不受季节和环境限制。数量多，遍及整个基因组。多态性高，品种间存在许多等位变异。

2.本发明的引物可在猕猴桃系列品种中扩增得到不同大小的DNA片段。该分子标记扩增稳定性，能用于进行猕猴桃‘金桃’品种的鉴定。

3.本发明提供的分子标记引物特异性高，适用范围广，可从40多个不同品种的猕猴桃中对‘金桃’品种进行鉴定，利用分子标记Geo28-113引物对‘金桃’DNA进行扩增，仅金桃可特异性的扩增出261bp和265bp的条带。

4.除了根据特异性条带鉴定‘金桃’品种，还可根据条带大小和数目对‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘H-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金霞’‘金艳’、‘金圆’、‘金玉’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’、‘厦亚1号’、‘新观2号’或‘西选1号’猕猴桃进行区分。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。

实施例1：

用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物的获得：

申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过SSR Finder软件在全基因组范围内开发SSR标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计SSR标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘金桃’品种进行PCR扩增，筛选得到分子标记Geo28-113，针对其设计的引物为Geo28-113-F:TGAGGTGAATGGTAGCAGCA和Geo28-113-R:GTATTGCAACAAAAGGTGCG。

实施例2：

用于猕猴桃‘金桃’品种鉴定的分子标记引物在品种鉴定中的应用：

(1)按照CTAB法分别提取40多个不同品种猕猴桃的DNA样品(具体品种名称如表1所示)。

(2)使用加样器吸取990ul HIDI和10ul ROX500或LIZ500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10ul。

(3)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。

(4)在96孔板对应的孔中分别加入各样本DNA，每个样品50pg。

(5)参照以下PCR反应体系加入相应试剂到96孔板，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。按照以下程序进行PCR反应。

a.PCR反应体系

25μl体系的配制

模板(μl)1引物F(μl)0.5引物R(μl)0.5dNTP 10mM(μl)0.5Taq Buffer(μl)2.525mM MgCl₂(μl)2.0Taq酶(μl)5U/μl0.2水(μl)17.8

所述的引物F和引物R为：Geo28-113-F:TGAGGTGAATGGTAGCAGCA和Geo28-113-R:GTATTGCAACAAAAGGTGCG。

b.PCR反应条件

(6)程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却，再将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停。

(7)使用3730xl测序分析仪(美国ABI公司)检测扩增片段。

(8)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用STR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。

(9)利用标记Geo28-113扩增猕猴桃品种，仅‘金桃’猕猴桃扩增得到261bp和265bp的特异条带，同时根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘布鲁诺’、‘楚红’、‘翠玉’、‘东红’、‘丰悦’、‘GT815’、‘贵长’、‘桂海4号’、‘H-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘金魁’、‘金梅’、‘金农’、‘金霞’‘金艳’、‘金圆’、‘金玉’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘QS-5’、‘通山5号’、‘WH-1’、‘厦亚1号’、‘新观2号’或‘西选1号’猕猴桃进行区分。具体扩增结果如表1所示。

表1不同品种猕猴桃名称及Geo28-113引物PCR扩增结果

序列表

<110>中国科学院武汉植物园

<120>用于猕猴桃金桃品种鉴定的分子标记引物及应用

<160>2

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

tgaggtgaat ggtagcagca20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gtattgcaac aaaaggtgcg20